Альфатела для ингибирования проникновения вич



Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич
Альфатела для ингибирования проникновения вич

 


Владельцы патента RU 2562165:

КОМПЛИКС НВ (BE)

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и иммунологии. Раскрыты связывающие gp41 ВИЧ-1 одноцепочечные 3-нитиевые альфа-спиральные суперспирализованные молекулы, обозначенные как "Альфатела". Также описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие такие Альфатела, клетки хозяина, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, а также фармацевтические композиции, содержащие такие Альфатела. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине для лечения, предотвращения и диагностики ВИЧ-инфекции. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 16 ил., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и к лечению ВИЧ-инфекций. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому классу ингибиторов проникновения ВИЧ. Дополнительно настоящее изобретение относится к применению одноцепочечных 3-нитевых альфа-спиральных суперспирализованных молекул, обозначенных "альфатела", для применения в качестве ингибиторов проникновения ВИЧ, воздействующих на субобласти gp41.

Уровень техники

Env комплексы ВИЧ-1, также известные как "комплексы гликопротеинов оболочки" или "gp120/gp41 комплексы" или "шипы ВИЧ", являются основной мишенью для лечения ВИЧ-инфекции. Они обнаружены на поверхности вирионов ВИЧ и клеток, которые сконструированы так, что экспрессируют шипы оболочки. Проникновение ВИЧ в клетку-мишень и слияние "клетка-клетка" опосредованы, главным образом, действием гликопротеиновых комплексов Env, расположенных на поверхности. В общем, считается, что способность блокировать проникновение вируса или клеточное слияние имеет важное значение в лечении ВИЧ-инфекции.

Ингибирование проникновения вируса может быть осуществлено с помощью антивирусных соединений, которые особым образом воздействуют на субобласти gp120, gp41 или на опосредующие слияние рецепторы CD4, CCR5 или CXCR4. Считается, что соединения, которые особым образом воздействуют на gp41, такие как энфувиртид (Фузеон, T-20), проявляют свой антивирусный эффект за счет блокирования ключевой стадии механизма слияния. Эта ключевая стадия хорошо известна как формирование шестиспирального пучка. Шестиспиральные пучки образуются в результате формирования фрагментами gp41-HR1 тримерной параллельной суперспирализованной структуры и прочного связывания HR2 фрагментов с этой суперспиралью. Так как HR1 может связываться с мембраной клетки-мишени через расположенный на N-конце пептид слияния, тогда как HR2 прикреплен к вирусной мембране через расположенный на С-конце трансмембранный фрагмент, то предполагают, что конденсация эктодомена цепи gp41 в компактный шестиспиральный пучок приводит к непосредственному сближению двух мембран, способствует слиянию мембран и, следовательно, проникновению вириона (или точнее его содержимого) в клетку-мишень.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новому классу ингибиторов проникновения ВИЧ, которые, в частности, направлены (нацелены) на субобласти gp41, с целью блокирования образование шестиспирального пучка. Этот новый класс ингибиторов представляет собой одноцепочечный суперспирализованный белковый остов, обозначенный "Альфатело", который сконструирован таким образом, что связывается либо с gp41-HR1 (или с фрагментом, расположенным возле этой последовательности), либо с gp41-HR2 (или с близкорасположенным фрагментом). Настоящее изобретение также относится к бифункциональному Альфателу, которое может одновременно связываться с областями HR1 и HR2 gp41 или близкорасположенными областями. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению таких Альфател для ингибирования опосредованного Env ВИЧ межклеточного слияния, ингибирования проникновения ВИЧ, ингибирования вирусной репликации, лечения ВИЧ-инфекции в клетках млекопитающих и человека, к способу лечения ВИЧ-инфицированных индивидуумов, к способу отбора новых анти-ВИЧ соединений с использованием Альфатела, к способу, известному под названием конкурентный анализ, и к способу вакцинации индивидуума против ВИЧ.

Настоящее изобретение относится к применению одноцепочечного 3-нитевого суперспирализованного остова, обозначенного как "Альфатело", который сконструирован для связывания с субобластями gp41 ВИЧ, такими как HR1, HR2 и прилегающими субобластями в двух различных субобластях gp41 (бифункциональное, биспецифическое связывание). В описании приведены примеры практического получения таких Альфател. Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования ВИЧ-инфекции у индивидуума. Кроме того, предполагается, что Альфатела по настоящему изобретению могут использоваться в качестве средств скрининга для идентификации новых молекул, ингибирующих ВИЧ, как посредством анализа прямого связывания, так и посредством конкурентного анализа. Наконец, в описании приведены способы введения Альфател по изобретению в виде вакцины или лекарственного средства.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Образование шестиспирального пучка, состоящего из полученных из HR1 и HR2 пептидов. Белые цилиндры представляют отображение полученных из gp41-HR1 пептидных фрагментов, образующих тримерную параллельную суперспираль (N-тример); серые цилиндры представляют отображение полученных из gp41-HR2 пептидных фрагментов, связанных с бороздками между парами HR1-спиралей. Обозначения "N" и "C" указывают на N- и C-концевые области спирали, соответственно. Таким образом, HR2 спирали связаны в антипаралельной ориентации относительно HR1 спиралей. Результатом связывания является шестиспиральный пучок, как изображено справа от белой стрелки.

Фиг.2. Образование шестиспирального пучка, состоящего из HR1- и HR2-фрагментов gp41, связанных петлевым участком. Окраска и обозначения такие же, как на Фиг.1. Изогнутые стрелки представляют петлевой участок (дисульфидная петля, шпилечная петля), соединяющий HR1 фрагменты (белые цилиндры) с HR2 фрагментами (серые цилиндры) в шипах Env ВИЧ перед образованием шестиспирального пучка (слева от белой стрелки) и после образования шестиспирального пучка (справа). Взаимная ориентация HR1 и HR2 спиралей в нативных или рецептор-активированных шипах необязательно является такой, как обозначено в левой части; последняя предназначена для иллюстрации того, что HR1 и HR2 фрагменты ковалентно связаны, когда они еще разделены в пространстве.

Фиг.3. Параллельные и антипараллельные Альфатела. В блоке A представлено параллельное Альфатело; в блоке B представлено антипараллельное Альфатело. Параллельные спирали представлены белыми цилиндрами, тогда как спираль, которая является антипараллельной по отношению к другим в блоке В, изображена серым цилиндром. Изогнутые стрелки, соединяющие различные спирали, представляют линкерные фрагменты. Маленькие несоединяющие стрелки представляют N- и C-конечные удлинения Альфатела. Спирали обозначены А, В, С в соответствии с их расположением в Альфателе, которое состоит из одноцепочечной аминокислотной последовательности.

Фиг.4. Связывание Альфатела с HR2 gp41. Окраска и обозначения такие же, как на Фиг.2 и 3. Альфатело показано выделенными жирными линиями цилиндрами. Эта фигура иллюстрирует то, что Альфатело, связанное с HR2 фрагментом gp41, предотвращает его от связывания с N-тримером gp41 и тем самым препятствует образованию шестиспирального пучка. Вероятность того, что два или три HR2 фрагмента в шипе ВИЧ связаны с одинаковым количеством Альфател, не показана на фигуре, но также не исключается.

Фиг.5. Связывание Альфатела с HR1 gp41. Окраска и обозначения такие как на Фиг.4. Эта фигура иллюстрирует то, что Альфатело, связанное с N-тримером gp4, предотвращает его от связывания с HR2 фрагментом gp41 и тем самым препятствует образованию шестиспирального пучка. Вероятность того, что два или три Альфатела связываются с одинаковым количеством бороздок N-тримера ВИЧ шипа, не показана на фигуре, но также не исключается.

Фиг.6. Одновременное связывание Альфатела с HR1 gp41 и HR2. Окраска и обозначения такие, как на Фиг.4. Эта фигура иллюстрирует то, что Альфатело, связанное одновременно с N-тримером gp4 и с HR2 фрагментом gp41, препятствует связыванию последнего с N-тримером и тем самым препятствует образованию шестиспирального пучка. Эта фигура, таким образом, иллюстрирует бифункциональное Альфатело. Вероятность того, что два или три Альфатела связывают по подобному пути ВИЧ шип, не показана на фигуре, но также не исключается.

Фиг.7. Структурные аспекты, связанные с трансплантацией остатков. Блок A демонстрирует изображение N-тримера и HR2 спирали. В этом примере N-тример является N40 последовательностью, опубликованной в Root et al. Science 2001, 291: 884-888. Последовательность HR2 является C38 последовательностью (ibid). Спирали представлены в виде, в котором Z-ось N-тримера направлена в обратном направлении (N-конец впереди) и HR2 спиральная ось HR2 направлена в прямом направлении (N-конец сзади). Таким образом, описанные спирали антипараллельны друг другу. Маленькая стрелка между окружностями предполагает наложение HR2 (C-)спирали сверху на N-спираль, не учитывая несогласование направления. На практике это будет соответствовать наложению позиций c, f, b, e, a, d, g HR2 на позиции d, a, e, b, f, c, g N-спирали, соответственно. Замена N-спирали соответствующей C-спиралью приведет к структуре, сходной с изображенной в блоке B. Тем не менее, прямой и значительной проблемой этого пути рекомбинирования N- и C-пептидных фрагментов является неизбежное нарушение укладки внутреннего слоя. Отличительной особенностью настоящего изобретения является то, что такой проблемы не возникает при применении антипараллельных Альфател. Достаточно того, чтобы перенести позиции HR2, обозначенные d, a и e в блоке A, к позициям, обозначенным b, f и с в блоке B, соответственно, для получения структуры Альфатела с плотно уложенным изолейциновым кором и которая имеет как бороздку связывания HR2, так и спираль, несущую остатки HR2, связывающие бороздку. Блоки С и D иллюстрируют то, как такая структура может фиксировать соответствующие области в вирусной молекуле gp41; на блоках С и D представлены продольный и перпендикулярный по отношению к осям спиралей виды, соответственно (все спирали идеализированы, и суперспирализацией пренебрегли). Двойные стрелки обозначают не создающие связь взаимодействия (связывание). Длинная стрелка, соединяющая N-спираль с HR2 спиралью вируса, представляет шпилеобразную петлю. Блок D явно иллюстрирует то, что спираль B в Альфателе (с трансплантированными HR2 остатками) и пара спиралей вирусного N-тримера (формирующего сайт связывания) направлены антипараллельно. Подобным образом, образующие бороздку спирали A и С Альфатела и вирусная HR2 спираль также антипараллельны. Эта фигура, таким образом, предоставляет логичное обоснование, которое лежит в основе конструкции биспецифического Альфатела с возможностью одновременно воздействовать на N-тример и HR2 фрагмент шипов Env ВИЧ-1.

Фиг.8. Выравнивание последовательности Альфатела с HR1 и HR2 последовательностями. A представляет собой выравнивание HR1 последовательности, обозначенной "N-40" (остатки между положениями 543 и 582 HXB2 gp160), с последовательностью отобранного Альфатела, обозначенного scAB013" (только 1 его спираль), в трех различных рамках. Гептадные a/d-позиции окрашены серым. B представляет собой выравнивание HR2 последовательности, обозначенной "C38" (остатки между положениями 625 и 662 HXB2 gp160), с последовательностью выбранного Альфатела scAB013 (1 спираль) в двух различных рамках, таких, что позиции a, d и e C38 сопоставляются с позициями f, b и c Альфатела, соответственно. Таким образом, вступающие во взаимодействие остатки HR2 (С38) (окрашенные серым), при трансплантации в Альфатело будут повернуты от центра Альфатела.

Фиг.9. Предварительный отбор аминокислот бороздки. A представляет отбор остатков, которые должны быть трансплантированы в g- и c-позиции A-спирали Альфатела (окрашенные серым) в трех диапазонах, которые возможны для выравнивания Альфатело/HR1. B представляет собой аминокислотную последовательность немутированной B-спирали Альфатела, дополненной соответствующими фланкирующими линкерами L1 и L2. C представляет собой отбор остатков, которые должны быть трансплантированы в позиции e и b C-спирали Альфатела (окрашенные серым) в трех возможных гептадных диапазонах.

Фиг.10. Структурно оптимизированные последовательности бороздок. A представляет собой аминокислотную последовательность структурно оптимизированной A-спирали в трех диапазонах, которые возможны для выравнивания Альфатело/HR1. B представляет собой аминокислотную последовательность немутированной B-спирали Альфатела, дополненной соответствующими фланкирующими линкерами L1 и L2. C представляет собой аминокислотную последовательность структурно оптимизированной C-спирали в трех диапазонах выравнивания. Остатки, появляющиеся в первоначальном Альфателе scAB013, не подчеркнуты. Подчеркнутые одной чертой остатки являются трансплантированными из HR1 аминокислотами. Подчеркнутые двумя чертами остатки являются мутациями, выбранными на основании структурных расчетов.

Фиг.11. Предварительная трансплантация остатков HR2. B представляет собой аминокислотную последовательность B-спирали Альфатела c трансплантированными остатками HR2 (окрашенные серым) в двух возможных диапазонах для выравнивания с пептидом C38 HR2. Обозначение "B" служит только для того, чтобы продемонстрировать, что трансплантация должна быть выполнена в B-спирали Альфатела.

Фиг.12. Структурно оптимизированные последовательности B-спирали. A представляет собой аминокислотную последовательность немутированной A-спирали Альфатела, дополненной соответствующим фланкирующим линкером L1. B представляет собой структурно оптимизированную B-спираль в двух диапазонах, которые возможны для выравнивания Альфатело/HR2. C представляет собой аминокислотную последовательность немутированной C-спирали Альфатела с предшествующим соответствующим фланкирующим линкером L2. Остатки, появляющиеся в первоначальном Альфателе scAB013, не подчеркнуты. Подчеркнутые одной чертой остатки являются трансплантированными из HR2 аминокислотами. Подчеркнутые двумя чертами остатки являются мутациями, выбранными на основании структурных расчетов.

Фиг.13. Итоговые структуры Альфатела с подобными N-тримеру связывающими бороздками. A представляет собой 3 аминокислотные последовательности, которые должны быть включены в качестве A-спирали в Альфатело; L1 представляет последовательность линкера 1; B представляет собой аминокислотную последовательность, которая должна быть включена в состав Альфатела в качестве B-спирали, независимо от последовательностей A- и C-спирали; L2 представляет последовательность линкера 2; C представляет собой 3 аминокислотные последовательности, которые должны быть включены в качестве C-спирали в состав Альфатела. Остатки подчеркнуты в соответствии с Фиг.10. Последовательности должны быть соединены в Альфателе в порядке Ai-L1-B-L2-Ci, где i относится к любому из показателей, стоящих перед последовательностями A и C. Таким образом, эти фигуры представляют три различные структуры, которые сконструированы для воздействия на различные субобласти HR2 в gp41 ВИЧ-1.

Фиг.14. Итоговые структуры Альфатела с подобными HR2 поверхностными остатками. A представляет собой аминокислотную последовательность, которая должна быть включена в состав Альфатела в качестве A-спирали независимо от последовательности B-спирали; L1 является последовательностью линкера 1; B представляет собой 2 аминокислотные последовательности, которые должны быть включены в состав Альфатела в качестве B-спирали; L2 является последовательностью линкера 2; C представляет собой аминокислотную последовательность, которая должна быть включена в состав Альфатела в качестве C-спирали, независимо от последовательности B-спирали. Остатки подчеркнуты в соответствии с описанием к Фиг.12. Последовательности должны быть соединены в Альфателе в порядке A-L1-Bi-L2-C, где i относится к любому из показателей, стоящих перед последовательностями B. Таким образом, эти фигуры представляют две различные структуры, которые сконструированы для взаимодействия с различными субобластями N-тримера gp41 ВИЧ-1.

Фиг.15. CD термосканы scAB013_N3 в различных концентрациях GuHCl. Альфатело растворили в 20 мМ PBS, 150 мМ NaCl, pH 7,2 и в указанных концентрациях GuHCl: ромбы, 2 M; квадраты, 4 M; круги, 6 M денатурирующего агента. Концентрация Альфатела составляла приблизительно 12 мкМ. Средняя остаточная эллиптичность ([Theta]) была измерена при длине волны 222 нМ. Закрашенные обозначения соответствуют анализам повышения (нагревания) и обозначения соответствуют анализам понижения (охлаждения).

Фиг.16. Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) scAB013_N3, титруемого производным C36 bL4_C36. В камеру было помещено 2,46 мкМ scAB013_N3 в 20 мМ PBS, 150 мМ NaCl, pH 7,2, и инъекционный шприц был наполнен 50 мкМ bL4_C36 в таком же буфере. На Фиг.16A показана необработанная термограмма после корректировки по базовой линии. Пики были проинтегрированы, скорректированы по шумам и эффекту разбавления вычитанием среднего последних четырех пиков и после этого были проинтегрированы еще раз для получения совокупного изменения энтальпии (ΔН) Фиг.16B, на которой последнее отображено как функция молярного отношения bL4_C36 к scAB013_N3. Обработка кривых с использованием равновесной модели со стехиометрией связывания 1:1 привела в результате к термодинамическим параметрам ΔH=-30 кДж/моль и Kd=150 нМ.

Подробное описание изобретения

Комплекс гликопротеинов оболочки вируса иммунодефицита типа 1 (ВИЧ-1) человека (ВИЧ-1 Env, шип) состоит из тримера гетеродимеров гликопротеина 120 (gp120) и гликопротеина 41 (gp41). Такие шипы обнаруживаются в состоянии, предшествующем слиянию. При прикреплении к клетке-мишени, опосредованном клеточными рецепторами CD4 и корецепторами хемокинов (CXCR4 или CCR5), происходят некоторые конформационные изменения, приводя в конечном счете, к состоянию после слияния и сопутствующему слиянию мембран. В промежутке между состояниями до и после слияния и в результате частичных конформационных изменений, шипы принимают состояние, известное как пре-шпиличное состояние или промежуточный продукт слияния. Несмотря на то, что о структурной природе пре-шпиличного состояния или состояний известно не много, последнее считают важным объектом воздействия, так как некоторые субобласти, которые скрыты в состояниях до и после слияния, во время этого состояния становятся доступными для ингибиторных молекул.

Субобласти внутри ВИЧ-1 Env шипов, которые привлекли особое внимание, представляют собой фрагменты, известные как гептадные повторы 1 (HR1) и гептадные повторы 2 (HR2). При переходе от состояния до слияния в состояние после слияния, HR1 фрагменты образуют тримерную (3-нитевую) параллельную суперспирализованную структуру, также известную как "N-тример". Эта суперспирализованная структура состоит из трех прочно взаимодействующих параллельных альфа-спиралей. В продольном направлении этих альфа-спиралей, между каждой спиральной парой имеется неглубокая бороздка. Таким образом, на каждый N-тример приходится три бороздки. Так как аминокислотные последовательности HR1 в каждом шипе идентичны, N-тример по-видимому по существу структурно симметричен, несмотря на то, что во время динамического процесса конформационных изменений из состояния до в состояние после слияния эта структурная симметрия, вероятно, не будет сохранена все время.

Как известно из экспериментально определенной трехмерной (3-D) структуры, представляющей состояние после слияния, каждая из трех бороздок в N-тримере по меньшей мере обладает способностью связывать фрагмент. Таким образом, на N-тример приходится три связывающие HR2 бороздки (участка, поверхности). Эти 3-D структуры также демонстрируют, что HR2 фрагменты связывают в альфа-спиральной конформации и эти альфа-спирали связаны в антипараллельной ориентации по отношению к HR1 спиралям N-тримера. HR1 спирали образуют внутреннюю тримерную параллельную суперспираль, и HR2 спирали образуют внешние спирали.

Комплекс между пептидами, полученными из HR1 и HR2, обычно называют "шестиспиральным клубком" (см. Фиг.1). Последний может быть образован простым смешением пептидов, полученных из HR1 и HR2, также называемых N- и C-пептиды, соответственно.

Тем не менее, в шипах ВИЧ HR1- и HR2-фрагменты не присутствуют в виде свободных пептидов. В шипах они образуют субобласти в непрерывной аминокислотной цепи, известной под названием гликопротеин 41 (gp41). Последняя была поделена на функциональные области следующим образом (см., например, Noah et al, Biochemistry 2008, 47:6782-6792): (i) пептид слияния (FP, остатки от 512 до 527), проксимальная к пептиду слияния область (FP-PR, остатки от 528 до 540), N-пептидная область или гептадные повторы 1 (HR1, остатки от 541 до 581), дисульфидная петля или образующая шпильку петля или область петли (LR, остатки от 582 до 627), область C-пептида или гептадные повторы 2 (HR2, остатки от 628 до 665), проксимальная к мембране наружная область (MPER, остатки от 666 до 683), трансмембранная область (TM, остатки от 684 до 705) и внутриклеточная или цитоплазматическая область (CP, остатки от 706 до 856). Нумерация остатков в настоящем описании основана на gp160 ВИЧ-1 HXB2. В различных публикациях границы указанных функциональных областей могут отличаться на около 5 остатков. Внеклеточный домен (эктодомен) gp41 соответствует остаткам от 512 до 683, Таким образом, HR1 и HR2 соответственно локализованы в первой (N-концевая) и второй (C-концевая) половинах эктодомена gp41, и они разделены областью петли.

В пределах эктодомена gp41 фрагменты HR1 и HR2 могут образовывать шестиспиральный пучок, который имеет большое структурное сходство с пептидными шестиспиральными пучками. Следовательно, шестиспиральный пучок состоит из тримера гетеродимеров HR1/HR2, также известных как тример шпилек, и в котором каждый HR1 связан с HR2 областью петли (см. Фиг.2). Таким образом, область петли выполняет двойственную роль: линкера и разделителя.

В данной области неизвестно как конкретно HR1 и HR2 остаются разделенными в нативных пре-слитых шипах. Тем не менее, известно, что шип существует в виде тримера гетеродимеров gp120/gp41 (необходимо отличать их от гетеродимеров HR1/HR2). Имеются лишь скудные сведения, в соответствии с которыми остатки из gp120 и gp41 образуют поверхность раздела между двумя типами субъединиц в состоянии до слияния, и нет никаких прямых структурных доказательств. Тем не менее, увеличивается количество фактов, в соответствии с которыми различные субобласти из gp41 вовлечены во взаимодействие с gp120, и эти субобласти связываются более или менее независимо друг от друга (смотрите, например, Kim et al. J Mol Biol 2008, 376:786-797). Следовательно, возможно, что gp120 играет роль пространственного разделителя для фрагментов gp41 в состоянии до слияния. Известно также, что gp41 встраивается в клетку-мишень посредством своего пептида слияния, который соединен с HR1 через FP-PR. Последнее приводит к промежуточному состоянию перед слиянием, в котором необходимо, чтобы HR1 был расположен дистально (отдельно в пространстве) от HR2, который сам по себе прикреплен к вирусной мембране через области MPER и TM. Все конформационные изменения вызывает CD4 и/или корецепторное связывание с gp120 (но не с gp41). Следовательно, предполагают, что существует "удобный момент" во время механизма слияния, во время которого противоположно уложенные фрагменты HR1 и HR2 доступны для воздействия и последующего ингибирования процесса слияния.

Общепринято, что функциональная роль фрагментов HR1 и HR2 в gp41 заключается в запуске слияния вирусной мембраны и мембраны клеток мишеней через образование шестиспирального пучка. Таким образом, ингибирование образования шестиспирального пучка считают обоснованным подходом для предотвращения слияния мембран и вирусной инфекции.

Особый интерес для настоящего изобретения представляют некоторые пептиды, которые получены непосредственно из HR1 и HR2 последовательностей gp41. Например, предполагается, что полученные из HR2 пептиды, такие как C34 (остатки 628-661), непосредственно воздействуют на N-тример, где они образуют стерическое препятствие для HR2, таким образом, предотвращая образование шестиспирального пучка и слияние мембран. И наоборот, одним из предложенных механизмов действия для N-пептидов, например N36 (остатки 546-581), является то, что они образуют тримерные комплексы в растворе, которые способны удерживать HR2, когда он становится доступным. Несмотря на то, что последняя возможность остается предметом споров, комплексы тем не менее стимулировали образование пятиспирального пучка (см., например, Root et at. Science 2001, 291:884-888 и заявку на патент США 2006/0014139 A1). Кроме того, другие исследователи сконструировали стабилизированные N-тримерные структуры (например, NCCG-gp41, N35CCG-N13, IQ-N23, см. источники в Gustchina et al. J Virol 2008, 82:10032-10041). Было продемонстрировано, что все они проявляли сильное антивирусное действие, с IC50 в основном в низконаномолярных пределах. Таким образом, была продемонстрирована способность воздействовать на области gp41 ВИЧ-1 как для HR1-, так и для HR2-субфрагмента.

Ранее с различным успехом были разработаны различные молекулы, ингибирующие проникновение ВИЧ (ингибиторы проникновения или слияния). Они могут быть упрощенно разделены на антитела, неиммуноглобулиновые белки, пептиды и малые молекулы. Неограничивающими примерами моноклональных антител являются D5, 2F5 и 4E10. Неограничивающими примерами неиммуноглобулиновых белков являются растворимые CD4 и пятичленная спираль. Неограничивающими примерами пептидов являются T20, T-1249 и N36. Неограничивающими примерами малых молекул являются BMS-806, Maraviroc и AMD070. Единственным ингибитором проникновения, одобренным для клинического использования, является энфувиртид (Fuzeon, T20). Тем не менее, проблемами последнего лекарственного средства являются безопасность, переносимость, реакции в месте инъекции, соблюдение пациентами инструкций по приему препарата и развитие резистентности. Вследствие этого, существует постоянная необходимость в лекарственных средствах против ВИЧ, включая ингибиторы проникновения ВИЧ. Существует также постоянная необходимость в новых лекарственных средствах и лекарственных образцах с улучшенными характеристиками по сравнению с существующими лекарственными средствами и лекарственными образцами. Более конкретно, существует необходимость в пептидных или белковых лекарственных средствах, которые препятствуют проникновению ВИЧ и межклеточному слиянию с повышенной активностью (противовирусная активность, противовирусная эффективность, более низкие дозировки, более низкие значения EC50). Также существует необходимость в белковых лекарственных средствах, молекулярный размер которых меньше, чем, например, у антител или пятичленной спирали; вероятно, такие лекарственные средства могут быть произведены с меньшими затратами, для них требуется меньшее количество исходного материала (при постоянной молярной EC50), возможно могут быть введены местно (т.е., в виде крема, на пластыре) и, вероятно, более пригодны для воздействия на частично окклюдированные области связывания в шипах (т.е., они, вероятно, менее подвержены эффектам стерических препятствий и имеют более высокий коэффициент диффузии). Дополнительно, также существует необходимость в устойчивых лекарственных средствах с длительным сроком хранения, высокой растворимостью и устойчивостью к действию протеаз. В наибольшей степени существует острая необходимость в новых лекарственных средствах с пониженной способностью вызывать спасательные мутации (мутации резистентности).

Все варианты осуществления настоящего изобретения относятся к одноцепочечным суперспирализованным молекулам, которые в настоящем описании обобщенно обозначены "Альфатела". Подобные одноцепочечные суперспирали были описаны в Desmet et al., EP 081720179 и Desmet et al., US 61/120642. Вкратце, Альфатело в настоящем описании будет означать одноцепочечную суперспираль, имеющую одиночную смежную аминокислотную цепь с формулой HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3, по желанию дополненную N- и C-конечными удлинениями с итоговой формулой N-HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3-C, в которой (a) каждый из HRS1, HRS2 и HRS3 является независимой последовательностью гептадных повторов (HRS), состоящей из от 2 до 7 последовательных областей гептадных повторов (HR), последовательность которых может быть обозначена как a-b-c-d-e- f-g, по меньшей мере 50% всех гептадных позиций a и d заняты изолейциновыми остатками, и HRS1, HRS2 и HRS3 вместе составляют 3-нитевую альфа-спиральную суперспирализованную структуру; (b) каждый из L1 и L2 независимо является линкерным фрагментом, ковалентно соединяющим HRS1 с HRS2 и HRS2 с HRS3, соответственно, начинающимся и заканчивающимся пролином или глицином и состоящим из от 3 до 30 аминокислотных остатков, из которых по меньшей мере 50% выбраны из группы пролин, глицин, серин; и (c) N и С независимо являются необязательным удлинением, ковалентно присоединенным к N- и C-концу HRS1 и HRS3, соответственно, при этом эта связь должна характеризоваться наличием нарушающих спираль пролина или глицина.

Как указано выше, по меньшей мере 50% всех гептадных позиций a и d заняты изолейциновыми остатками. Оставшиеся позиции a и d могут быть любой из 20 аминокислот природного происхождения или аминокислотами неприродного происхождения.

Кроме того, аминокислоты в каждом из L1 и/или L2, которые не являются пролином, глицином или серином могут быть любой из 20 аминокислот природного происхождения или аминокислотами неприродного происхождения.

Аминокислоты в позициях b, c, e, f и g могут также быть любой из 20 аминокислот природного происхождения или аминокислотами неприродного происхождения.

Выражение "аминокислота природного происхождения" относится к следующим аминокислотам: аланин, аспарагиновая кислота, аспарагин, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, пролин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан и тирозин.

Выражение "аминокислоты неприродного происхождения" в используемом в настоящем описании значении, относится к аминокислотам, имеющим боковую цепь, которая не встречается в L-аминокислотах природного происхождения. Примеры неприродных аминокислот и производных включают в себя, но не ограничены ими, агматин, (S)-2-амино-4-((2-амино)пиримидинил)бутановую кислоту, 4-аминобутановую кислоту, 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановую кислоту, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановую кислоту, 6-аминогексановую кислоту, альфа-аминометилпропановую кислоту, бензофенон, т-бутинглицин, цитруллин, циклогексилаланин, дезаминотирозин, L-(4-гуанидино)фенилаланин, гомоаргинин, гомоцистеин, гомосерин, гомолизин, н-формилтриптофан, норлейцин, норвалин, фенилглицин, (S)-4-пиперидил-N-амидино)глицин, орнитин, парабензоил-L-фенилаланин, саркозин, статин, 2-тиенилаланин и/или D-изомеры аминокислот природного или неприродного происхождения.

Альфатела имеют относительно маленький размер (приблизительно от 10 до 20 кДа). Таким образом, это свойство согласуется с необходимостью в терапевтических белковых молекулах с размером, который меньше, чем размер антитела или пятичленной спирали. Альфатела также являются чрезвычайно термоустойчивыми и относительно нечувствительными к изменениям pH и протеолитическому разрушению. Эти свойства формируют прочную основу для совершенствования сконструированных Альфател с сохранением требуемых физико-химических свойств и с достигнутыми терапевтическими функциями. Следовательно, Альфатела согласуются с необходимостью в терапевтических молекулах, которые имеют длительный срок хранения. Альфатела также высокорастворимы, что согласуется с необходимостью в терапевтических молекулах, которые можно без труда испытывать in vitro. Наиболее важен тот факт, что Альфатела хорошо конструируемы (взаимозаменяемы, подвергаются мутациям), что согласуется с необходимостью в создании новых терапевтических молекул с высоким сродством и специфичностью к выбранным молекулам-мишеням.

В целом Альфатела хорошо выполняют роль молекулы-остова для распознавания мишени, так как они относительно нечувствительны к множественным одновременным аминокислотным заменам. Например, структурная целостность Альфател в целом не значительно изменяется, когда все аминокислотные остатки отдельной бороздки одновременно мутированы. Схожим образом, структурная целостность не изменяется значительно, когда все экспонированные на поверхность аминокислотные остатки отдельной альфа-спирали одновременно мутированы.

Вследствие этого, заявители рассмотрели вероятность введения многочисленных замен в первоначальное Альфатело с целью предоставления Альфатела, которое связывает внеклеточный домен gp41 ВИЧ-1, при этом указанный внеклеточный домен определяется как аминокислотные остатки от 1 до 683 SEQ ID NO: 1.

Следовательно, настоящее изобретение относится к Альфателу, которое связывает HR1 фрагмент gp41 ВИЧ-1, при этом указанный HR1 фрагмент определяется как аминокислотные остатки от 546 до 581 SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также относится к Альфателу, которое связывает HR2 фрагмент gp41 ВИЧ-1, при этом указанный HR2 фрагмент определяется как аминокислотные остатки от 628 до 661 SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также относится к Альфателу, которое связывает одновременно HR1 и HR2 фрагменты из gp41 ВИЧ-1, при этом указанные HR1 и HR2 фрагменты определяются как аминокислотные остатки от 546 до 581 и от 628 до 661 SEQ ID NO: 1, соответственно.

Дополнительно, настоящее изобретение также относится к Альфателам, проявляющим участок связывания субобласти gp41 рядом с HR1, т.е., пептидом слияния, областью, проксимальной пептиду слияния, и первой половиной области петли. Аналогичным образом предоставление Альфател, проявляющих участки связывания с субобластями gp41 рядом с HR2, т.е., второй половиной области петли и проксимальной к мембране наружной областью, включено в рамки изобретения, как и предоставление Альфател, проявляющих как участки связывания субобласти gp41 рядом с HR1, так и рядом с HR2, соответственно, бифункциональных Альфател.

Альфатела могут существовать как в виде параллельных, так и в виде антипараллельных одноцепочечных суперспиралей (Фиг.3). Как параллельные, так и антипараллельные Альфатела пригодны для воздействия на субобласти gp41. Предполагают, что непосредственный функциональный эффект связывания таких субобластей является блокирующим (например, предотвращение или ингибирование) образование шестиспирального пучка. Такое блокирование посредством связывания с субобластями gp41 вблизи HR2 проиллюстрировано на Фиг.4. Такое блокирование посредством связывания с субобластями gp41 вблизи HR1 проиллюстрировано на Фиг.5. Такое блокирование посредством связывания одновременно с субобластями gp41 вблизи HR1 и HR2 проиллюстрировано на Фиг.6.

Принимая во внимание то, что HR2 фрагменты в шестиспиральном пучке антипараллельны по отношению к спирали центрального N-тримера, заявители предположили, что антипараллельные Альфатела могут быть лучше, чем параллельные Альфатела, приспособлены к одновременному связыванию с субобластями gp41 вблизи HR1 и HR2, хотя параллельные Альфатела также могут обеспечивать лучшее бифункциональное связывание.

Одним из преимуществ бифункционального связывания может быть большая связывающая способность или более сильный антивирусный эффект. Другим преимуществом бифункционального связывания может быть более низкая склонность к появлению мутаций резистентности. Вследствие этого, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения могут согласоваться с необходимостью в новых антивирусных лекарственных средствах, которые менее подвержены вирусной резистентности.

В предпочтительном варианте осуществления предоставлены Альфатела, для которых связывание с gp41 ВИЧ-1 характеризуется константой диссоциации (Kd) или половиной максимальной эффективной концентрации (EC50) в субмикромолярных пределах, предпочтительно константа диссоциации (Kd) или половина максимальной эффективной концентрации (EC50) менее 1,0 микромолярной, или в субнаномолярных пределах, предпочтительно константа диссоциации (Kd) или половина максимальной эффективной концентрации (EC50) менее 1,0 наномолярной, или в субпикомолярных пределах, предпочтительно константа диссоциации (Kd) или половина максимальной эффективной концентрации (EC50) менее 1,0 пикомолярной. Эти технологии включают в себя, но не ограничиваются ими, RIA (радиоиммуноанализы), ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), "сандвичевые" иммуноанализы, радиоиммуноанализы, гельдиффузионные реакции преципитации, быстрые иммунодиффузионные анализы, Вестерн блоттинг, реакции преципитации, реакции агглютинации (например, реакции гелевой агглютинации, реакции гемагглютинации, и т.д.), реакции связывания комплемента, иммунофлуоресцентные анализы, анализы с протеином A и анализы с иммуноэлектрофорезом и т.д.

В используемом в настоящем описании значении термин "Вестерн блоттинг" относится к анализу белка(ов) (или полипептидов), иммобилизованных на носителе, таком как нитроцеллюлоза или мембрана. Белки пропускают через акриламидные гели для разделения белков, после чего следует перенос белка из геля на твердый носитель, такой как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. После этого иммобилизованные белки подвергаются воздействию антител с реактивностью к представляющему интерес антигену. Связывание Альфател может быть детектировано различными способами, включая использование радиоактивномеченных антител, антител, связанных с ферментом и т.д.

Специфичность связывания Альфател настоящего изобретения может быть определена анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). В данной области известны такие технологии и анализы. Связывающая способность Альфател может, например, быть определена анализом Скэтчарда, Friquet анализом, с помощью поверхностного плазмонного резонанса или изотермического титрования. Предпочтительно идентифицировать Альфатела, имеющие высокую степень специфичности и высокую связывающую способность по отношению к целевому антигену env ВИЧ.

В другом предпочтительном варианте осуществления предоставлены Альфатела, для которых связывание с gp41 ВИЧ-ингибирует опосредованное Env ВИЧ межклеточное слияние, характеризуемые половиной максимальной ингибирующей концентрации (IC50) в субмикромолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0 микромолярной, или в субнаномолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0 наномолярной, или в субпикомолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0 пикомолярной, при этом указанное ингибирование опосредованного Env ВИЧ межклеточного слияния может быть измерено анализом межклеточного слияния.

В другом предпочтительном варианте осуществления предоставлены Альфатела, для которых связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует проникновение вируса ВИЧ, характеризуемые половиной максимальной ингибирующей концентрации (IC50) в субмикромолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0-микромолярной, или в субнаномолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC 50) менее 1,0 наномолярной, или в субпикомолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0 пикомолярной, при этом указанное ингибирование проникновения вируса ВИЧ может быть измерено анализом одноцикличной антивирусной инфекции.

В другом предпочтительном варианте осуществления предоставлены Альфатела, для которых связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует вирусную репликацию ВИЧ, характеризуемые половиной максимальной ингибирующей концентрации (IC50) в субмикромолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0 микромолярной, или в субнаномолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0 наномолярной, или в субпикомолярных пределах, предпочтительно половина максимальной ингибирующей концентрации (IC50) менее 1,0 пикомолярной, при этом указанное ингибирование вирусной репликации ВИЧ может быть измерено анализом вирусной репликации.

В другом предпочтительном варианте осуществления предоставлены Альфатела, для которых связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует ВИЧ-инфекцию клеток млекопитающих in vitro или in vivo.

В другом предпочтительном варианте осуществления предоставлены Альфатела, для которых связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует ВИЧ-инфекцию человеческих клеток in vitro или in vivo.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления предоставлен способ ингибирования ВИЧ-инфекции у индивидуума, содержащий введение индивидууму связывающего gp41 ВИЧ-1 Альфатела, соответствующего изобретению.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления, связывающая gp4 ВИЧ-1 одноцепочечная суперспираль, соответствующая изобретению, используется для лечения ВИЧ-инфекции.

В используемом в настоящем описании значении специалист в соответствующей области может в целом понимать термин "лечение" как относящийся в целом к подходу для достижения благотворных или требуемых результатов. Благотворные или требуемые результаты могут включать в себя, но не ограничиваются ими, предотвращение или профилактику, облегчение или улучшение одного или более симптомов или параметров, сокращение продолжительности заболевания, стабилизированное (т.е. без ухудшения) состояние заболевания, предотвращение распространения заболевания, задержку или замедление развития заболевания, улучшение или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию (как полная, так и частичная, как явная, так и невыявляемая). "Лечение" может также означать повышение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью без лечения. В используемом в настоящем описании значении специалист в соответствующей области в целом может понимать выражение "терапевтически эффективное количество" как количество, достаточное для осуществления лечения при введении объекту, нуждающемуся в таком лечении. В вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество может включать в себя, но не ограничено им, количество, которое устраняет или уменьшает эффекты заболевания у объекта.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей связывающие gp41 ВИЧ-1 одноцепочечные суперспирали, как описано выше, соответствующие изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.

Специалист в соответствующей области признает, что в настоящем описании рассмотрены модификации Альфател по изобретению. Альфатела по изобретению могут быть модифицированы конъюгированием, маркированием или мечением посредством способов, известных в данной области, любым известным диагностическим или терапевтическим агентом, включая, но не ограничиваясь ими, цитотоксические агенты (например, иммунотоксиновые конъюгаты), пролекарства, лекарственные средства (например, фармацевтически активные вещества) или другие эффекторные молекулы, которые эффективны при лечении заболевания, а также известные репортерные молекулы. Такие модифицированные Альфатела включают в себя, но не ограничены ими, (a) меченые (например, радиоактивномеченные, меченные ферментом, флуорохромом или хемилюминесцентным соединением) Альфатела по настоящему изобретению, в диагностических целях с использованием известных технологий визуализации и (b) иммунотоксиновые конъюгаты Альфател по изобретению, где Альфатела по изобретению конъюгированы с известными цитотоксическими, радиоактивными, радиоактивномеченными, пролекарственными или лекарственными молекулами (например, радиоиммунотерапия). Специалист в соответствующей области признает, что термин "цитотоксический агент", "цитотоксины " или "цитотоксический" в используемом в настоящем описании значении обычно относится к веществу, которое замедляет или ограничивает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток и включает в себя, но не ограничен ими, радиоактивные изотопы, химиотерапевтические агенты и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или белковые токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или вариации. Также специалист в соответствующей области признает, что термин "пролекарство" в используемом в этой заявке значении обычно относится к предшествующей или производной форме фармацевтически активного вещества, которое менее цитотоксично по отношению к клеткам-мишеням по сравнению с фармацевтически активным веществом и может быть активировано или преобразовано в одно или более фармацевтически активных веществ.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей модификации связывающей одноцепочечной суперспирали gp4 ВИЧ-1, соответствующей изобретению, как описано выше, и фармацевтически допустимый носитель.

Специалист в соответствующей области признает, что композиции по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, Альфатела, могут быть составлены в фармацевтические композиции для введения стандартным способом введения таких веществ, с использованием стандартных приемов и способов составления фармацевтических рецептур. Также специалист в соответствующей области признает, что такие фармацевтические композиции могут включать в себя один или более эксципиентов, носителей, стабилизаторов или другие фармацевтически неактивные соединения, такие как, но не ограничиваясь ими, смягчающие и эмульгирующие агенты, буферизующие вещества и тому подобные. Фармацевтически приемлемые соли также могут быть включены в настоящее описание. Фармацевтические рецептуры по изобретению могут также содержать или быть смешанными с другими терапевтическими агентами.

Альфатела по изобретению могут быть введены парентерально, включая, но не ограничиваясь этим, внутримышечную, внутривенную, подкожную или внутрибрюшинную инъекцию или вливание и посредством трансдермального или трансмукозального введения. Альтернативно, введение Альфател по изобретению может быть местным, включая, но не ограничиваясь ими, анальное или вагинальное введение. Терапевтически эффективные дозировки могут изменяться в соответствии с весом тела, и время и продолжительность введения будут определены протоколами соответствующих клинических исследований.

Основное предназначение Альфател против gp41 заключается в связывании с субобластью gp41 и блокировании посредством этого образования шестиспирального пучка. Существуют различные способы получения таких Альфател. Наиболее известным является использование комбинаторных библиотек (например, библиотека с отобранными рандомизированными позициями аминокислот) и пригодной технологии визуализации (например, фаговый дисплей) в комбинации с пригодным способом отбора (например, биопэннинг). Использование комбинаторных библиотек было рассмотрено заявителями настоящего изобретения с целью создания связывающих gp41 Альфател и для дополнительного достраивания (оптимизации) первоначальных связующих.

Дополнительные варианты осуществления изобретения направлены на применение D-изомера gp41 или его фрагмента (противоположного природной L-изоформе) для скрининга или биопэннинга библиотеки природных L-изомерных Альфател. Связывающее D-изомерный gp41 L-изомерное Альфатело, выявленное в таком скрининге или биопэннинге, может в дальнейшем быть использовано в для конструирования D-изомерного Альфатела с такой же последовательностью, направленного против природного L-изомерного gp41. D-изомерные Альфатела имеют преимущество in vivo, заключающееся в их устойчивости к протеолитическому расщеплению и, возможно, к изменению фармакокинетики.

В примерах 1 и 2, представлены два альтернативных тщательно проработанных способа. Эти способы известны в данной области как конструирование с помощью трансплантации. Они основываются на структурных сходствах между Альфателом и N-тримером gp41. Действительно, с учетом структуры, Альфатело также по существу является тримерной параллельной суперспиралью, несмотря на то, что существуют значительные различия между двумя типами суперспиралей: (i) Альфатело является одноцепочечной молекулой белка, тогда как N-тример является комплексом трех индивидуальных, нековалентно ассоциированных фрагментов HR1; (ii) внутренний слой Альфатела в основном состоит из изолейцинов, тогда как внутренний слой N-тримера относительно неоднороден (4 изолейцина в 11 гептадных a/d-позициях во фрагменте от 543 до 582 штамма HXB2; остальные a/d-позиции заняты лейцином, глутамином и треонином); (iii) Альфатело может существовать в виде параллельной или антипараллельной суперспирали, тогда как N-тример всегда является параллельным; (iv) Альфатело не состоит или получено из природной аминокислотной последовательности, а является неприродной последовательностью, которая оптимизирована для поддержания устойчивой укладки. При этом параллельно или антипараллельно по отношению к Альфателу расположена по меньшей мере одна пара параллельных спиралей, которая теоретически подходила для изменения конструкции с целью имитации N-тримерной бороздки gp41. Одним из таких способов изменения конструкции в данной области является трансплантация. Несмотря на то, трансплантация является нетривиальным подходом из-за множества одновременно "трансплантированных" аминокислотных боковых цепей, она может создавать быстрый и удобный путь для получения лидерной структуры, которая по желанию может быть дополнительно оптимизирована последующими этапами оптимизации.

Вследствие этого, заявители рассмотрели изменение конструкции бороздки Альфатела для имитирования бороздки N-тримера посредством трансплантации поверхностных остатков N-тримера/HR2 в Альфатело. Подобным образом, заявители также рассмотрели изменение конструкции одиночной спирали Альфатела для имитирования поверхности HR2, которая связывается с N-тримером в комплексе шестиспирального пучка. Заявители дополнительно рассмотрели изменение конструкции обеих бороздок между двумя спиралями в Альфателе и поверхности третьей спирали этого же Альфатела, для того, чтобы оно одновременно имело подобную N-тримеру бороздку связывания и подобную HR2 спиральную поверхность. Специалист в данной области признает, что такое изменение конструкции трансплантацией совсем не является тривиальным, так как трансплантированные боковые цепи присоединены к ненативному (невирусному, чужеродному) белковому остову. Там они "прибывают" в окружение других боковых цепей, которые отличаются от нативного окружения, что может быть источником нарушающих конформацию эффектов и потери сродства. Дополнительно, в случае бифункциональной структуры Альфатела, существует повышенная вероятность самоассоциации.

При условии удачного конструирования имитирующей N-тример связывающей бороздки в Альфателе, последнее может также быть использовано в применениях, отличных от связывания gp41. Такой имитатор действительно может быть использован для поиска (скрининга) не имеющих отношения к Альфателу дополнительных молекул, которые могут связывать Альфатело, имитирующее N-тример, и давать перекрестную реакцию с HR2 фрагментами gp41 в вирусных шипах. Таким образом, заявители предоставили способ идентификации химического соединения или молекулы, которая связывает имитирующее N-тример gp41 Альфатело и препятствует ВИЧ-инфекции, этот способ содержит следующее: (i) подвергают представляющее интерес химическое соединение или молекулу воздействию указанного имитирующего N-тример Альфатела, (ii) выявляют связывание указанного представляющего интерес химического соединения или молекулы с указанным Альфателом, (iii) производят отбор указанного представляющего интерес химического соединения или молекулы, если связывание происходит, и (iv) оценивают ингибиторную активность против ВИЧ указанного отобранного представляющего интерес химического соединения или молекулы подходящим анализом ингибирования ВИЧ.

Альфатела по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием способов химического синтеза, известных в данной области. Альтернативно Альфатела по изобретению могут быть выработаны технологиями генетической инженерии. При этом изобретение относится к нуклеиновой кислоте, например, ДНК или РНК, кодирующей Альфатело по изобретению; к вектору экспрессии, содержащему указанную нуклеиновую кислоту; к клетке хозяина, трансформированной или инфицированной указанной нуклеиновой кислотой или вектором экспрессии, а также к способу продуцирования Альфатела изобретения, содержащему трансформирование или инфицирование клетки хозяина нуклеиновой кислотой, соответствующей изобретению, предпочтительно вектором, соответствующим изобретению.

Альфатела по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием известных в данной области способов химического синтеза. Альтернативно, Альфатела по изобретению могут быть продуцированы технологиями генетической инженерии. При этом изобретение относится к нуклеиновой кислоте, например, ДНК или РНК, кодирующей Альфатело по настоящему изобретению.

Изобретение также относится к вектору, предпочтительно, к экспрессионному вектору, содержащему упомянутую нуклеиновую кислоту, кодирующую Альфатело по изобретению.

В используемом в настоящем описании значении термин "вектор" используется в отношении молекул нуклеиновых кислот, которые переносят ДНК фрагмент(ы) из одной клетки в другую.

Термин "вектор экспрессии" в используемом в настоящем описании значении относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит требуемую целевую последовательность нуклеиновой кислоты и подходящие последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей в хозяине. Последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии в прокариотах, обычно включают в себя промотор, оператор (необязательно) и сайт связывания рибосомы, часто с другими последовательностями. Известно, что в эукариотических клетках задействованы промоторы, энхансеры и сигналы терминации и полиаденилирования.

Изобретение дополнительно относится к клетке хозяина, трансформированной или инфицированной указанной нуклеиновой кислотой, вектором или вектором экспрессии. В используемом в настоящем описании значении термин "хозяин" или "клетка хозяина" относится к любой эукариотической или прокариотической клетке (например, бактериальным клеткам, таким как E. coli, дрожжевым клеткам, таким как P. pastoris, клеткам млекопитающих, птичьим клеткам, клеткам амфибий, растительным клеткам, клеткам рыб и клеткам насекомых), локализованы in vitro или in vivo. Например, клетки хозяина могут быть локализованы в трансгенном животном.

Специалист в соответствующей области может признать, что Альфатела по настоящему изобретению могут быть сконструированы способами рекомбинантных ДНК. ДНК, кодирующая Альфатела по изобретению, может быть без труда синтезирована с использованием общепринятых методов. После приготовления ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые после этого трансформируются или трансфицируются в клетки хозяина, такие как E. coli или P. pastoris, для достижения образования Альфател в рекомбинантной клетке хозяина.

Таким образом, изобретение также относится к способу продуцирования Альфател по изобретению, содержащему трансформирование, трансфекцию или инфицирование клетки хозяина нуклеиновой кислотой по изобретению, предпочтительно, вектором, соответствующим изобретению, более предпочтительно, вектором экспрессии, соответствующим изобретению.

Термины "трансформация" и "трансфекция" в используемом в настоящем описании значении относятся к введению чужеродной ДНК соответственно в прокариотические и эукариотические клетки. Эти процедуры могут быть выполнены разнообразными способами, известными в данной области, включая осаждение ДНК фосфатом кальция, DEAE-декстран-опосредованную трансфекцию, полибрен-опосредованную трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосом, липофекцию, слияние протопластов, ретровирусную инфекцию и биолистику.

Дополнительно изобретение относится к использованию имитирующих N-тример Альфател для применения в качестве средства для скрининга лекарственных средств в конкурентном анализе. Последнее применение представляет собой способ идентификации химического соединения или молекулы, которая ингибирует ВИЧ-инфекцию, содержащий следующее: (i) подвергают экспрессирующие Env клетки воздействию одновременно имитирующего N-тример Альфатела и представляющего интерес химического соединения или молекулы, (ii) определяют конкурентное связывание указанного представляющего интерес химического соединения или молекулы по отношению к указанному имитирующему N-тример Альфателу, (iii) производят отбор указанного представляющего интерес химического соединения или молекулы, если имеет место конкурентное связывание, и (iv) оценивают ингибиторную активность по отношению к ВИЧ указанного отобранного представляющего интерес химического соединения или молекулы подходящим анализом ингибирования ВИЧ.

Дополнительно изобретение относится к использованию имитирующих gp41 Альфател в качестве вакцины. Последнее применение представляет собой способ активации иммунного ответа к ВИЧ у индивидуума, содержащий воздействие (или иммунизацию) на упомянутого индивидуума имитирующего gp41 Альфатела.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Альфатела c трансплантированной бороздкой N-тримера

Целью данного примера является демонстрация практически обоснованного способа получения имитирующего N-тример gp41 Альфатела.

Заявители проанализировали полученную кристаллографически структуру пятиспирального пучка в комплексе с Fab-антиген-связывающим доменом D5 (Root et al. Science 2001, 291:884-888; PDB структура 2CMR). Блок A, Фиг.7, демонстрирует схематическое отображение N-тримерной части пятичленного спирального пучка.

По данным авторов остатки бороздки N-тримера, которые образуют поверхность контакта с HR2, локализованы в гептадных позициях e и g. Однако в соответствии с проведенным структурным анализом необходимо также учитывать, по меньшей мере, остатки в b и c. Следовательно, при трансплантации остатков бороздки gp41 в структурно эквивалентные позиции в Альфателе необходимо принимать во внимание набор аминокислотных остатков, локализованный в позициях b, c, e и g, в отличие от того, что предположено на фиг.4 Root et al. (ibid), где в качестве остатков поверхности контакта изображены только остатки e и g.

В описании к Фиг.7 разъяснены некоторые структурные аспекты, относящиеся к трансплантации отдельных аминокислотных остатков из бороздки N-тримера в Альфатело.

На Фиг.8A представлены последовательности выравнивания Альфатела, обозначенного "scAB013" с последовательностью HR1, обозначенной "N-40" в трех различных рамках. scAB013 является особым Альфателом, которое было отобрано заявителями настоящего изобретения из-за его высокой термостабильности. Аминокислотная последовательность scAB013 обозначена SEQ ID NO: 2. Со структурной точки зрения первая спираль Альфатела ("спираль A", "последовательность гептадных повторов 1") соединена со второй спиралью ("спираль B", "последовательность гептадных повторов 2") линкерной последовательностью ("L1"), и вторая спираль Альфатела соединена с третьей спиралью ("спираль C", "последовательность гептадных повторов 3") линкерной последовательностью ("L2"). Это означает то, что независимо от ориентации спирали В по отношению к взаимно параллельным спиралям A и С (таким образом независимо от того, является Альфатело параллельным или антипараллельным), спирали A и С образуют пару параллельных спиралей, который похожи по структуре и ориентации на любую пару спиралей в N-тримере.

Выравнивания на Фиг.8A составляют основу процедуры трансплантации. Ввиду структурного сходства между Альфателом и бороздками N-тримера, позиции N-тримера с и g должны быть трансплантированы в A-спираль Альфатела и позиции b и e должны быть трансплантированы в C-спираль. Это служит источником первоначальной (неоптимизированной) последовательности Альфатела с трансплантированными остатками бороздки, как проиллюстрировано на Фиг.9.

Специалист в данной области признает, что прямое "копирование-вставка" остатков поверхности контакта из одной структуры в другую обычно не будет приводить к полному переносу функциональности; то есть, связывающая способность обычно будет потеряна или по меньшей мере значительно снижена. Следовательно, все аминокислотные остатки, которые были трансплантированы в основу последовательности, как показано на Фиг.9, были эффективно помещены в 3-D модель Альфатела scAB013 посредством мутирования последнего при стандартных углах поворота. Далее, каждый мутированный остаток был проверен с точки зрения структуры. В случае, если этот анализ вызывал сомнения в структурные совместимости, были рассмотрены альтернативные замены. Последнее показано на Фиг.10 в виде подчеркнутых двойной линией остатков. Как видно на этой фигуре, большинство вызывавших сомнения остатков были заменены на аланины, которые в целом считались более безопасным.

Итоговые структурно оптимизированные структуры Альфатела с трансплантированными подобными N-тримеру связывающими бороздками показаны на Фиг.13. Линкерные последовательности, отобранные для присоединения спирали A к В (L1) и спирали В к С (L2), были выбраны так, чтобы в каждой из них содержалась аминокислотная последовательность из шести остатков "глицин-глицин-серин-серин-глицин-глицин". Объединенные последовательности представлены как SEQ ID NO: 3 (обозначена "scAB013_N1"), SEQ ID NO: 4 ("scAB013_N2") и SEQ ID NO: 5 ("scAB013_N3").

ПРИМЕР 2. Альфатела с трансплантированным сайтом связывания HR2

Целью данного примера является демонстрация практически обоснованного способа создания Альфатела, которое имитирует поверхность HR2, которая создает контакт с бороздкой N-тримера в шестиспиральном пучке (Альфатело с трансплантированным сайтом связывания HR2 или имитирующее HR2 Альфатело). По существу была использована та же стратегия, что и в Примере 1, с особыми модификациями как изложено далее.

Нижний спиралевидный круг, блок A, Фиг.7, иллюстрирует схематическое отображение HR2 спирали пятичленного спирального пучка.

Согласно авторам, остатки HR2, которые составляют поверхность контакта с N-тримером, локализованы в гептадных позициях a и d. Однако в соответствии с проведенным авторами изобретения структурным анализом также необходимо учитывать по меньшей мере e-остатки. Следовательно, при трансплантации остатков бороздки gp41 в структурно эквивалентные позиции в Альфателе, необходимо рассматривать набор аминокислотных остатков, расположенный в позициях a-, d- и e-, в отличие того, как это предположено на фиг.4 Root et al. (ibid), где в качестве остатков поверхности контакта изображены только a- и d-остатки.

В описании к Фиг.7 изложены некоторые структурные аспекты, относящиеся к трансплантации отдельных аминокислотных остатков из спирали HR2 в Альфатело.

На Фиг.8B в двух различных рамках представлены выравнивания последовательности Альфатела scAB013 (SEQ ID NO: 2) с HR2 последовательностью, обозначенной "C-38". Характерным в этом случае является то, что гептадные позиции a, d и e в HR2 должны быть трансплантированы в максимально экспонированные позиции в Альфателе, так, чтобы они были полностью доступны для связывания N-тримера gp41. Позициями Альфатела, выбранными с этой целью, являются позиции b, c и f, с преобразованием, представленным в описании к Фиг.7. Это преобразование было использовано в выравниваниях, показанных на Фиг.8B.

В отношении типа Альфател, нет существенной разницы в том, является ли последнее параллельным или антипараллельным, потому что единственной целью является создание связывания Альфатела с бороздкой N-тримера gp41 через одну альфа-спираль. По существу также не имеет значения, какая спираль (A, В или C) выбрана, но с точки зрения конечной цели создания бифункциональных Альфател наиболее оптимальным выбором является B-спираль.

Выравнивания на Фиг.8B составляют основу процедуры трансплантации. При этом все a-остатки HR2 трансплантированы в f-позиции Альфатела и d- и e-остатки HR2 трансплантированы в b- и c-позиции Альфатела, соответственно. Это служит источником первоначальной (неоптимизированной) последовательности Альфатела с трансплантированными остатками HR2, как показано на Фиг.11.

Как в Примере 1, все аминокислотные остатки, которые были трансплантированы в основу последовательности, как показано на Фиг.11, были эффективно помещены в 3-D модель Альфатела scAB013 мутированием последнего при стандартных углах поворота. Далее каждый мутированный остаток был проверен с точки зрения структуры. В случае, если этот анализ вызывал сомнения в структурной совместимости, были рассмотрены альтернативные замены. Последнее показано на Фиг.12 в виде подчеркнутых двойной линией остатков. В отличие от Примера 1 большинство вызывавших сомнения остатков в этот раз были заменены не на аланины, а на изостерические или немного большие типы остатков для компенсирования спирального изгиба, который направлен к центру Альфатела, тогда как изгиб должен быть противоположным для оптимального связывания с N-тримером gp4.

Итоговые структурно оптимизированные структуры Альфатела с трансплантированной подобной HR2 поверхностью показаны на Фиг.14. Линкерные последовательности, отобранные для соединения спирали Альфатела, опять были выбраны так, чтобы имела место аминокислотная последовательность из шести остатков "глицин-глицин-серин-серин-глицин-глицин". Объединенные последовательности представлены как SEQ ID NO: 6 (обозначена "scAB013_C1") и SEQ ID NO: 7 ("scAB013_C2").

ПРИМЕР 3. Растворимая экспрессия и характеризация scAB013_N3

Целью данного примера является демонстрация того, что имитирующее N-тример gp41 Альфатело может быть получено рекомбинантной экспрессией в E. coli , очищено от цитоплазматической фракции и физико-химически охарактеризовано. Второй целью является демонстрация того, что полученное Альфатело связывается in vitro с похожей целевой последовательностью.

Был приобретен синтетический ген scAB013_N3, дополненный с N-конца (His)6 тагом (GeneArt). Эту кодирующую последовательность субклонировали в вектор pET16b (Novagen). Полученную в результате конструкцию трансформировали в хозяин E. coli штамма BL21(DE3), содержащий хромосомную копию гена полимеразы T7 под контролем промотора lacUVS (DE3 lysogen). Трансформированные клетки выращивали в среде с добавлением ампицилина, и экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG к экспоненциально растущим культурам. Клетки, содержащие экпрессированные Альфатела, собирали центрифугированием, и осадки ресуспендировали в 50 мМ Tris, 500 мМ NaCl, pH 7,8. Клетки разрушали ультразвуком и осаждали для удаления клеточного детрита. Очищенные супернатанты наносили на колонку HITrap IMAC HP (GE Healthcare), насыщенную ионами Ni2+. Связавшиеся белки элюировали применением градиента имидазола от 5 до 1000 мМ. Содержащие Альфатело фракции объединяли, концентрировали и наносили на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) Superdex 75 (GE Healthcare). Во время этого итогового этапа очистки буфер заменили на 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,8.

На Фиг.5 представлены CD термосканы при 222 нМ для очищенного Альфатела scAB013_N3 в 20 мМ PBS, 150 мМ NaCl, pH 7,2 и при различных концентрациях GuHCl. Термосканы были выполнены от низких к высоким температурам ("сканограмма понижения") в присутствии 2 M, 4 M и 6 M GuHCl, соответственно (закрашенные символы). Также была записана одна сканограмма от высоких к низким температурам ("сканограмма повышения"; незакрашенные символы). Сканограмма повышения при 2M демонстрирует то, что структура scAB013_N3 количественно остается свернутой почти на всем диапазоне температур. Начало термического развертывания наблюдается при температурах, превышающих 90°C (кривая ограничена Tm=101°C). Сканограмма повышения при 4 M демонстрирует почти полное термическое развертывание при установленной Tm=74°C. Сканограмма понижения при 4 М демонстрирует то, что процесс термического развертывания полностью обратим (незакрашенные квадраты совпадают с закрашенными квадратами). Сканограмма повышения при 6 M указывает на несвернутый белок на всем диапазоне температур. Совместно все эксперименты термического развертывания демонстрируют то, что Альфатело scAB013_N3 является чрезвычайно термоустойчивым и что процесс сворачивания/развертывание полностью обратим.

Фиг.16A и 16B демонстрируют результаты эксперимента изотермической титрационной калориметрии (ITC) на scAB013_N3, титруемого биотинилированным пептидом C36. Биотинилированный пептид C36, обозначаемый "bL4_C36", соответствует когнатной целевой последовательности Альфатела. Он состоит из остатков от 628 до 663 последовательности Env ВИЧ-1 HXB2 (SEQ ID NO: 1), при этом последняя биотинилирована по N-концу и амидирована по C-концу, и в котором биотиновая группа присоединена к последовательности C36 через линкер из 4-остатков Gly/Ser (-Gly-Ser-Gly-Ser-). Термограмма (Фиг.16A) демонстрирует небольшие экзотермические выделения тепла при добавлении bL4_C36, которые постепенно понижаются при достижении точки молярного равновесия вблизи молярного отношения 1. Интегральный график с корректированной базовой линией (Фиг.16B) представлял собой кривую, соответствующую модели связывания 1:1. Это привело к следующим термодинамическим параметрам: ΔH=-30 кДж/моль и Kd=150 нМ. Обобщенные эксперименты ITC демонстрируют, что Альфатело scAB013_N3 связывается с его когнатной целевой последовательностью с умерено высоким сродством. Последнее не является очевидным с учетом того, что структура была основана на конструктивной разработке, включающей 25 замен (подчеркнутые остатки на Фиг.13) по сравнению с первоначальным Альфателом scAB013.

1. Связывающая gp41 ВИЧ-1 одноцепочечная суперспираль, имеющая одиночную непрерывную аминокислотную цепь с формулой HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3, по желанию дополненная N- и С-концевыми удлинениями, приводящими к формуле N-HRS1-LI-HRS2-L2-HRS3-С, в которой
a) каждый из HRS1, HRS2 и HRS3 является независимой последовательностью гептадных повторов, состоящей из от 2 до 7 блоков последовательных гептадных повторов, при этом по меньшей мере 50% всех гептадных позиций a и d заняты остатками изолейцина, и HRS1, HRS2 и HRS3 совместно составляют 3-нитевые альфа-спиральные суперспирализованные структуры;
b) каждый из L1 и L2 независимо является линкерным фрагментом, ковалентно соединяющим HRS1 с HRS2 и HRS2 с HRS3 соответственно, начинающимся и заканчивающимся пролином или глицином и состоящим из от 3 до 30 аминокислотных остатков, из которых по меньшей мере 50% выбраны из группы пролин, глицин, серин;
c) N и С независимо являются необязательным удлинением, ковалентно присоединенным к N- и С-концам HRS1 и HRS3 соответственно, при этом это присоединение должно быть обозначено нарушающим спираль пролином или глицином.

2. Одноцепочечная суперспираль по п. 1, которая связывает внеклеточный домен gp41 ВИЧ-1, при этом указанный внеклеточный домен определяется как аминокислотные остатки от 1 до 683 SEQ ID NO: 1.

3. Одноцепочечная суперспираль по п. 1, которая связывает HR1 фрагмент gp41 ВИЧ-1, при этом указанный HR1 фрагмент определяется как аминокислотные остатки от 546 до 581 SEQ ID NO: 1, или
которая связывает HR2 фрагмент gp41 ВИЧ-1, при этом указанный HR2 фрагмент определяется как аминокислотные остатки от 628 до 661 SEQ ID NO: 1.

4. Одноцепочечная суперспираль по п. 1, которая связывает одновременно HR1 и HR2 фрагменты gp41 ВИЧ-1, при этом указанные HR1 и HR2 фрагменты определяются как аминокислотные остатки от 546 до 581 и от 628 до 661 SEQ ID NO: 1 соответственно.

5. Одноцепочечная суперспираль по любому из пп. 1-4, в которой связывание с gp41 ВИЧ-1 характеризуется константой диссоциации (Kd) или половиной максимальной эффективной концентрации (ЕС50) в субмикромолярных пределах.

6. Одноцепочечная суперспираль по п. 1, в которой связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует опосредованное env ВИЧ межклеточное слияние, характеризуемая половиной максимальной ингибирующей концентрации (IC50) в субмикромолярных пределах, или в которой связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует проникновение вируса ВИЧ, характеризуемая половиной максимальной ингибирующей концентрации (IC50) в субмикромолярных пределах, или в которой связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует вирусную репликацию ВИЧ, характеризуемая половиной максимальной ингибирующей концентрации (IC50) в субмикромолярных пределах.

7. Одноцепочечная суперспираль по п. 1, в которой связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует ВИЧ-инфекцию клеток млекопитающих.

8. Одноцепочечная суперспираль по п. 7, в которой связывание с gp41 ВИЧ-1 ингибирует ВИЧ-инфекцию человеческих клеток.

9. Связывающая gp41 ВИЧ-1 одноцепочечная суперспираль по любому из пп. 1-8 для применения при ингибировании ВИЧ-инфекции у индивидуума.

10. Одноцепочечная суперспираль по любому из пп. 1-8 для применения при активации иммунного ответа по отношению к ВИЧ у индивидуума.

11. Связывающая gp41 ВИЧ-1 одноцепочечная суперспираль по любому из пп. 1-8 для применения в качестве лекарственного средства или вакцины.

12. Связывающая gp41 ВИЧ-1 одноцепочечная суперспираль по любому из пп. 1-8 для применения при лечении или предотвращении ВИЧ-инфекции.

13. Связывающая gp41 ВИЧ-1 одноцепочечная суперспираль по любому из пп. 1-8 для применения в способе диагностирования ВИЧ-инфекции.

14. Фармацевтическая композиция для ингибирования проникновения ВИЧ, содержащая связывающую gp41 ВИЧ-1 одноцепочечную суперспираль по любому из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотную последовательность связывающей gp41 ВИЧ-1 одноцепочечной суперспирали по любому из пп. 1-8.

16. Клетка хозяина, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 15, для экспрессии нуклеиновой кислоты или аминокислоты в клетке хозяина.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложено моноклональное антитело, которое специфически связывается со вторым доменом Кунитца ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), которое характеризуется тем, что содержит 6 CDR.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к модулированию Т-клеточного иммунитета в отношении клеток, экспрессирующих специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA).

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантного получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека. Конструируют плазмиду для экспрессии в клетках СНО рекомбинантного ФСГ человека, включающую область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотор гена bla, участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональные элементы гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, последовательность Козак; открытые рамки считывания альфа- и бета-субъединиц ФСГ человека с блоками стоп-кодонов; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса EMCV; открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе трицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к ингибиторам ангиогенеза, и может быть использовано в медицине для ингибирования патологического ангиогенеза.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к гибридным белкам рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний, связанных с избыточной экспрессией FGF.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к модулированию Т-клеточного иммунитета в отношении клеток, экспрессирующих специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA).

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело и его антиген-связывающий фрагмент, способные связывать простагландин Е2 (PGE2) и охарактеризованные последовательностями CDR.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено трансгенное животное, представляющее собой мышь или крысу, в геном которого встроена нуклеиновая кислота, кодирующая перестроенную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанную с константной областью иммуноглобулина указанного животного и функционально связанную с промотором, обеспечивающим экспрессию трансгенной легкой цепи в В-клетках млекопитающего, таким образом, что она образует пары с различными эндогенными тяжелыми цепями, обеспечивая получение антител.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты гуманизированного анти-CD79b антитела, каждый из которых характеризуется наличием легкой и тяжелой цепи и набором 6 CDR с установленной аминокислотной последовательностью.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к модулированию Т-клеточного иммунитета в отношении клеток, экспрессирующих специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA).

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены варианты антител против Bv8 человека или макака, каждое из которых характеризуется тем, что содержит 6 CDR.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено выделенное антитело против гепсина, где антитело связывается с гепсином в комплексе, содержащем гепсин и ингибитор сериновой протеазы, который связывает субсайт S1 гепсина человека.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к модулированию Т-клеточного иммунитета в отношении клеток, экспрессирующих специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA).

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело и его антиген-связывающий фрагмент, способные связывать простагландин Е2 (PGE2) и охарактеризованные последовательностями CDR.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено трансгенное животное, представляющее собой мышь или крысу, в геном которого встроена нуклеиновая кислота, кодирующая перестроенную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанную с константной областью иммуноглобулина указанного животного и функционально связанную с промотором, обеспечивающим экспрессию трансгенной легкой цепи в В-клетках млекопитающего, таким образом, что она образует пары с различными эндогенными тяжелыми цепями, обеспечивая получение антител.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, которые специфически связываются с TNFα человека . Также раскрыты выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанное антитело, вектор экспрессии, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, для экспрессии вышеуказанного антитела.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано в производстве химерных антител к фактору некроза опухоли человека.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гуманизированному антителу к фактору некроза опухоли опухоли-α или его антигенсвязывающему фрагменту Fab. Также раскрыты ген, кодирующий белок антитела или Fab, генетический материал, экспрессирующий указанное антитело или Fab-фрагмент.

Предложенное изобретение относится к иммунологии. Предложено моноклональное анти-IFNAR1 антитело с мутациями L234F, L235E и P331S в области Fc человеческого IgG1, обладающее пониженным сродством в отношении Fcgamma RI, Fcgamma RIIIА и c1q рецепторов по сравнению с немодифицированным антителом.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описано применение специфических молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, для транспортировки представляющей интерес субстанции в лейкоциты.
Наверх