Коньюгаты для предупреждения или лечения никотиновой зависимости

Изобретение относится к конъюгатам, в частности представлен никотиновый гаптен-носитель формулы (III):

W представляет собой -О- и находится в положении 5 пиридинового кольца; -(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкиленовую группу, С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(H)C(O)-; X* представляет собой -NH- или -S-; m означает 1; n означает целое число от 1 до 1000; и Y представляет собой возможно модифицированный белок-носитель, выбранный из бактериальных анатоксинов, иммуногенных веществ, вирусов, вирусоподобных частиц, белковых комплексов, белков, полипептидов, липосом и иммуностимулирующих комплексов, которые могут быть использованы для приготовления вакцин для лечения и/или предупреждения никотиновой зависимости. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 23 ил.,7 табл., 22 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к никотиновым гаптенам, конъюгатам гаптен-спейсер и конъюгатам гаптен-носитель, которые служат в качестве антигенного компонента в анти-никотиновых вакцинах. Изобретение также относится к вакцинным композициям, содержащим антигены на основе таких конъюгатов никотиновый гаптен-носитель, приготовленным с адъювантами. Такие композиции применяют для увеличения частоты отказов от курения или снижения частоты рецидивов при попытках прекращения курения и при лечении табачной/никотиновой зависимости.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Курение оказывает множество серьезных вредных воздействий на здоровье и, в связи со многими государственными инициативами по снижению или предупреждению курения, становится социально менее приемлемым. Как следствие, многие курильщики желают бросить эту привычку, и, несмотря на многие предпринимаемые ежегодно попытки, только очень незначительное количество курильщиков контролирует себя, отказавшись от курения безвозвратно. Очень высокое количество неудач является результатом наркотической природы никотина плюс легкая доступность сигарет.

При курении или употреблении никотина в других формах (например, в нюхательных формах, в формах пластырей и жевательных резинок) никотин поступает в кровоток и после этого быстро поступает в головной мозг, где он стимулирует никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, вызывая высвобождение дофамина, который в свою очередь активирует центры удовольствия. При попытке бросить курить теряется удовольствие, а также возникают симптомы отмены, включающие ухудшение когнитивной функции. Основной причиной рецидива является то, что утрата удовольствия и неприятные симптомы отмены сразу же могут быть ослаблены курением.

Существуют различные невакцинные терапии для прекращения курения. Никотин-заместительные терапевтические средства, такие как содержащая никотин жевательная резинка или содержащие никотин кожные пластыри, могут помочь отучить курильщиков от сигарет, но они не разрывают цикл зависимости, вызываемой никотином. Другой подход заключается в применении лекарственных средств, направленно воздействующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, таких как варениклин. Такие лекарственные средства, которые снижают удовольствие, обычно получаемое при курении, были относительно успешными при оказании помощи в отказе от курения, однако после окончания лечения лекарственным средством частота рецидивов остается высокой, поскольку какое-либо отклонение (например, курение одной сигареты) легко может превратиться в полный рецидив с реактивацией центров удовольствия.

Самые последние стратегии оказания помощи в отказе от никотина фокусируются на вакцинах, которые стимулируют иммунную систему продуцировать антиникотиновые антитела, которые связываются с никотином в кровотоке и за счет этого снижают количество и скорость, с которой никотин может поступать в головной мозг. Это в свою очередь предотвращает активацию центров удовольствия и способствует разрыву цикла зависимости. Поскольку антитела, индуцированные вакцинами, могут быть долгоживущими, анти-никотиновые вакцины полезны для оказания помощи в отказе от курения, а также для предупреждения рецидива. Дополнительно, поскольку антитела действуют на периферии, риск неблагоприятных воздействий на центральную нервную систему (ЦНС) отсутствует. Примеры таких вакцин приведены в WO 00/32239, WO 02/49667, WO 03/82329 и US 2006/111271. Производные никотина описаны в ЕР-А-421762, WO 01/70730, WO 01/80844 и US 2005/119480. Дополнительные производные никотина идентифицированы под регистрационными номерами 136400-02-7, 250683-10-4, 861023-80-5 и 861025-04-9. Никотиновые гаптены описаны в WO 99/61054, WO 02/58635, WO 03/82329, WO 2005/40338 и ЕР-А-1849780.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к никотиновым гаптенам, конъюгатам гаптен-спейсер и способам конъюгирования, которые могут быть использованы для получения иммуногенных конъюгатов гаптен-носитель для применения в вакцинах, предназначенных для увеличения числа бросивших курить или для снижения частоты рецидивов при попытках лечения с целью прекращения курения. Изобретение также относится к вакцинным композициям, содержащим вышеупомянутые конъюгаты вместе с адъювантами или эксципиентами, которые применяют для иммунизации курильщиков с целью выработки антител против гаптенов, которые в свою очередь будут также распознавать и специфически связываться с никотином. Изобретение также относится к способу увеличения частоты отказов от курения или снижения частоты рецидивов при попытках лечения с целью прекращения курения, включающему введение конъюгата гаптен-носитель курильщикам, желающим бросить курить. В других воплощениях вакцину можно применять у некурильщиков для предупреждения формирования у них зависимости от никотина, если после этого они будут подвергаться его воздействию посредством курения или употребления других средств.

Конъюгаты никотиновый гаптен-носитель по изобретению могут иметь преимущество в том, что они являются более иммуногенными, более специфическими, более стабильными или имеют другие более полезные свойства, чем конъюгаты никотиновый гаптен-носитель, известные в данной области.

Конъюгаты никотиновый гаптен-носитель по изобретению могут представлять собой более иммуногенные антигены, чем другие известные конъюгаты никотиновый гаптен-носитель для применения в антиникотиновых вакцинах. Кроме того, вакцинные композиции, содержащие конъюгаты никотиновый гаптен-носитель по изобретению в качестве антигена вместе с адъювантами, могут быть более иммуногенными, чем другие антиникотиновые вакцинные композиции, которые обычно содержат в качестве адъюванта гидрат окиси алюминия, и могут обеспечивать более высокие показатели частоты отказов от курения и более низкие показатели частоты рецидивов среди пациентов с зависимостью от никотина/табака и желанием бросить курить. Благодаря лучшей иммуногенности, присущей антигену, а также усилению адъювантами, вакцинные композиции по изобретению могут также продуцировать более высокие титры антиникотиновых антител быстрее и с меньшими дозами, приводя в результате к лучшему соблюдению пациентами режима и схемы лечения, по сравнению с вакцинными композициями, известными в данной области.

Пути синтеза никотиновых гаптеновых соединений по изобретению могут иметь преимущество в том, что они обеспечивают увеличение общего выхода в ходе синтеза (предпочтительно вплоть до 20-кратного увеличения общего выхода в ходе синтеза), включают меньшее количество стадий синтеза, обеспечивают более высокую чистоту полученных никотиновых гаптенов (например, чистоту>99%) или имеют другие более полезные свойства, чем пути синтеза никотиновых гаптеновых соединений, известные в данной области.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 иллюстрирует влияние иммунизации мышей вакцинами, содержащими конъюгаты никотиновых гаптенов по изобретению вместе с адъювантами, на уровни антиникотиновых антител в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновыми гаптенами (из Получений 4, 7, 8 и 12), конъюгированными с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555, 21-мерный агонист TLR9, содержащий иммуностимулирующие мотивы CpG (50 мкг). Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG (иммуноглобулины G)) (Анти-NIC IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

Фиг.2 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами, содержащими антигены-конъюгаты, которые содержат гаптены по изобретению, на авидность результирующих антиникотиновых антител в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновыми гаптенами (из Получений 4, 7, 8 и 12), конъюгированными с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Индекс авидности соответствует концентрации тиоцианата аммония, необходимой для элюирования 50% антиникотиновых антител из планшетов, покрытых никотин-BSA (бычий сывороточный альбумин), и необходимость в использовании более высоких концентраций свидетельствует о более высокой авидности антител.

Фиг.3 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами, содержащими антигены-конъюгаты, которые содержат гаптены по изобретению, на распределение внутривенно (в.в.) введенного ³H-никотина в головном мозге и крови. Мышей BALB/c (n=6 на группу) иммунизировали никотиновыми гаптенами (из Получений 4, 7, 8 и 12), конъюгированными с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через 2 недели после последней реиммунизации посредством внутривенной инъекции вводили ³H-никотин (³H-Nic) (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли соотношение ³H в плазме/в головном мозге.

Фиг.4 иллюстрирует взаимодействие с никотином антиникотиновых антител после иммунизации мышей вакцинами, полученными из гаптенов по изобретению. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновыми гаптенами (из Получений 4, 7, 8 и 12), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через 2 недели после последней реиммунизации взаимодействие антиникотиновых антител с никотином определяли методом конкурентного ELISA.

Фиг.5 иллюстрирует специфичность антиникотиновых антител после иммунизации мышей вакцинами, содержащими гаптены по изобретению. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновыми гаптенами (из Получений 4 и 12), конъюгированными с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через 2 недели после последней реиммунизации специфичность антиникотиновых антител к никотину, котинину, ацетилхолину и варениклину определяли методом конкурентного ELISA.

Фиг.6 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами, в которых использованы разные спейсеры для конъюгирования никотинового гаптена по изобретению с носителем, на уровни антиникотиновых антител в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 4; 5'-аминопропилникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), причем в конъюгатах использованы разные линкеры (Получения 24-34), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Уровни антиникотиновых IgG Ab (антитела класса IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA.

Фиг.7 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами, в которых использованы разные спейсеры для конъюгирования никотинового гаптена по изобретению с носителем, на уровни и авидность антиникотиновых антител в плазме крови и на распределение ³H-никотина в плазме крови и головном мозге. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 4; 5'-аминопропилникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), причем в конъюгатах использованы разные линкеры (Получения 24-34), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через 2 недели после 3-ей иммунизации уровни антиникотиновых IgG Ab в плазме крови измеряли методом ELISA, и авидность измеряли анализом с использованием тиоцианата аммония, эн-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина) вводили внутривенной инъекцией, кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли соотношение ³H в плазме/в головном мозге.

Фиг.8 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами, в которых использованы разные спейсеры для конъюгирования никотинового гаптена по изобретению с носителем, на уровни антиникотиновых антител в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 12; 5'-аминоэтоксиникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), причем в конъюгатах использованы разные линкеры (Получения 24-34), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA.

Фиг.9 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами, в которых использованы разные спейсеры для конъюгирования никотинового гаптена по изобретению с носителем, на уровни и авидность антиникотиновых антител в плазме крови и на распределение ³H-никотина в плазме крови и головном мозге. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 12; 5'-аминоэтоксиникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), причем в конъюгатах использованы разные линкеры (Получения 24-34), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через 2 недели после 3-ей иммунизации уровни антиникотиновых IgG Ab в плазме крови измеряли методом ELISA, и авидность измеряли анализом с использованием тиоцианата аммония, ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина) вводили внутривенной инъекцией, кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли соотношение 3Н в плазме/в головном мозге.

Фиг.10 иллюстрирует влияние сукцинилирования конъюгатов гаптен-носитель по изобретению на уровни антиникотиновых антител в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 4; 5'-аминопропилникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), причем каждый конъюгат был получен с использованием 2 разных условий, со стадией или без стадии использования янтарного ангидрида, посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA.

Фиг.11 иллюстрирует влияние сукцинилирования конъюгатов гаптен-носитель по изобретению на распределение ³H-никотина в крови и в головном мозге. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 4; 5'-аминопропилникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг), причем каждый конъюгат получен с использованием 2 разных условий, со стадией или без стадии использования янтарного ангидрида, посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через 2 недели после последней реиммунизации вводили внутривенной инъекцией эн-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H в головном мозге и в плазме крови.

Фиг.12 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами, в которых использованы разные спейсеры для конъюгирования никотинового гаптена по изобретению с носителем, на уровни антиникотиновых антител в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 12; 5'-аминоэтоксиникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг) или CRM197 (10 мкг), причем в конъюгатах использованы разные линкеры (Получения 24-34), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA.

Фиг.13 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами на распределение ³H-никотина у мышей. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 12; 5'-аминоэтоксиникотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг) или CRM₁₉₇ (10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через две недели после третьей иммунизации вводили внутривенной инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни 3Н и определяли % изменения уровня ³H-никотина в головном мозге относительно контрольных животных.

Фиг.14 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами на уровни антиникотиновых антител в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 12; 5'-аминоэтокси никотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг) или CRM197 (10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Оценивали диапазон разных гаптеновых нагрузок. Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA.

Фиг.15 иллюстрирует влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами на распределение ³H-никотина у мышей. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 12; 5'-аминоэтокси никотин), конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT; 10 мкг) или CRM197 (10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Оценивали диапазон разных гаптеновых нагрузок. Через две недели после третьей иммунизации вводили внутривенной инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения уровня ³H-никотина в головном мозге относительно контрольных животных.

Фиг.16-18 иллюстрируют влияние иммунизации мышей антиникотиновыми вакцинами на уровни антиникотиновых антител и авидность в плазме крови в разные моменты времени. Мышей BALB/c (n=10 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном (Получение 12; 5'-аминоэтоксиникотин), конъюгированным с CRM197 (10 мкг), посредством внутримышечной вакцинации в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг) или в присутствии ISCOMATRIX (IMX; от 0,1 до 3,0 единиц). Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA (день 21 и день 28), и авидность измеряли методом ELISA-ингибирования. На Фиг.16[i] представлены результаты через 3 недели после 1-ой дозы; и на Фиг.16[ii] представлены результаты через 1 неделю после 2-ой дозы. Фиг.17 иллюстрирует авидность (IC₅₀) через 1 неделю после 2-ой дозы. Фиг.18 иллюстрирует секвестрацию никотина в плазме крови (вверху) и захват никотина в головной мозг (внизу).

Фиг.19 и Фиг.20 иллюстрируют влияние условий конъюгирования для конъюгатов никотиновый гаптен-носитель из Таблицы 6 на уровни антиникотиновых антител и соответствующие значения IC₅₀. Мышей BALB/c (n=10 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном посредством внутримышечной вакцинации в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA, и авидность измеряли методом ELISA-ингибирования.

Фиг.21 и Фиг.22 иллюстрируют распределение ³H-никотина в крови и в головном мозге для конъюгатов гаптен-носитель из Таблицы 6. Мышей BALB/c (n=10 на группу) иммунизировали никотиновым гаптеном посредством внутримышечной вакцинации в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и CpG 24555 (50 мкг). Через одну неделю после второй иммунизации вводили внутривенной инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения уровня ³H-никотина в крови и в головном мозге относительно контрольных животных.

На Фиг.23 представлены результаты тестирования в отношении связывания конъюгатов гаптен-носитель, имеющих разный процент мономерного белка-носителя, с CpG/Alhydrogel. Связывание определяли путем инкубирования CpG/Alhydrogel с известным количеством конъюгата гаптен-носитель и последующего измерения концентрации конъюгата, оставшегося в растворе после инкубирования. % снижения концентрации конъюгата эквивалентен % связывания конъюгата с CpG/Alhydrogel. Мышей BALB/c (n=10 на группу) иммунизировали 10 мкг разных конъюгатов внутримышечной инъекцией в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 10 мкг CpG 24555. Через одну неделю после второй иммунизации вводили внутривенной инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения уровня ³H-никотина в крови и в головном мозге относительно контрольных животных.

[На Фиг.1-23: GMT = среднее геометрическое значение титра; CI = доверительный интервал; SEM = среднеквадратическая погрешность; OD = оптическая плотность]

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 является нуклеотидной последовательностью иммуностимулирующего олигонуклеотида ODN CpG 24555.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к гаптену формулы (I):

(1) где W представляет собой -СН₂- или -O-; и Х представляет собой -NH₂ или -SH.

В одном воплощении W находится в положении 2, 5 или 6 пиридинового кольца.

В другом воплощении W находится в положении 5 пиридинового кольца.

В другом воплощении W представляет собой -O-.

В другом воплощении W представляет собой -O-; и W находится в положении 5 пиридинового кольца.

В еще одном воплощении гаптен представляет собой

, ,

и .

В другом воплощении гаптен представляет собой

или .

В еще одном воплощении гаптен представляет собой .

Во втором аспекте изобретение относится к конъюгату гаптен-спейсер формулы (II):

где W представляет собой -СН₂- или -O-; -(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкиленовую группу, С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(H)C(O)-; и Х представляет собой -NH₂ или -SH.

Используемый в данном описании термин "алкиленовая группа" означает группу -(СН₂)_n-, в которой n означает требуемое количество атомов углерода. Используемое в данном описании выражение "алкиленовая группа, прерванная 1-4 атомами кислорода" означает, например, -CH₂CH₂OCH₂-, -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂- или -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂-. Используемое в данном описании выражение "алкиленовая группа, прерванная 1-4 атомами кислорода и прерванная группой -N(H)C(O)-" означает, например, -CH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂-.

В одном воплощении W находится в положении 2, 5 или 6 пиридинового кольца.

В другом воплощении W находится в положении 5 пиридинового кольца.

В еще одном воплощении W представляет собой -O-.

В другом воплощении W представляет собой -O-; и W находится в положении 5 пиридинового кольца.

В одном воплощении -(спейсер)- представляет собой С₁-С₆алкиленовую группу.

В другом воплощении -(спейсер)- представляет собой C₁-С₁₀алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода.

В еще одном воплощении -(спейсер)- представляет собой С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 3 атомами кислорода и прерванную группой -N(Н)С(O)-.

В одном воплощении конъюгат гаптен-спейсер представляет собой

.

Следующие дополнительные воплощения предусматривают:

(1) конъюгат гаптен-спейсер формулы (II), как описано выше, где W представляет собой -O-;

(2) конъюгат гаптен-спейсер формулы (II), как описано выше, где W представляет собой -СН₂-;

(3) конъюгат гаптен-спейсер формулы (II), как описано выше или в воплощениях (1) и (2), где Х представляет собой -SH;

(4) конъюгат гаптен-спейсер формулы (II), как описан выше или в воплощениях (1)-(3), где W находится в положении 2, 5 или 6 пиридинового кольца;

(5) конъюгат гаптен-спейсер формулы (II), как описано выше или в воплощениях (1)-(4), где W находится в положении 5 пиридинового кольца;

(6) конъюгат гаптен-спейсер формулы (II), как описано выше или в воплощениях (1)-(5), где -(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкиленовую группу, С₆циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(Н)С(O)-; и

(7) конъюгат гаптен-спейсер формулы (II), как описано выше или в воплощениях (1)-(6), где -(спейсер)- представляет собой C₁-С₈алкиленовую группу.

На приведенных ниже схемах, иллюстрирующих общие способы получения соединений формулы (I), заместители такие, как определено выше для соединений формулы (I) или их производных, если не указано иное.

Боронатный эфир (ii) может быть образован в результате реакции (S)-(-)-никотина (i) с подходящим иридиевым катализатором, типично димером метокси(циклооктадиен)иридия(1), лигандом, таким как 4,4'-ди-трет-бутил-2,2'-дипиридил, и источником бора, таким как бис(пинаколато)дибор или 4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан, в подходящем растворителе, таком как 1,4-диоксан или THF (тетрагидрофуран), при температуре от комнатной температуры до температуры дефлегмации. Боронатный эфир (ii) затем может быть превращен в бромид (iii) с использованием бромида меди(И) в подходящей системе растворителей, такой как метанол/вода или этанол/вода, обычно при температуре от 60°С до температуры дефлегмации.

Бромид (iii) затем может быть превращен в ненасыщенный цианид (iv) при взаимодействии с акрилонитрилом в условиях реакции сочетания в присутствии палладия с использованием подходящего источника палладия, такого как ацетат палладия(П) или тетракис(трифенилфосфин)палладий, в присутствии подходящего фосфинового лиганда, такого как три(орто-толил)фосфин или трифурилфосфин, в присутствии подходящего основания, такого как карбонат натрия, триэтиламин или М-диизопропилэтиламин, в подходящем растворителе, таком как ацетонитрил или 1,4-диоксан, обычно при температуре, приблизительно равной температуре дефлегмации.

Гидрирование соединения формулы (iv) до образования соединения формулы (v) обычно проводят с использованием подходящего катализатора, такого как палладий на углероде, гидроксид палладия на углероде или платина на активированном угле, в атмосфере водорода в подходящем растворителе, такой как метанол, этанол или этилацетат, обычно при температуре, приблизительно равной комнатной температуре.

Восстановление нитрила (v) в амин (vi) обычно проводят с использованием подходящего катализатора, такого как никель Ренея, в атмосфере водорода (обычно при давлении примерно 50-100 фунт/кв.дюйм (345-690 кПа)) в подходящем растворителе, таком как метанол или этанол, в присутствии концентрированного раствора аммиака, обычно при температуре примерно 40-70°С.

Образование амидов типа (viii) может быть осуществлено в стандартных условиях, известных из литературы. Кислота (vii) может быть превращена в хлорангидрид кислоты с использованием хлорирующего агента, такого как оксалилхлорид или тионилхлорид, в подходящем растворителе, таком как дихлорметан или толуол, возможно в присутствии каталитического количества DMF, при подходящей температуре, обычно от 0°С до комнатной температуры. Хлорангидрид кислоты затем может быть подвергнут взаимодействию с амином (vi) в присутствии основания, такого как триэтиламин или диизопропилэтиламин, в подходящем растворителе, таком как дихлорметан или толуол, при температуре от 0°С до комнатной температуры. Альтернативно, кислота (vii) может быть превращена в подходящее активированное соединение с использованием агента сочетания, такого как Т₃Р, EDCI.HCl (гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида), EDCI.Mel (метилйодид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида), HBTU (гексафторфосфат O-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония), HATU (гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония), PyBop (гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окси-трис(пирролидино)фосфония), DCC (N,N'-дициклогексилкарбодиимид) или CDI (N,N'-карбонилдиимидазол), в подходящем растворителе, таком как дихлорметан или DMF. В присутствии EDCI.HCl или EDCI.Mel возможно добавляют НОВТ (1-гидроксибензотриазол). Также используют подходящее основание, такое как триэтиламин или диизопропилэтиламин, и реакцию обычно проводят при комнатной температуре.

Депротонирование соединения (i) может быть осуществлено с использованием подходящего основания, такого как супероснование nBuLi-LiDMAE (продукт реакции н-бутиллития с диметиламиноэтанолом), в подходящем растворителе, таком как гексан, толуол, смесь гексан/толуол или смесь гексан/THF, при подходящей температуре, обычно от -78°С до 0°С. Образовавшийся анион можно блокировать подходящим источником хлора, таким как гексахлорэтан или М-хлорсукцинимид, при температуре от -78°С до комнатной температуры, с получением двух аналогов хлорпиридина (ix) и (х).

Аналоги хлорпиридина (ix) и (х) могут быть превращены в амины (xi) и (xii) с использованием этаноламина, предпочтительно в качестве растворителя и реагента, и с использованием подходящего сильного основания, такого как гидрид натрия или mpem-бутоксид калия, при температуре обычно 50-100°С.

Бромид (iii) может быть подвергнут взаимодействию со спиртом, несущим на себе защитную группу (например бензиловым спиртом или, предпочтительно, пара-метоксибензиловым спиртом), с использованием подходящего основания, обычно гидрида натрия, в подходящем растворителе, такой как DMF или NMP (N-метилпирролидинон), обычно при температуре примерно 90-130°С. Удаление защитной группы с образованием соединения (xiv) может быть осуществлено с использованием стандартных способов, известных из литературы (например, в случае пара-метоксибензилового спирта можно использовать подходящую кислоту, такую как трифторуксусная кислота).

Спирт (xiv) может быть превращен в защищенный амин (xv) (защитной группой предпочтительно является ВОС (бутоксикарбонил)) с использованием подходящего алкилирующего агента (xvi), такого как галогенид, мезилат или тозилат, и основания, такого как карбонат калия или карбонат цезия, в подходящем растворителе, таком как ацетонитрил или DMF, обычно при температуре от 80°С до температуры дефлегмации. Удаление защитной группы амина может быть осуществлено стандартными способами, известными из литературы, с получением соединения (xvii) (например, в случае защитной группы ВОС удаление защитной группы может быть осуществлено с использованием подходящего источника кислоты, такого как трифторуксусная кислота или хлористый водород, в подходящем растворителе, таком как 1,4-диоксан, THF или дихлорметан).

Образование амидов типа (xviii) может быть осуществлено в стандартных условиях, известных из литературы. Кислота (vii) может быть превращена в хлорангидрид кислоты с использованием подходящего хлорирующего агента, такого как оксалилхлорид или тионилхлорид, в подходящем растворителе, таком как дихлорметан или толуол, возможно в присутствии каталитического DMF, при подходящей температуре, обычно от 0°С до комнатной температуры. Хлорангидрид кислоты затем может быть подвергнут взаимодействию с амином (xvii) в присутствии основания, такого как триэтиламин или диизопропилэтиламин, в подходящем растворителе, таком как дихлорметан или толуол, при температуре от 0°С до комнатной температуры. Альтернативно, кислота (vii) может быть превращена в подходящее активированное соединение с использованием агента сочетания, такого как Т₃Р, EDCI.HCl, EDCI.Mel, HBTU, HATU, PyBop, DCC или CDI, в подходящем растворителе, таком как дихлорметан или DMF. В присутствии EDCI.HCl или EDCI.Mel возможно добавляют НОВТ. Подходящее основание, такое как триэтиламин или диизопропилэтиламин, также используют, и реакцию обычно проводят при комнатной температуре. Альтернативно, амин (xvii) может быть подвергнут взаимодействию с ангидридами кислот или лактонами с получением дополнительных производных общей структурной формулы (xviii). Например, гамма-бутиролактон или гамма-тиобутиролактон может быть использован в качестве источника ацила на этой стадии, или, например, ангидрид, такой как ангидрид янтарной или фталевой кислоты, с получением производных (xviii).

Спирт (xiv) может быть также получен через боронатный эфир (ii) с использованием подходящего окислителя, обычно перекиси водорода, и подходящей кислоты, такой как уксусная кислота, в подходящем растворителе, таком как ТНР или 1,4-диоксан.

В третьем аспекте изобретение относится к конъюгату гаптен-носитель формулы (III):

где W представляет собой -CH₂- или -O-; -(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкиленовую группу, С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(Н)С(O)-, или С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу; m означает 0 или 1; X* представляет собой -N(Н)- или -S-; n означает целое число от 1 до 1000; и Y представляет собой возможно модифицированный белок-носитель, выбранный из бактериальных анатоксинов, иммуногенных веществ, вирусов, вирусоподобных частиц, белковых комплексов, белков, полипептидов, липосом и иммуностимулирующих комплексов.

В некоторых воплощениях Y представляет собой дифтерийный анатоксин или CRM₁₉₇.

Для присоединения гаптенов к белкам-носителям описанные ниже способы являются иллюстративными. Белок-носитель, такой как дифтерийный анатоксин (DT) или CRM₁₉₇, например, может быть активирован путем обработки ангидридом, например ангидридом янтарной кислоты, с получением дериватизированной версии белка-носителя (xix). Это производное затем может быть связано с гаптеном (xvii) в присутствии стандартного реагента сочетания в результате превращения в подходящее активированное соединение с использованием, например, Т₃Р, EDCI.HCl, EDCI.Mel, HBTU, HATU, PyBop, DCC или CDI, в подходящем растворителе или буфере (таком как забуференный фосфатами физиологический раствор, модифицированный по Дульбекко). В присутствии EDCI.HCl или EDCI.Mel, возможно добавляют НОВТ или N-гидроксисукцинимид (или его сульфатированный вариант), и реакцию обычно проводят при комнатной температуре с получением конъюгатов (хх). Альтернативно, стадия сукцинилирования/дериватизации может быть опущена, и может быть осуществлено прямое связывание гаптена со свободными карбоксильными группами на белке-носителе вышеописанными способами с получением конъюгатов (xxiv). Альтернативно, белок-носитель может быть обработан альтернативным дериватизирующим реагентом, таким как N-гидроксисукцинимид бромуксусной кислоты, с получением дериватизированного вещества (xxi), которое может быть обработано тиол-содержащим гаптеном (xxii) с получением конъюгата (xxiii).

Предусмотрены следующие воплощения:

(1) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше, где W представляет собой -O-;

(2) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше, где W представляет собой -CH₂-;

(3) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1) и (2), где W находится в положении 2, 5 или 6 пиридинового кольца;

(4) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(3), где W находится в положении 5 пиридинового кольца;

(5) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(4), где -(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкиленовую группу, С₆ циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(H)C(O)-;

(6) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(4), где -(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкилен;

(7) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(6), где m означает 0;

(8) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(7), где носитель представляет собой возможно модифицированный белок, выбранный из производных столбнячного токсина (например, химически инактивированного столбнячного анатоксина), производных дифтерийного токсина (например, химически инактивированного дифтерийного анатоксина или нетоксичного генетического мутанта CRM₁₉₇), гемоцианина лимфы улитки (KLH), гемоцианина, альбумина, белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) из Neisseria meningitidis, B-субъединицы термолабильного токсина Escherichia coli, рекомбинантного экзобелка А из Pseudomonas aeruginosa (rEPA) и других вирусоподобных частиц, таких как вирусоподобные частицы, собранные из рекомбинантного белка оболочки бактериофага Qb;

(9) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(8), где носитель представляет собой белок, выбранный из дифтерийного анатоксина и CRM₁₉₇, который возможно модифицирован;

(10) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(9), где носитель представляет собой возможно модифицированный CRM₁₉₇;

(11) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(10), где n означает целое число в интервале от 1 до 40;

(12) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(10), где n означает целое число в интервале от 10 до 18;

(13) конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше или согласно воплощениям (1)-(12) или как описано выше, где белок-носитель представляет собой модифицированный сукцинилированный белок.

Дифтерийный токсин превращают в дифтерийный анатоксин путем инкубирования при 37°С в присутствии формальдегида и других эксципиентов в течение 4-6 недель. Эта обработка создает в высокой степени перекрестно связанный белок разнородной молекулярной массы, что делает этот белок нетоксичным, но сохраняет его иммуногенность. Применение этого белка в качестве вакцинного белка-носителя документально подтверждено, и его используют в качестве вакцины против гонадотропин-рилизинг-фактора (GnRF) для свиней, в качестве альтернативы хирургической кастрации (Improvac™, Pfizer). Он также коммерчески доступен в неконъюгированной форме в качестве вакцины против дифтерии для людей, как часть вакцины DTaP против дифтерии, столбняка и ацеллюлярного коклюша соответственно.

CRM₁₉₇ является генетически детоксифицированным вариантом дифтерийного токсина, который сделан нетоксичным посредством одноточечной мутации, представляющей собой замену глицинового остатка в положении 52 на остаток глутаминовой кислоты. Мутация устраняет способность белка связываться с NAD+ (никотинамидадениндинуклеотид), и, будучи таковым, этот белок является ферментативно неактивным. Ввиду отсутствия перекрестного связывания этот белок является продуктом с более однородной молекулярной массой, чем дифтерийный анатоксин, инактивированный формальдегидом препарат дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ также используют в качестве белка-носителя для коммерчески доступной антипневмококковой вакцины (Prevnar^®, Pfizer).

В четвертом аспекте изобретение относится к способу изготовления конъюгатов никотиновый гаптен-носитель, которые описаны выше, включающему связывание возможно модифицированного белка-носителя с никотиновым гаптеном формулы (I) или конъюгатом гаптен-спейсер формулы (II), которые описаны выше.

В некоторых воплощениях присоединение гаптенов к белкам-носителям может быть выполнено способом, который минимизирует количество белков-носителей, которые связывают вместе. В некоторых воплощениях количество белков-носителей, связанных вместе, составляет менее 5%, менее 10%, менее 15%, менее 20%, менее 25% или менее 30% от общего количества белков-носителей.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к способу изготовления конъюгата никотиновый гаптен-носитель формулы (III), как описано выше, где X* представляет собой -NH-, включающему обработку возможно модифицированного белка-носителя сульфо-N-гидроксисукцинимидом, затем гидрохлоридом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и последующее добавление гаптена формулы (I) или конъюгата гаптен-спейсер формулы (II), которые описаны выше, где Х представляет собой -NH₂.

В альтернативном воплощении изобретение относится к способу изготовления конъюгата гаптен-носитель формулы (III), как описано выше, где X* представляет собой -NH-, включающему обработку белка-носителя ангидридом янтарной кислоты с получением модифицированного сукцинилированного белка-носителя; обработку модифицированного сукцинилированного белка-носителя сульфо-N-гидроксисукцинимидом, затем гидрохлоридом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида; и последующее добавление гаптена формулы (I) или конъюгата гаптен-спейсер формулы (II), которые описаны выше, где Х представляет собой -NH₂.

В альтернативном воплощении изобретение относится к способу изготовления конъюгата гаптен-носитель формулы (III), как описано выше, где X* представляет собой -S-, включающему обработку белка-носителя эфиром N-гидроксисукцинимида бромуксусной кислоты и последующее добавление гаптена формулы (I) или конъюгата гаптен-спейсер формулы (II), которые описаны выше, где Х представляет собой -SH.

В пятом аспекте изобретение относится к вакцинам (или вакцинным композициям), содержащим множество конъюгатов гаптен-носитель формулы (III), как определено выше, и один или более адъювантов.

Примерами подходящих адъювантов являются адъюванты, которые, как известно, усиливают антительные ответы на антигены, включая антительные ответы против никотинового гаптена, когда он связан с молекулой носителя. Адъюванты известны в данной области (J.C. Aguilar, E.G. Rodriguez, Review: Vaccine Adjuvants Revisited, 2007, Vaccine, 25, 3752-3762). Адъювант может действовать по одному или более механизмам, включая прямую активацию врожденного иммунитета, создание депо или действие в качестве носителя для доставки антигена. Адъювант, который действует по механизму прямой активации врожденного иммунитета, может представлять собой агонист Toll-подобного рецептора (TLR), включая, без ограничения, стабилизированная поли(I:С) (полиинозиновая:полицитидиловая кислота), которая активирует TLR3, производное липополисахарида, такое как монофосфорил-липид A (MPL) или гликопиразонил-липидный адъювант (GLA), которые активируют через TLR4, флагеллин, который активирует через TLR5, небольшие молекулы семейства имидазохинолина, такие как имиквимод или резиквимод, которые активируют через TLR7 или TLR8 или оба TLR7 и TLR8, олигорибонуклеотиды (ORN), которые активируют через TLR7 и/или TLR8, и олигодезоксинуклеотиды (ODN), содержащие мотивы CpG, которые активируют через TLR9. CpG ODN TLR9 агонисты могут быть агонистами А-Класса, В-Класса, С-Класса или Р-Класса, с галогенированием или без галогенирования 5'Т, известного как Е-модификация, и могут быть получены с полностью фосфодиэстеразным каркасом, полностью фосфоротиоатным каркасом, химерным каркасом, "полумягким" каркасом, который является полностью фосфоротиоатным за исключением мотива CpG между цитозинами и гуанозинами. Адъювант, который действует посредством прямой активации врожденного иммунитета, может действовать через не-TLR механизм, например QS21 или другие сапонины.

Адъювантом может быть соль алюминия, которая действует в качестве депо-системы, а также в качестве активатора врожденного иммунитета через инфламмасому. Соль алюминия предпочтительно выбирают из гидрата окиси алюминия или фосфата алюминия. Гидрат окиси алюминия предпочтительно представляет собой Alhydrogel original или Alhydrogel'85.

Адъювант, который действует как активатор врожденного иммунитета и как носитель для доставки, может представлять собой иммуностимулирующий комплекс (ISCOM), такой как ISCOMATRIX.

Адъювантом, который обладает свойствами носителя для доставки, могут быть макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, наночастицы, микросферы, микрочастицы или виросомы, и на своей поверхности они могут иметь группировки для направленного воздействия на конкретные типы клеток. Адъювантом может быть система на липидной основе, включая эмульсии типа масло-в-воде, эмульсии типа вода-в-масле, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Липосомы могут быть однослойными или многослойными. Эмульсия может представлять собой эмульсию на основе сквалена, такую как MF-59.

Адъювант может представлять собой виросому.

Предпочтительные адъюванты выбраны из CpG-содержащих олигодезоксинуклеотидов (CpG ODN), солей алюминия, QS21 и ISCOM.

Предпочтительными CpG ODN являются CpG ODN В-Класса, которые активируют преимущественно В-клетки. В аспектах изобретения CpG ODN имеет нуклеиновокислотную последовательность 5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T3' (SEQ ID NO:1), где * показывает фосфоротиоатную связь. CpG ODN этой последовательности известен как CpG 24555.

Используемый в данном описании термин "олигодезоксинуклеотид" (ODN) означает множественные нуклеотиды (т.е. молекулы, содержащие дезоксирибозный сахар, связанный с фосфатной группой и с взаимозаменяемым органическим основанием, которое представляет собой либо замещенный пиримидин (например, цитозин (С) или тимидин (Т)), либо замещенный пурин (например, аденин (А) или гуанин (G)). Молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены из существующих источников нуклеиновых кислот (например, геномных или кДНК), но предпочтительно являются синтетическими (например, полученными в результате синтеза нуклеиновых кислот). Олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, являются относительно устойчивыми к деградации in vivo (например, посредством эндо- и экзо-нуклеаз), что обеспечивает повышенную активность in vivo.

Способы синтеза и химической модификации олигонуклеотидов известны специалистам и описаны, например, a Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; и Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417. Олигонуклеотиды по изобретению могут быть синтезированы de novo с использованием любого количества методик, известных в данной области. Примерами являются b-цианоэтилфосфорамидитный метод (Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., (1981) Tet. Let. 22:1859); нуклеозид Н-фосфонатный метод (Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4051-4054; Froehler et al., (1986) Nucl. Acid Res.14:5399-5407; Garegg et al., (1986) 27:4055-4058; Gaffney et al., (1988) Tet. Let. 29:2619-2622). Эти химические методы могут быть осуществлены с помощью различных автоматических синтезаторов нуклеиновых кислот, доступных на рынке. Эти олигонуклеотиды называются синтетическими олигонуклеотидами. Модифицированные каркасы, такие как фосфоротиоаты, могут быть синтезированы с использованием автоматизированных методов, в которых используется либо фосфорамидатная, либо Н-фосфонатная химия. Арил- и алкил-фосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США №4469863, и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженная кислородная группировка алкилирована, как описано в патенте США №5023243) могут быть получены путем автоматизированного твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных реагентов. Способы осуществления других модификаций и замещений ДНК каркасов описаны, например, в Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90:544,1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990.

Наиболее предпочтительными адъювантами являются CpG 24555 (который описан в совместно поданной заявке РСТ/IB2009/055444, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки), используемый вместе с солью, представляющей собой гидрат окиси алюминия, такой как Alhydrogel. Так, в одном из воплощений предложена вакцина (или вакцинная композиция), содержащая конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как определено выше, и CpG 24555. В еще одном воплощении предложена вакцина (или вакцинная композиция), содержащая конъюгат гаптен-носитель формулы (III), как описано выше, CpG 24555 и соль гидрат окиси алюминия. В другом воплощении предложена вакцина (или вакцинная композиция), содержащая CpG 24555 и множество конъюгатов гаптен-носитель формулы (IV):

где Y представляет собой дифтерийный анатоксин или CRM₁₉₇, и n означает целое число в интервале от 1 до 40.

В еще одном воплощении предложена вакцина (или вакцинная композиция), содержащая CpG 24555, соль гидрат окиси алюминия и множество конъюгатов гаптен-носитель формулы (IV):

где Y представляет собой дифтерийный анатоксин или CRM₁₉₇, и n означает целое число в интервале от 1 до 40.

В еще одном воплощении предложена вакцина (или вакцинная композиция), содержащая соль гидрат окиси алюминия (например Alhydrogel) и множество конъюгатов гаптен-носитель формулы (IV):

где Y представляет собой дифтерийный анатоксин или CRM₁₉₇, и n означает целое число в интервале от 1 до 40.

В некоторых воплощениях n означает целое число в интервале от 1 до 30 включительно. В некоторых воплощениях n означает целое число в интервале от 5 до 23 включительно. В некоторых воплощениях n означает целое число в интервале от 10 до 18 включительно. В некоторых воплощениях n означает 10. В некоторых воплощениях n означает 11. В некоторых воплощениях n означает 12. В некоторых воплощениях n означает 13. В некоторых воплощениях n означает 14. В некоторых воплощениях n означает 15. В некоторых воплощениях n означает 16. В некоторых воплощениях n означает 17. В некоторых воплощениях n означает 18.

Варьируя условия связывания, в результате которого образуется конъюгат гаптен-носитель (смотри раздел "Иллюстративные примеры" ниже), можно минимизировать перекрестное связывание белков-носителей. Когда белки-носители перекрестно связываются, полученный в результате конъюгат гаптен-носитель содержит множество белков-носителей, ковалентно или нековалентно связанных вместе, и в данном описании он называется "высокомолекулярным соединением". И наоборот, используемый в данной описании термин "низкомолекулярное соединение" относится к конъюгатам гаптен-носитель, где часть белка-носителя теряется в процессе получения конъюгата. В некоторых воплощениях, было замечено, что в случае высокомолекулярных соединений вакцина будет менее эффективной. Поэтому в некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к любым вышеупомянутым вакцинным композициям, где менее 5%, менее 10%, менее 15%, менее 20%, менее 25% или менее 30% белков-носителей, которые являются частью конъюгатов гаптен-носитель, являются перекрестно связанными (т.е. являются высокомолекулярными соединениями).

В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к любым вышеупомянутым вакцинным композициям, где по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% белков-носителей, которые являются частью конъюгатов гаптен-носитель, не являются перекрестно связанными.

В некоторых воплощениях более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90% или более 95% антигенных компонентов любой из вышеупомянутых вакцинных композиций являются конъюгатами гаптен-носитель формулы IV.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к любой из вышеупомянутых вакцинных композиций, где по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% белков-носителей имеют молекулярную массу от 50000 Дальтон до 70000 Дальтон. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к любой из вышеупомянутых вакцинных композиций, где по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% белков-носителей имеют молекулярную массу примерно 58000 Дальтон.

Вакцинные композиции по настоящему изобретению возможно могут содержать один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Подходящие эксципиенты включают стерильную воду, солевые растворы и буферы. В одном воплощении конъюгат гаптен-носитель солюбилизирован в водном, физиологическом растворе с фармацевтически приемлемым рН. Вакцинная композиция также возможно может содержать по меньшей мере один вспомогательный агент, например дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, консерванты и стабилизаторы. Вакцинная композиция по настоящему изобретению предпочтительно является стерильной.

Вакцинную композицию по настоящему изобретению обычно будут вводить как в примирущих, так и в реиммунизирующих дозах. Ожидается, что начальная серия будет включать несколько доз, которые будут вводить с интервалами несколько недель с дополнительными реиммунизирующими дозами, вводимыми через месяцы или годы или в такие промежутки времени, когда уровни циркулирующего антитела падают ниже желаемого уровня, который, как показано клинически, коррелирует с увеличением частоты отказов от курения. Предпочтительно, вакцинную композицию по настоящему изобретению вводят в виде начальной серии из 3-6 доз, вводимых в течение 6-24 недель, и после этого реиммунизирующие дозы вводят каждые 3-12 месяцев.

Вакцинную композицию по настоящему изобретению можно вводить парентеральным путем, например посредством внутримышечной (в.м.), интрадермальной (и.д.) или подкожной (п.к.) инъекции, или, если использовать соответствующее устройство, путем местного введения в кожу (трансдермального введения) или поверхность слизистой оболочки.

В некоторых воплощениях конъюгаты гаптен-носитель и/или вакцины по изобретению можно вводить интрадермально (и.д.), используя микроигольные устройства. В одном из аспектов изобретения предложено микроигольное устройство, содержащее одну или более микроигл, которое покрыто, содержит или является эффективным для доставки конъюгата никотиновый гаптен-носитель или вакцинной композиции по изобретению. В некоторых воплощениях одна или более микроигл могут быть изготовлены в виде пластырей, микроиглы которых обеспечивают простое неинвазивное введение в кожу. В другом аспекте изобретения предусмотрено применение микроигольной технологии для доставки конъюгата никотиновый гаптен-носитель или вакцинной композиции по изобретению.

Технологии микроигольной доставки могут облегчать доставку вакцинных композиций, содержащих конъюгат никотиновый гаптен-носитель, в кожу на конкретную и желаемую глубину с использованием матриц из короткой(их) (например, длиной менее 4 мм) иглы (игл). В результате прокола такими микроиглами рогового слоя и нижележащих слоев эпидермиса лекарственное средство поступает непосредственно в эпидермис и прилежащую дерму. Благодаря малому размеру микроигл, применение является относительно безболезненным, с минимальным (если оно есть) кровотечением или минимальной реакцией в месте применения. В данном описании термин "микроигла" относится к вытянутой структуре, которая является достаточно длинной для проникания через роговой слой кожи и в эпидермальный/дермальный слой, но достаточно короткой, чтобы не вызывать существенную боль вследствие активации нервных окончаний.

Микроиглы, которые облегчают трансдермальную доставку, описаны в Prausnitz, Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) 581-587; Zahn et al., Biomed. Microdevices 6 (2004) 183-190; Shirkhandeh J. Materials Sci. 16 (2005) 37-45; Park, J. Controlled Release 104 (2005) 51-66; в патентах США №№3964482, 6503231, 6745211, 6611707, 6334856; и в публикациях заявок на патент США №№2005/0209565, 2004/0106904, 2004/0186419, 2002/0193754 и 2010/0196445, полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки. Подходящие микроиглы могут быть изготовлены из многих материалов, включая кремний, металлы и полимеры. Davis et al. описывают механику введения микроигл в кожу (Davis et al., J. Biomech. 37 (2004) 1155-1163).

В воплощениях, описанных здесь, могут быть использованы цельные и полые микроиглы. В одном воплощении микроиглы для применения в данном изобретении являются цельными. Например, каналы могут быть созданы прокалыванием кожи микроигольной матрицей, затем иглы удаляют и после этого наносят лекарственное средство (смотри, например, Martanto et al., Pharm. Res. 21 (2004) и McAllister et al., PNAS 100 (2003) 13755-13760). Композиция, содержащая терапевтический агент по изобретению, может быть нанесена на обработанное микроиглами место в виде геля, гидрогеля, крема для наружного применения, бальзама, мази или другого местного препарата, и/или с использованием устройств для доставки, таких как перевязочные материалы, окклюзионные повязки, пластыри и/или тому подобное.

В другом воплощении цельные (непористые) микроиглы покрывают конъюгатом никотиновый гаптен-носитель или вакцинной композицией по изобретению, а затем прикладывают к коже. Эпидермис затем прокалывают микроиглами, которые удерживают в контакте с поверхностью кожи в течение периода времени, достаточного для диффузии конъюгата гаптен-носитель или вакцинной композиции в прилежащую к коже ткань (информацию о введении терапевтического агента таким способом смотри в Prausnitz, Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) 581-587). В другом воплощении используют полые (пористые) микроиглы, имеющие каналы, которые обеспечивают аккумулирование конъюгатов гаптен-носитель или вакцинной композиции по изобретению. После прикладывания к коже конъюгат гаптен-носитель или вакцинная композиция диффундирует в кожную ткань посредством диффузии или эжектируемого давлением потока (информацию о введении терапевтического агента таким способом смотри в Zahn et al., Biomed. Microdevices 6 (2004) 183-190).

В еще одном воплощении, в отличие от традиционных технологий с использованием полых игл, в некоторых аспектах изобретение относится к микроиглам, сформованным из цельной матрицы из растворимого и/или биоразлагаемого материала, который можно использовать для доставки вакцинных композиций по изобретению. Примеры цельных микроигл приведены в патентах США №№6945952 и 7611481 и в опубликованных заявках на патент США №№2002/0082543, 2005/0197308 и 2008/0269685, в которых описаны микроигольные матрицы, изготовленные из биоразлагаемых полимеров (содержание указанных документов включено в данное описание посредством ссылки).

В некоторых воплощениях цельные микроиглы могут состоять из быстрорастворимых и/или набухающих материалов, включая термоформуемые полимерные материалы, получаемые синтетическим путем или имеющие природное происхождение. В некоторых воплощениях цельные микроиглы могут быть сформованы из подходящих биосовместимых, биоразлагаемых полимеров, таких как поли(лактид)ы, поли(гликолид)ы, поли(лактид-гликолид)ы, полиангидриды, полиортоэфиры, полиэфирэфиры, поликапролактоны, полиэфирамиды, поли(масляная кислота), поли(валериановая кислота), полиуретаны и их сополимеры и смеси. В других воплощениях цельные микроиглы могут быть сформованы из небиоразлагаемых полимеров, таких как полиакрилаты, полимеры этилен-винилацетаты и другие ацил-замещенные ацетаты целлюлозы, неразлагаемые полиуретаны, полистиролы, поливинилхлорид, поливинилфторид, поли(винилимидазол), хлорсульфонатные полиолефины, полиэтиленоксид, их смеси и сополимеры.

Микроиглы можно использовать каждую отдельно или в виде матриц, содержащих более чем одну микроиглу. Для применения в соответствии с данным изобретением подходят различные размеры матриц. В одном воплощении используют 1-10 микроигл. В других воплощениях используют микроигольную матрицу, содержащую 10-25, 10-50, 25-50, 25-200, 25-100 или 50-100 игл. Матрица из микроигл может варьировать в зависимости от нескольких факторов, в том числе, но без ограничения, от длины, диаметра, межигольного расстояния, заостренности и общего количества используемых микроигл. В иллюстративном воплощении матрица из микроигл представляет собой матрицу 10×10. В другом воплощении матрица из микроигл представляет собой матрицу 20×20. В некоторых воплощениях расстояние между микроиглами в матрице составляет от приблизительно 100 мкм до приблизительно 400 мкм. В одном из воплощений конкретные размеры матрицы могут быть выбраны в зависимости от желаемого усиления проницаемости кожи.

В некоторых воплощениях микроигла имеет длину от 20 мкм до приблизительно 1000 мкм, например от приблизительно 50 мкм до приблизительно 150 мкм, или от приблизительно 150 мкм до приблизительно 500 мкм, или от 500 мкм до приблизительно 1000 мкм, или от 600 мкм до приблизительно 800 мкм. В другом воплощении микроигла имеет длину приблизительно 50, 100, 250, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мкм. В других воплощениях микроигла имеет длину по меньшей мере 50, 100, 250, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мкм. В других воплощениях микроигла имеет длину менее 50, 100, 250, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мкм. В одном из воплощений микроигла имеет длину приблизительно 700 мкм. В некоторых воплощениях микроигла прокалывает кожу на глубину от приблизительно 400 мкм до приблизительно 700 мкм. В одном из воплощений микроигла прокалывает кожу на глубину, приблизительно соответствующую глубине до низа рогового слоя. В другом воплощении микроигла прокалывает кожу приблизительно до верха дермального слоя. В других воплощениях микроигла прокалывает кожу на глубину, приблизительно равную расстоянию между низом рогового слоя и верхом дермального слоя. Микроигла может иметь диаметр, необходимый для поддержания эффективности. В некоторых воплощениях наружный диаметр микроиглы может составлять от приблизительно 20 мкм до приблизительно 100 мкм. В других воплощениях наружный диаметр микроиглы может составлять от приблизительно 10 мкм до приблизительно 50 мкм. Внутренний диаметр полой микроиглы может составлять от приблизительно 5 мкм до приблизительно 70 мкм в некоторых воплощениях. Кроме того, наружный или внутренний диаметр микроиглы может составлять вплоть до 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкм. Любая комбинация вышеуказанных размеров микроигл может быть использована в необходимых случаях с описанными здесь системами и способами.

Микроигла может быть изготовлена из различных материалов, включая, но без ограничения, кремний, металл, полимер и стекло. В некоторых воплощениях используют кремниевые микроиглы. Кремниевые микроиглы, цельные или полые, могут быть вытравлены из кремниевых пластин. Например, отмечают местоположение каждой микроиглы, и окружающий кремний вытравливают с получением матрицы из микроигл, присоединенных к общему основанию. В некоторых воплощениях толщина кремниевой пластины составляет приблизительно 300-600 мкм.

В других воплощениях микроиглы изготовлены из металла, включая, но не ограничивая ими, никель, титан и сплавы, такие как нержавеющая сталь. В некоторых воплощениях металлические микроиглы изготавливают из эпоксидного шаблона, который электролитически покрывают выбранным металлом, а затем эпоксидный шаблон вытравливают. Полученные в результате микроиглы могут быть либо многократно используемыми, либо одноразовыми. Микроиглы могут быть также приобретены у коммерческих источников, включая Zosano Pharma, Inc., Corium и 3М. Компании Zosano и 3М разработали содержащие микроиглы пластыри с покрытием. Компания Corium разработала биоразлагаемые микроиглы. Компания ЗМ разработала полые микроиглы (например, Intanza^®/IDflu^®).

Конъюгат гаптен-носитель или вакцинную композицию можно наносить на микроиглы множеством различных способов. В одном воплощении готовят раствор, содержащий конъюгат гаптен-носитель или вакцинную композицию, и этот раствор наносят на/в микроиглы, затем раствор сушат. Альтернативно, микроигольную матрицу погружают в раствор, содержащий конъюгат гаптен-носитель или вакцинную композицию, и при этом осуществляется покрытие микроигл конъюгатом гаптен-носитель или вакцинной композицией. Когда на или в микроиглы по изобретению требуется нанести дополнительные белки или компоненты, тогда могут быть осуществлены дополнительные стадии нанесения покрытия. Альтернативно, несколько или все компоненты раствора смешивают в один раствор, который затем наносят на/в микроиглы. Можно применять нанесение покрытия методом погружения, нанесение покрытия методом распыления или другими методами, известными в данной области, например методами, описанными в публикации международной заявки WO 2006/138719, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки. Покрытия могут быть твердыми или полутвердыми.

Количество конъюгированного с гаптеном белка-носителя в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое индуцирует иммунозащитный ответ без значительных вредных побочных эффектов, присущих обычным вакцинам. Подходящая дозировка составляет от 0,01 до 10 мг на дозу, предпочтительно от 0,1 до 1,0 мг на дозу. Обычно у человека выработка антител против инородного антигена занимает две или более недель после введения однократной дозы вакцины, и обычно требуется введение нескольких доз вакцины в течение нескольких недель для индуцирования постоянных титров антител, таких как те, которые желательны, чтобы антиникотиновая вакцина способствовала отказу от курения. Продуцирование антител в крови человека можно контролировать методами, известными специалистам в данной области, такими как ELISA, радиоиммуноанализ, поверхностный плазменный резонанс и Вестерн-блоттинг.

Таким образом, в шестом аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату гаптен-носитель или вакцинной композиции, как определено выше, для применения в качестве лекарственного средства.

В еще одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату гаптен-носитель или вакцинной композиции, как определено выше, для применения в увеличении частоты отказов от курения и снижении частоты рецидивов у курильщиков, желающих бросить курить, экс-курильщиков, желающих избежать рецидива, или для предупреждения никотиновой зависимости.

В еще одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату гаптен-носитель или вакцинной композиции, как определено выше, для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения никотиновой зависимости у лица, нуждающегося в таком лечении.

В еще одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату никотиновый гаптен-носитель или вакцинной композиции, как определено выше, для применения в лечении или предупреждении никотиновой зависимости у лица, нуждающегося в таком лечении.

В еще одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения для оказания помощи в отказе от курения у курильщиков, желающих бросить курить, или предупреждения рецидива у курильщиков, которые бросили курить, или предупреждения никотиновой зависимости у лица, который может подвергаться воздействию курения или никотина из другого источника, включающему введение этому лицу эффективного количества конъюгата гаптен-носитель или вакцинной композиции, как определено выше.

В одном воплощении способ дополнительно включает введение лицу другого, невакцинного продукта, способствующего отказу от курения. Подходящие продукты включают фармакотерапевтические продукты, которые направленно воздействуют на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, такие как варениклин или бупропион, возможно в форме с пролонгированным высвобождением. Другие продукты, которые могут быть использованы в способе по изобретению, включают клонидин и нортриптилин. Дополнительные продукты включают продукты для никотинозаместительной терапии (NRT) в форме, например, пластыря (16 ч и 24 ч), жевательной резинки, назального спрея или ингалятора.

В еще одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления конъюгата гаптен-носитель по изобретению, включающему связывание возможно модифицированного белка-носителя с гаптеном по изобретению или конъюгатом гаптен-спейсер по изобретению.

В еще одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления конъюгата гаптен-носитель формулы (III):

где W представляет собой -CH₂- или -O-; -(спейсер)- представляет собой С₁-С₆алкиленовую группу, С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(Н)С(O)-; X* представляет собой -NH-; m означает 0 или 1; n означает целое число от 1 до 1000; и Y представляет собой возможно модифицированный белок-носитель, выбранный из бактериальных анатоксинов, иммуногенных веществ, вирусов, вирусоподобных частиц, белковых комплексов, белков, полипептидов, липосом и иммуностимулирующих комплексов, включающему обработку возможно модифицированного белка-носителя сульфо-N-гидроксисукцинимидом, затем гидрохлоридом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и последующее добавление либо гаптена формулы (I):

где W представляет собой -СН₂- или -O-; и Х представляет собой -NH₂; либо конъюгата гаптен-спейсер формулы (II):

где W представляет собой -СН₂- или -O-; -(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкиленовую группу, С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(H)C(O)-; и Х представляет собой -NH₂.

В еще одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления конъюгата формулы (III):

где W представляет собой -СН₂- или -O-; -(спейсер)- представляет собой C₁-С₈алкиленовую группу, С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу или С₁-С₈алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(H)C(O)-; X* представляет собой -NH-; m означает 0 или 1; n означает целое число от 1 до 1000; и Y представляет собой возможно модифицированный белок-носитель, выбранный из бактериальных анатоксинов, иммуногенных веществ, вирусов, вирусоподобных частиц, белковых комплексов, белков, полипептидов, липосом и иммуностимулирующих комплексов, включающему обработку белка-носителя ангидридом янтарной кислоты с получением модифицированного сукцинилированного белка-носителя; обработку модифицированного сукцинилированного белка-носителя сульфо-N-гидроксисукцинимидом, затем гидрохлоридом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида; и последующее добавление либо гаптена формулы (I):

где W представляет собой -СН₂- или -O-; и Х представляет собой -NH₂, либо конъюгата гаптен-спейсер формулы (II):

где W представляет собой -CH₂- или -O-; -(спейсер)- представляет собой C₁-С₈алкиленовую группу, С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(Н)С(O)-; и Х представляет собой -NH₂.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ

ELISA на уровни антиникотиновых антител. Уровни антиникотиновых антител в плазме крови мыши количественно определяли с использованием анализа ELISA, как описано ниже. Поскольку молекула никотина не пригодна для покрытия планшетов для ELISA, поэтому ее связывают с более крупной молекулой (бычий сывороточный альбумин), обладающей биоадгезивными свойствами. Производное никотина (рац-транс-3'-тиометил-никотин) конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином, и полученный конъюгат никотин-BSA использовали для покрытия 96-луночных планшетов для ELISA Immune Maxi-Sorp (VWR) (100 мкл на лунку) в конечной концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере (Sigma-Aldrich), и планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты аспирировали и промывали забуференным фосфатами физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween^® 20 (Sigma-Aldrich, P3563). Планшеты блокировали 200 мкл блокирующего буфера (карбонатный буфер+10% бычьего сывороточного альбумина, Fisher) при 37°С в течение 1 часа и затем промывали, как указано выше. Образцы и эталонную плазму последовательно разводили в буфере для разведении (1×PBS с 0,05% Tween^® 20+10% BCS) и добавляли в планшеты (100 мкл на лунку). Планшеты инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Их снова промывали и затем инкубировали с козьими антителами против мышиных IgG-HRP (HRP = пероксидаза хрена) (Southern Biotech), разведенными буфером для разведении (1×PBS с 0,05% Tween^® 20+10% BCS) в течение 1 часа при 37°С. Планшеты затем снова промывали и инкубировали с субстратом дигидрохлорид O-фенилендиамина (OPD) (1×5 мг таблетка OPD (орто-фенинилендиамин), растворенная в фосфатном-цитратном буфере, Sigma-Aldrich) в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 4 н. серной кислоты (VWR) в каждую лунку, и считывание выполняли при 450 нм, используя автоматизированный планшет-ридер. Образцы количественно определяли как наивысшее разведение в плазме, которое давало в результате величину оптической плотности (OD 450) в два раза выше, чем величина оптической плотности неиммунизированной плазмы, с предельным значением 0,05.

Измерение авидности антиникотиновых антител. Авидность антиникотиновых антител измеряли с использованием метода ELISA, основанного на элюировании тиоцианатом аммония, как описано ниже. 96-луночные планшеты Immuno Maxi-Sorp ELISA (VWR) покрывали (100 мкл на лунку) раствором антигена никотин-BSA в концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере (Sigma-Aldrich) и инкубировали в течение ночи при 4°С.Планшеты промывали забуференным фосфатами физиологическим раствором (PBS), содержащим 0,05% Tween^® 20 (Sigma-Aldrich) и затем блокировали 200 мкл карбонатного буфера+10% сыворотки теленка коровы (Fisher) в течение 1 часа при 37°С. Планшеты снова промывали. Образцы плазмы, содержание антиникотиновых антител в которых предварительно определяли, разводили в PBS, содержащей 0,05% Tween^® 20+10% сыворотки теленка коровы (BCS) для достижения оптимальных значений оптической плотности приблизительно 1,0 при 450 нм и затем добавляли в планшеты в количестве 100 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С и затем промывали. Далее осуществляли элюирование путем добавления тиоцианата аммония (NH₄SCN) (100 мкл на лунку) в концентрациях в пределах от 0 до 2,0 М, разведенного в PBS/0,05% Tween^® 20, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Планшеты затем промывали, и связывание с антителами детектировали с использованием козьих антител против мышиных IgG-HRP (Southern Biotech), разведенных буфером для разведении (1×PBS с 0,05% Tween^® 20+10% BCS) в течение 1 часа при 37°С.Планшеты затем промывали снова и инкубировали с субстратом дигидрохлорид 0-фенилендиамина (OPD) (1×5 мг OPD таблетка, растворенная в фосфатном цитратном буфере, Sigma-Aldrich) в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 4 н. серной кислоты (VWR) в каждую лунку, и выполняли считывание при 450 нм с использованием автоматического планшет-ридера. Результаты затем выражали в виде процента снижения связывания антиген-антитело (% снижения OD) в присутствии NH₄SCN и строили график зависимости от молярной концентрации NH₄SCN. Индекс авидности вычисляли как концентрацию NH₄SCN, необходимую для продуцирования 50%-ного снижения связывания.

Оценка распределения никотина в плазме крови и головном мозге.

Влияние иммунизации на распределение никотина в плазме и головном мозге определяли путем введения животным (предварительно иммунизированным антиникотиновой вакциной) 0,05 мг/кг гидротартрата ³H-никотина, содержащего 3 мкКи ^-никотина в 100 мкл PBS в течение 10 секунд посредством инфузии в хвостовую вену. Кровь отбирали спустя 5 минут пункцией в сердце, и плазму собирали. Мышь немедленно перфузировали PBS посредством инъекции 20 мл в левый желудочек сердца в течение 1-2 минут, и головной мозг извлекали и взвешивали. Головной мозг подвергали расщеплению при примерно 50°С в течение 72 часов в 1 мл буфера для расщепления (100 мМ хлорида натрия, 25 мМ Tris, 25 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,5% Igepal CA-630 и 0,3 мг/мл протеиназы K на 100 мг ткани). Аликвоты по 100 мкл расщепленного головного мозга или плазмы смешивали с 5 мл сцинтилляционной жидкости, и уровни радиомеченого никотина определяли путем подсчета жидкостной сцинтилляции.

Конкурентный анализ ELISA для определения специфичности антител, индуцированных антиникотиновыми вакцинами. Специфичность антиникотиновых антител определяли с использованием метода конкурентного анализа ELISA, как описано ниже. 96-луночные планшеты Immuno Maxi-Sorp ELISA (VWR) покрывали (100 мкл на лунку) раствором антигена никотин-BSA в концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере (Sigma-Aldrich) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали забуференным фосфатами физиологическим раствором (PBS), содержащим 0,05% Tween^® 20 (Sigma-Aldrich), блокировали 200 мкл карбонатного буфера+10% сыворотки теленка коровы (Fisher) в течение 1 часа при 37°С и затем снова промывали. Во время инкубирования образцы плазмы, содержание антиникотиновых антител в которых предварительно определяли, разводили в PBS, содержащей 0,05% Tween^® 20+10% сыворотки теленка коровы (BCS) для достижения оптимальных значений оптической плотности приблизительно 1,0-1,5 при 450 нм, и разные ингибиторы (никотин, котинин, ацетилхолин, варениклин) последовательно разводили, начиная при 20000 мкМ. Равные объемы (65 мкл) разведенных образцов и выбранного ингибитора добавляли в лунки непокрытого 96-луночного планшета и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После инкубирования добавляли смеси плазма/ингибитор в количестве 100 мкл на лунку в предварительно блокированные никотин-ВЗА-покрытые планшеты. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при 37°С и затем снова промывали. Связывание антител детектировали с использованием козьих антител против мышиных IgG-HRP (Southern Biotech), разведенных буфером для разведении (1×PBS с 0,05% Tween^® 20+10% BCS) в течение 1 часа при 37°С. Планшеты затем снова промывали и инкубировали субстратом дигидрохлорид 0-фенилендиамина (OPD) (1×5 мг OPD таблетка, растворенная в фосфатном цитратном буфере, Sigma-Aldrich) в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 4 н. серной кислоты (VWR) в каждую лунку, и выполняли считывание при 450 нм с использованием автоматизированного планшет-ридера. Строили график значений считывания OD при 450 нм в зависимости от молярной концентрации ингибитора, и 50%-ное ингибирование экстраполировали на каждый тестируемый образец.

ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение иллюстрируется, но без ограничения, приведенными ниже Получениями и Примерами, в которых использованы следующие сокращения:

Аммиак	Концентрированный раствор аммиака в воде, имеющий удельную массу 0,880
CDCb	Хлороформ-d1
Celite®	Фильтрующий агент
ХИ	Химическая ионизация
DCM	Дихлорметан
dPBS	Забуференный фосфатами физиологический раствор, модифицированный по Дульбекко
DMF	N,N-Диметилформамид
ЭРИ+	Электрораспылительная ионизация, регистрация положительных ионов
EtOAc	Этилацетат
Et3N	Триэтиламин
ч	час
1H ЯМР	Протонный ядерный магнитный резонанс

[Ir(cod)(OMe)]2	бис(η4-1,5-циклооктандиен)-ди-µ-метокси-дииридий (I)
ЖХ/МС	Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
MeCN	Ацетонитрил
МеОН	Метанол
MgSO4	Сульфат магния
мин	минута
m/z	Пик масс-спектра
Pd/C	Палладий на угле
Т3Р	ангидрид пропанфосфоновой кислоты, £ раствор в этилацетатеэ0%-ный (масс./об.)

¹H ЯМР-спектры во всех случаях соответствовали указанным структурам. Характеристические химические сдвиги (6) приведены в частях на миллион в направлении слабого поля от тетраметилсилана с использованием общепринятых сокращений для обозначения основных пиков: например, s, синглет; d, дублет; t, триплет; q, квартет; m, мультиплет; br, уширенный; brm, уширенный мультиплет; brt, уширенный триплет.

Если не указано иное, ЖХ/МС выполняли в следующих условиях: колонка Waters XBridge C18 5 нм, 2,1×30 мм, от 0:100 до 95:5 за 3,1 мин, MeCN: (10 мМ (NH₄)₂НСО₃ водн.).

ПОЛУЧЕНИЯ

Получение 1: (5)-3-бром-5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин (или 5-бромникотин)

Это соединение было получено способом, описанным в J. Am. Chem. Soc., 2007, 50, 15434-15435.

Бис(пинаколато)дибор (7,16 г, 28,21 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (60 мл), затем дегазировали, барботируя аргон. Добавляли (5)-(-)-никотин (6,48 мл, 40,3 ммоль), затем добавляли 4,4'-ди-трет-бутил-2,2'-дипиридил (650 мг, 2,42 ммоль). Дегазирование продолжали в течение 10 мин, затем добавляли димер метокси(циклооктадиен)иридия(1) (753 мг, 1,21 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре дефлегмации в течение 18 часов. Растворитель выпаривали, и остаток растворяли в МеОН (100 мл). Добавляли бромид меди(П) (27,0 г, 120,9 ммоль) в воде (100 мл), и реакционную смесь нагревали при 80°С в течение 3 часов. Раствор аммиака (10%-ный водный, 100 мл) добавляли в реакционную смесь, которую затем экстрагировали этилацетатом и сушили над MgSO₄. Растворитель выпаривали, и неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (5% МеОН в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевого масла (6,14 г, 63%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.68-1.70 (m, 1H), 1.80-1.82 (m, 1H), 1.92-1.94 (m, 1H), 1.99-2.02 (m, 1H), 2.03 (s, 3Н), 2.20-2.34 (m, 1H), 3.08 (t, 1H), 3.20 (t, 1H), 7.86 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.54 (s, 1H).

Получение 2: (5)-3-(5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-ил)акрилонитрил

Смесь (S)-3-бром-5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридина (Получение 1) (300 мг, 1,24 ммоль), ацетата палладия(П) (14 мг, 0,06 ммоль), три(орто-толил)фосфина (75 мг, 0,25 ммоль) и триэтиламина (0,35 мл, 2,48 ммоль) в MeCN (10 мл) дегазировали, барботируя аргон. Затем добавляли акрилонитрил (0,12 мл, 1,87 ммоль), и реакционную смесь нагревали при температуре дефлегмации в течение 18 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через Celite, и растворители выпаривали с получением коричневого твердого вещества. Этот неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (2% [20%-ный раствор аммиака в МеОН] в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде красно-коричневого масла (188 мг, 71%, смесь цис и транс изомеров).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.60-1.79 (m, 1H), 1.80-1.90 (m, 1H), 1.90-2.04 (m, 1H), 2.17 и 2.19 (2×s, 3Н), 2.16-2.40 (m, 2H), 3.11-3.30 (m, 2H), 5.57 и 6.00 (2×d, 1H), 7.16 и 7.40 (2×d, 1H), 7.80 и 8.26 (2×s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.60 и 8.71 (2×s, 1H).

Получение 3: (5)-3-(5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-ил)пропаннитрил

(S)-3-(5-(1-Метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-ил)акрилонитрил (Получение 2) (185 мг, 0,87 ммоль) и 5% Pd/C (50 мг) в МеОН (5 мл) перемешивали в атмосфере водорода в течение 72 часов. Реакционную смесь фильтровали через Celite, затем растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (5% [20%-ный раствор аммиака в МеОН] в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого масла (141 мг, 75%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.66-1.78 (m, 1H), 1.78-1.89 (m, 1H), 1.89-2.02 (m, 1H), 2.17 (s, 3Н), 2.17-2.25 (m, 1H), 2.31 (q, 1H), 2.65 (t, 2H), 2.97 (t, 2H), 3.10 (t, 1H), 3.24 (t, 1H), 7.61 (d, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.44 (s, 1H).

Получение 4: (S)-3-(5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-ил)пропан-1-амин

(S)-3-(5-(1-Метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-ил)пропаннитрил (Получение 3) (140 мг, 0.65 ммоль) и никель Ренея (50 мг) в 20%-ном растворе аммиака в МеОН (50 мл) перемешивали в присутствии водорода под давлением 50 фунт/кв.дюйм (345 кПа) при 50°С в течение 4 часов. Реакционную смесь фильтровали через Celite, затем растворитель выпаривали. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (7% [20%-ный раствор аммиака в МеОН] в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого масла (126 мг, 88%).

¹H ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ=1.70-1.85 (m, 3Н), 1.85-2.03 (m, 2H), 2.15 (s, 3Н), 2.35 (q, 2H), 2.59-2.78 (m, 4H), 3.12-3.37 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 8.31 (br s, 2H).

ЖХ/МС: 1,91 мин (97%), m/z=220,16 [M+H]⁺

Получения 5 и 6: (S)-2-хлор-5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин (или 6-хлорникотин) и (S)-2-хлор-3-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин (или 2-хлорникотин)

and

Эти соединения были получены способами, описанными в Eur. J. Огд. Chem., 2006, 3562-3565.

Бутиллитий (2М в гексанах, 83 мл, 166 ммоль) добавляли к раствору диметиламиноэтанола (9,3 мл, 92,5 ммоль) в гексанах (70 мл) при -20°С. Добавляли (S)-(-)-никотин (5,0 г, 30,8 ммоль) в гексанах (30 мл), и реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 1 часа. Зеленый раствор охлаждали до -78°С и добавляли гексахлорэтан (29,1 г, 123 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при -78°С, затем реакцию гасили добавлением хлорида аммония (насыщенный водный раствор). Добавляли DCM и 2М HCl (водн.). Водный слой промывали DCM (×2) и затем подщелачивали добавлением смеси лед/аммиак (водн.). Водный слой экстрагировали DCM (×2), сушили над MgSO₄ и упаривали. Неочищенные продукты очищали посредством флэш-хроматографии (20% этилацетата в гексанах) с получением 6-хлорникотина (Получение 5) (2,2 г, 36%) и 2-хлорникотина (Получение 6) (120 мг, 2%), оба в виде желтого масла.

6-хлорникотин: ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ=1.58-2.01 (m, 3Н), 2.14 (s, 3Н), 2.10-2.23 (m, 1H), 2.28 (q, 1H), 3.05 (t, 1H), 3.19 (dt, 1H), 7.26 (d, 1H), 7.64 (dd,1H),8.27(d,1H).

2-хлорникотин: ¹H ЯМР (300 МГц, CDCb) 5=1.45-1.60 (m, 1H), 1.76-1.98 (m, 2H), 2.22 (s, 3Н), 2.31-2.49 (m, 2H), 3.24 (t, 1H), 3.55 (t, 1H), 7.20-7.29 (m, 1H), 7.93 (d,1H), 8.24 (dd, 1H).

Получение 7: (5)-2-(5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-2-илокси)этанамин

Гидрид натрия (60% в масле, примерно 500 мг) добавляли к 6-хлорникотину (Получение 5) (690 мг, 3.5 ммоль) в этаноламине (3 мл). После выдерживания в течение 15 мин при комнатной температуре реакционную смесь нагревали при 80°С в течение 16 часов. Реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой. Водный слой экстрагировали этилацетатом, сушили над MgSO₄ и упаривали. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (5% [20%-ный раствор аммиака в МеОН] в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (44 мг, 6%).

¹H ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ=1.71-2.00 (m, 3Н), 2.17 (s, 3H), 2.17-2.23 (m, 1H), 2.31 (q, 1H), 2.99 (t, 2H), 3.09 (t, 1H). 3.20 (t, 1H), 4.26 (t, 2H), 6.83 (d, 1H), 7.68 (d,1H), 8.02 (d,1H).

ЖХ/МС: 2,02 мин (100%), m/z=222,1 [М+H]⁺

Получение 8: (s)-2-(3-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-2-илокси)этанамин

Гидрид натрия (60% в масле, примерно 200 мг) добавляли к 2-хлорникотину (Получение 6) (120 мг, 0,61 ммоль) в этаноламине (2 мл). После выдерживания в течение 15 мин при комнатной температуре реакционную смесь нагревали при 80°С в течение 16 часов. Реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой. Водный слой экстрагировали этилацетатом, сушили над MgSO₄ и упаривали. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (5% [20%-ный раствор аммиака в МеОН] в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла (8,5 мг, 6%).

¹H ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ=1.60-1.70 (m, 1H), 1.81-1.99 (m, 2H), 2.20 (s, 3Н), 2.23-2.40 (m, 2H), 3.03 (t, 2H), 3.19 (t, 1H), 3.53 (t, 1H), 4.27-4.41 (m, 2H), 6.96 (d,1H), 7.74 (d, 1H), 8.00 (d, 1H).

ЖХ/МС: 2,03 мин (99%), m/z=222,1 [М+Н]⁺

Получение 9: (S)-3-(4-метоксибензилокси)-5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин

Гидрид натрия (60% в масле, 650 мг, 32,5 ммоль) добавляли к 4-метоксибензиловому спирту (1,4 г, 11,6 ммоль) в DMF (10 мл). После выдерживания в течение 30 мин при комнатной температуре добавляли 5-бромникотин (Получение 1) (1,4 г, 11,6 ммоль) в DMF (2 мл). Реакционную смесь нагревали при 90°С в течение 16 часов. Реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой. Водный слой экстрагировали этилацетатом, органические слои объединяли, сушили над MgSO₄ и упаривали. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (2,5%→5% МеОН в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла, в смеси с примерно 30% другого изомера (402 мг, 23%).

Получение 10: (S)-5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-ол (или 5-гидроксиникотин)

Получение 10а: (S)-3-(4-Метоксибензилокси)-5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин (Получение 9) (400 мг, 1,34 ммоль) перемешивали в трифторуксусной кислоте (2 мл) и DCM (5 мл) в течение 2 часов. Реакционную смесь упаривали, затем совместно выпаривали с DCM (×5) и 20%-ным раствором аммиака в МеОН. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (10% МеОН в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (225 мг, 94%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=2.20-2.39 (m, ³H), 2.48-2.59 (m, 1H), 2.76 (s, 3Н), 3.83 (br s, 1H), 4.38 (brs, 1H), 7.42 (d, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.20 (s, 1H).

ЖХ/МС: 1,26 мин (100%), m/z=179,1 [М+Н]⁺

Получение 10б: (S)-Никотин (54 мл, 336,2 ммоль) и 4,4'-ди-трет-бутил-2,2'-дипиридил (5,41 г, 20,2 ммоль) последовательно добавляли к раствору бис(пинаколато)дибора (59,8 г, 235,5 ммоль) в 1,4-диоксане (218 мл). Полученный раствор дегазировали под вакуумом при комнатной температуре в течение 15-20 минут и затем подавали азот. Эту процедуру затем повторяли более двух раз.

В реакционный сосуд загружали [Ir(cod)(OMe)]₂ (6,7 г, 10,1 ммоль), и реакционную смесь дегазировали под вакуумом при комнатной температуре в течение 5 минут, затем подавали азот. Эту процедуру затем повторяли более двух раз.

Полученный раствор нагревали при 85°С в течение 16 часов, после чего анализ изменений во времени показал, что реакция завершена. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали досуха при пониженном давлении при температуре от 50 до 55°С. Полученный оранжевый остаток растворяли в тетрагидрофуране (740 мл), и раствор охлаждали до температуры от 0 до 5°С. В сосуд загружали уксусную кислоту (52,1 мл, 908,8 ммоль), затем медленно добавляли раствор перекиси водорода (30%, 43,1 мл, 454,4 ммоль), поддерживая температуру от 0 до 10°С. Полученную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре, после чего анализ изменений во времени показал, что реакция завершена.

Реакционную смесь затем охлаждали до температуры от 0 до 5°С, и реакцию гасили добавлением водного раствора метабисульфита натрия (30%, 50 мл). рН полученной смеси корректировали добавлением концентрированного раствора гидроксида аммония (130 мл). Слои полученной двухфазной смеси разделяли, и водный слой реэкстрагировали тетрагидрофураном (300 мл). Объединенные органические слои концентрировали с получением неочищенного соединения в виде оранжевой смолы. Эту смолу очищали колоночной хроматографией на силикагеле (МеОН в DCM, от 5 до 20%) для удаления большей части примесей, затем подвергали дополнительной колоночной хроматографии (100% THF) для удаления изомерных примесей. Чистый 5-гидроксиникотин был выделен в виде желтого твердого вещества (26 г, выход 48%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.70-2.05 (m, 4Н), 2.21 (s, 3Н), 2.31 (m, 1H), 3.11 (t, 1H), 3.25 (m. 1H), 7.32 (d, 1H), 8.01 (s, 1H), 8.05 (s, 1H).

Получение 11: (S)-трет-бутил-2-(5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-илокси)этилкарбамат

(S)-5-(1-Метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-ол (Получение 10) (175 мг, 0,98 ммоль), трет-бутил-2-бромэтилкарбамат (550 мг, 2,45 ммоль) и карбонат калия (676 мг, 4,9 ммоль) в DMF (7 мл) нагревали при 90°С в течение 16 часов. Реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой. Водный слой экстрагировали этилацетатом, сушили над MgSO₄ и упаривали. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (5%→10% МеОН в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (108 мг, 34%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.42 (s, 9H), 1.70-2.00 (m, ³H), 2.17 (s, ³H), 2.09-2.20 (m, 1H), 2.20-2.30 (q, 1H), 3.15-3.26 (m, 2H), 3.45 (t, 2H), 4.08 (t, 2H), 7.43 (d, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.13 (s, 1H).

ЖХ/МС: 2,62 мин (100%), m/z=322,15 [М+Н]⁺

Получение 12: (S)-2-(5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-илокси)этанамин

Получение 12а: (S)-трет-бутил-2-(5-(1-метилпирролидин-2-ил)пиридин-3-илокси)этилкарбамат (Получение 11) (105 мг, 0,33 ммоль) перемешивали в трифторуксусной кислоте (1 мл) и DCM (5 мл) в течение 1,5 ч. Реакционную смесь упаривали, затем совместно выпаривали с DCM ×5) и 20%-ным раствором аммиака в МеОН. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии (5% [20%-ный раствор аммиака в МеОН] в DCM) с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (62 мг, 85%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.70-2.01 (m, ³H), 2.17 (s, 3H), 2.18-2.30 (m, 1H), 2.30-2.40 (m, 1H), 3.03 (t, 2H), 3.14-3.28 (m, 2H), 4.08 (t, 2H), 7.44 (d, 1H), 8.08 (s,1H), 8.16 (s,1H).

ЖХ/МС: 1,87 мин (100%), m/z=222,12 [M+H]⁺

Получение 12б: Метоксид калия (3,37 г, 46,2 ммоль) в метаноле (40 мл) загружали в раствор 5-гидроксиникотина (Получение 106) (8,0 г, 44,0 ммоль) в метаноле (40 мл) при температуре от 0 до 5°С. Полученную смесь перемешивали в течение 90 минут и затем концентрировали досуха при пониженном давлении при 45°С.

Вос-1-амино-2-бромэтан (14,8 г, 66,0 ммоль) в диметилформамиде (80 мл) нагревали до 50°С в атмосфере азота, и в этот момент в сосуд загружали заранее полученную калиевую соль 5-гидроксиникотина, затем сразу же добавляли карбонат калия (6,7 г, 48,4 ммоль).

Полученную смесь нагревали при 85°С в течение 4 часов и затем охлаждали до комнатной температуры. Смесь концентрировали при пониженном давлении при 50°С, и полученную оранжевую смесь перемешивали в 1,4-диоксане (50 мл) в течение 15 минут. Раствор затем фильтровали, и жидкость охлаждали до температуры от 0 до 5°С, затем подкисляли 4М HCl в 1,4-диоксане (65 мл). Смесь концентрировали при пониженном давлении при 50°С, и полученный остаток растворяли в тетрагидрофуране (30 мл). Эту смесь затем охлаждали до температуры от 0 до 5°С, и рН корректировали раствором гидроксида натрия (10М, 45 мл). Слои полученной двухфазной смеси разделяли, и водный слой реэкстрагировали тетрагидрофураном (2×50 мл) Объединенные органические слои концентрировали с получением неочищенного соединения в виде красного масла. Этот неочищенный продукт растворяли в DCM и перемешивали в течение 10 минут, затем фильтровали, и жидкость наносили на силикагелевую колонку и очищали, элюируя от 5 до 30% метанола (содержащего 20% гидроксида аммония) в этилацетате. Указанное в заголовке соединение было получено в виде желтого масла, 7,15 г (выход 73%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.65-1.80 (m, 3Н), 1.85 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.19 (s, 3Н), 2.21 (m, 1H), 2.35 (q, 1H), 3.12 (m, 3Н), 3.28 (t, 1H), 4.08 (t, 2H), 7.28 (s,1H),8.15(s,1H),8.23(s,1H).

Получение 13: трет-бутил-{транс-4-1(3-{5-[(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)карбамоил]циклогексил}карбамат

Раствор 3-{5-[(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропан-1-амина (Получение 4) (100 мг, 0,45 ммоль) в 2-метилтетрагидрофуране (2 мл) обрабатывали при перемешивании транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислотой (132 мг, 0,502 ммоль), затем Т₃Р (580 мкл, 0,91 ммоль) и затем Et₃N (118 мкл, 0,91 ммоль). После перемешивания в течение 3 часов раствор обрабатывали Т₃Р (240 мкл, 0,38 ммоль). После перемешивания в течение 18 часов раствор концентрировали в вакууме, и остаток переносили в МеОН и наносили на картридж SCX-2, который элюировали МеОН, затем раствором аммиака в МеОН (примерно 2М). Фракции. содержащие продукт, концентрировали в вакууме, и остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле. элюируя смесью EtOAc:МеОН:NH₃ (градиент от 1:0:0 до 90:10:1) с получением указанного в заголовке соединения в виде смолы(130 мг, 64%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.04-1.14 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.48-1.59 (m, 2H), 1.65-1.74 (m, H), 1.79-2.02 (m, 7H), 2.05-2.09 (brm, 2H), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.26-2.33 (m, H), 2.60-2.64 (t, 2H), 3.04-3.08 (t, H), 3.20-3.30 (m, ³H), 3.40 (brm, H), 4.39 (brm, H), 5.56 (brt, H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H), 8.34-8.35 (d, H).

MC, m/z=568 ЭРИ+[M+H]⁺, 567 ХИ [M+H]⁺

Получение 14: трет-бутил-(19-{5-[(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}-15-оксо-3,6,9,12-тетраокса-16-азанонадец-1-ил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя 3-(2-{2-[2-(2-mpem-бутоксикарбониламино-этокси)-этокси]-этокси}-этокси)-пропионовую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (180 мг, 70%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.41 (s, 9H), 1.65-1.76 (m, H), 1.78-1.86 (m, 3Н), 1.88-2.01 (m, H), 2.13-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (m, H), 2.44-2.47 (t, 2H), 2.61-2.65 (t, 2H), 3.03-3.07 (t, H), 3.19-3.29 (m, 6H), 3.49-3.52 (t, 2H), 3.57-3.62 (m, 11H), 3.70-3.73 (t, 2H), 5.21 (brm, H), 6.66 (brm, H), 7.51 (t, H), 8.30-8.31 (d, H),] 8.33 (d, H).

MC, m/z=445 ЭРИ+[М+Н]⁺, 445 ХИ [М+Н]⁺

Получение 15: трет-бутил-{2-[(3-{5-[(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)амино]-2-оксоэтил}карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя mpem-бутоксикарбониламино-уксусную кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (133 мг, 77%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.45 (s, 9H), 1.66-1.77 (m, H), 1.79-1.90 (m, 3Н), 1.91-2.02 (m, H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.34 (q, H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.04-3.09 (t, H), 3.21-3.26 (m, H), 3.28-3.34 (m, 2H), 3.75-3.76 (d, 2H), 5.21 (brm, H), 6.29 (brm, H), 7.52 (t, H), 8.31-8.32 (d, H), 8.34-8.35 (d, H).

MC, m/z=377 ЭРИ+[M+H]⁺, 377 ХИ [M+H]⁺

Получение 16: трет-бутил-{3-[(3-{5-[(25)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)амино]-3-оксопропил}карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя mpem-бутоксикарбониламино-пропионовую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (130 мг, 73%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.41 (s, 9H), 1.67-1.75 (m, H), 1.79-1.88 (m, 3Н), 1.91-2.00 (m, H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.37-2.40 (t, 2H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.04-3.08 (t, H), 3.20-3.30 (m, 3Н), 3.37-3.41 (q, 2H), 5.26 (brm, H), 6.00 (brm, H), 7.52 (t, H), 8.31-8.32 (d, H), 8.34 (d, H).

MC, m/z=391 ЭРИ+[М+Н]⁺, 391 ХИ [M+H]⁺

Получение 17: трет-бутил-{4-[(3-{5-[(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)амино]-4-оксобутил}карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя mpem-бутоксикарбониламино-бутановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (140 мг, 76%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.40 (s, 9H), 1.64-1.72 (m, H), 1.74-1.87 (m, 5H), 1.87-1.89 (m, H), 2.12-2.20 (m, 6H), 2.24-2.31 (q, H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.02-3.06 (t, H), 3.11-3.16 (q, 2H), 3.18-3.29 (m, 3Н), 4.91 (brm, H), 6.57 (brm, H), 7.51 (t, H), 8.30 (d, H), 8.32 (d, H).

MC, m/z=405 ЭРИ+[M+H]⁺, 405 ХИ [M+H]⁺

Получение 18: трет-бутил-12-(2-{2-1(3-{5-1(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)амино]-2-оксоэтокси}этокси)этил]карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя [2-(2-трет-бутоксикарбониламино-этокси)-этокси]-уксусную кислоту (полученную как описано в Angew. Chemie Int. Ed. (2006), 45(30), 4936-4940) вместо транс-4-mpem-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бесцветной смолы (60 мг, 28%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.42 (s, 9H), 1.67-1.98 (m, 7H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.64-2.68 (m, 2H), 3.04-3.09 (t, H), 3.21-3.26 (m, H), 3.29-3.37 (m, 3Н), 3.53-3.56 (t, 2H), 3.62-3.68 (m, 4H), 3.98 (s, 2H), 4.99 (brm, H), 6.88 (brm, H), 7.53 (t, H), 8.33 (d, H), 8.35 (d, H).

MC, m/z=465 ЭРИ+[M+H]⁺, 465 ХИ [M+H]⁺

Получение 19: трет-бутил-(2-{2-[(3-{5-[(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)амино]-2-оксоэтокси}этил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя (2-трет-бутоксикарбониламино-этокси)-уксусную кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (105 мг, 55%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.43(s, 9H), 2.16-2.24 (m, 5H), 2.31(q, 4H), 2.66(t, 1H), 3.07 (t, 2H), 3.24 (t, 1H), m, 1H), 3.32-3.37 (m, 4H), 3.56 (t, 2H), 3.94(s, 2H), 4.98 (br, 1H), 6.69 (br, 1H), 7.54 (t, 1H), 8.33-8.36 (m, 2H).

MC m/z=421 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 20: трет-бутил-{5-[(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)амино]-5-оксопентил}карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя трет-бутоксикарбониламино-пентановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (191 мг, 64%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.43 (s, 9H), 1.47-1.53 (m, 2H), 1.63-1.75 (m, 3Н), 1.80-1.89 (m, 4H), 1.94-2.05 (m, H), 2.16 (s, 3Н), 2.16-2.23 (m, 2H), 2.31 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.07 (t, H), 3.14-31.6 (m, 2H), 3.22-3.30 (m, 3Н), 5.30 (br. H), 5.80 (br, Н), 7.53 (t, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).

MC m/z=420 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 21: трет-бутил-{6-[(3-(5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил) амино]-6-оксогексил}карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя mpem-бутоксикарбониламино-гексановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (197 мг, 50%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.32-1.37 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.46-1.54 (m, 2H), 1.61-1.69 (m, 2H), 1.69-1.77 (m, H), 1.81-1.89 (m, 5H), 1.95-2.00 (m, H), 2.14-2.22 (m, 5H), 2.30 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.05-3.13 (m, 3Н), 3.22-3.33 (m, ³H), 4.62 (br, Н), 5.63 (br, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).

MC m/z=434 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 22: трет-бутил-{7-[(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)амино]-7-оксогептил}карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя трет-бутоксикарбониламино-гептановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (204 мг, 55%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.31-1.35 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.44-1.49 (m, 2H), 1.60-1.67 (m, 2H), 1.70-1.77 (m, H), 1.81-1.89 (m, 5H), 1.94-1.99 (m, H), 2.13-2.23 (m, 5H), 2.30 (q. H), 2.65 (t, 2H), 3.05-3.12 (m, 3H), 3.22-3.33 (m, 3H), 4.37 (br, H), 5.68 (br, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).

MC m/z=448 ЭРИ+[М+Н]⁺

Получение 23: трет-бутил-(22-{5-1(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}-15,18-диоксо-4,7,10-триокса-14,19-диазадокоз-1-ил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 13, используя N-(3-{2-[2-(3-трет-бутоксикарбониламино-ргорокси)-этокси]-этокси}-пропил)-сукцинамовую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (284 мг, 53%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.43 (s, 9H), 1.71-1.77 (m, 9H), 1.87-2.02 (m, 4H), 2.16-2.22 (m, 4H), 2.30 (q, Н), 2.63 (t, 2H), 3.06 (t, Н), 3.19-3.28 (m, 5H), 3.33-3.37 (m, 2H), 3.51-3.65 (m, 12H), 5.09 (Ьг, Н), 6.59 (br, Н), 6.64 (Ьг, Н), 7.52 (t, Н), 8.32 (m, Н), 8.35 (m, Н).

MC m/z=622 ЭРИ+[М+Н]⁺

Получение 24: транс-4-амино-N-(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)циклогексанкарбоксамид

Раствор трет-бутил-{транс-4-1(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)карбамоил]циклогексил}карбамата (Получение 13) (130 мг, 0,29 ммоль) в DCM (3 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (1 мл). Полученный раствор перемешивали при температуре окружающей среды в течение 2 часов, после чего его концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в МеОН, наносили на картридж SCX-2 и элюировали МеОН, затем раствором аммиака в МеОН (2М). Фракции, содержащие продукт, концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветной смолы (98 мг, 97%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.02-1.12 (m, 2H), 1.45-1.76 (m, 5H), 1.77-2.03 (m, 9H), 2.12-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (q, Н), 2.59-2.68 (m, ³H), 3.02-3.06 (t, Н), 3.19-3.29 (m, ³H). 5.66 (br, Н), 7.49 (t, H), 8.29 (d, H), 8.33 (d, H).

MC, m/z=345 и 367 ЭРИ+[М+Н]⁺ и [M+Na]⁺, 345 ХИ [M+H]⁺

Получение 25: 1-амино-N-(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-амид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 14, в виде бесцветной смолы (149 мг, 100%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.64-1.75 (m, H), 1.77-1.99 (m, 7H), 2.12-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (q, H), 2.44-2.46 (t, 2H), 2.60-2.64 (t, 2H), 2.82-2.85 (t, 2H), 3.02-3.06 (t, H). 3.19-3.29 (m, 3H), 3.47-3.50 (t, 2H), 3.59-3.61 (m, 11H), 3.69-3.72 (t, 2H), 6.76 (brm, H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H), 8.33 (d, H).

MC, m/z=467 и 489 ЭРИ+[M+H]⁺ и [M+Na]⁺, 467 ХИ [М+Н]⁺

Получение 26: N-(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)глицинамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 15, в виде бесцветной смолы (99 мг, 100%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.66-2.01 (m, 7H), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.62-2.66 (t, 2H), 3.05-3.09 (t, H), 3.21-3.26 (t, H), 3.29-3.34 (m, 4H), 7.35 (brm, H), 7.53 (t, H), 8.32 (d, H), 8.33-8.34 (d, H).

MC, m/z=277 и 291 ЭРИ+[M+H]⁺ и [М+Na]⁺, 277 ХИ [М+Н]⁺

Получение 27: N-(3-{5-1(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)-бета-аланинамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 16, в виде бесцветной смолы (99 мг, 100%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.65-1.76 (m, Н), 1.77-2.00 (m, 6Н), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.26-2.32 (m, 3H), 2.62-2.66 (t, 2H), 2.98-3.01 (t, 2H), 3.03-3.08 (t, 2H) 3.20-3.31 (m, ³H), 7.26 (brm, H), 7.51 (t, H) 8.31-8.32 (d, H), 8.33-8.34 (d, H).

MC, m/z=291 и 313 ЭРИ+[М+Н]⁺ и [M+Na]⁺, 291 ХИ [M+H]⁺

Получение 28: 4-амино-N-(3-(5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)бутанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 17, в виде бесцветной смолы (104 мг, 99%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.65-2.00 (m, 9H), 2.13-2.32 (m, 7H), 2.61-2.65 (t, 2H), 2.72-2.76 (t, 2H) 3.03-3.07 (t, H) 3.20-3.30 (m, ³H), 6.22 (brm, H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H) 8.33-8.34 (d, H).

MC, m/z=305 и 327 ЭРИ+[M+H]⁺ и [M+Na]⁺, 305 ХИ [М+Н]⁺

Получение 29: 2-12-(2-аминоэтокси)этокси]-N-(3-{5-[(25)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)ацетамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 18, в виде бесцветной смолы (49 мг, 100%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.67-1.78 (m, H), 1.79-2.02 (m, 4H), 2.15-2.34 (m, 7H), 2.64-2.67 (t, 2H), 2.88-2.91 (t, 2H), 3.06-3.10 (t, 1H), 3.22-3.27 (t, 1H), 3.31-3.36 (q, 2H), 3.54-3.57 (t. 2H), 3.63-3.70 (m, 4H), 3.99 (s, 2H), 7.02 (dm, 2H), 7.54 (t, H), 8.33-8.34 (d, H), 8.35 (d, H).

MC, m/z=365 и 387 ЭРИ+[М+Н]⁺ и [M+Na]⁺. 365 ХИ [М+Н]⁺

Получение 30: 2-(2-аминоэтокси)-N-(3-{5-[(28)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил} пропил)ацетамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 19, в виде бледно-желтой смолы (87 мг, 100%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.70-1.97 (m, 6H), 2.17 (s, 3Н), 2.18-2.23 (m, H), 2.31 (q, H), 2.67 (t, 2H), 2.94 (m, 2H), 3.08 (t, H), 3.26 (m, H), 3.35 (q, 2H), 3.56 (t, 2H), 3.98 (s, 2H), 7.35 (br, H), 7.55 (t, H), 8.34 (d, H), 8.35 (d, H).

MC, m/z=321 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 31: 5-амино-N-(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)пентанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 20, в виде бледно-желтой смолы (78 мг, 54%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.46-1.52 (m, H), 1.64-1.72 (m, 3Н), 1.81-2.02 (m, 7H), 2.15-2.24 (m, 5H), 2.31 (q, H), 2.65 (t, 2H), 2.72 (t, H), 3.07 (t, H), 3.20-3.32 (m, 4H), 5.79 (br. H), 6.25 (br, H), 7.53 (s, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).

MC, m/z=319 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 32: 6-амино-N-(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)гексанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 21, в виде бледно-желтой смолы (70 мг, 46%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.32-1.41 (m, 2H), 1.50-1.57 (m, H), 1.59-1.70 (m, 4H), 1.81-1.85 (m, ³H), 1.87-2.01 (m, 2H), 2.15 (s, 3Н), 2.15-23 (m, ³H), 2.30 (q, H), 2.63 (t, 2H), 2.765 (t, H), 3.06 (t, H), 3.19-2.29 (m, ³H).

MC, m/z=333 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 33: 7-амино-N-(3-{5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)гептанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 22, в виде бледно-желтой смолы (59 мг, 37%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.32-1.29 (m, 3Н), 1.46-1.50 (m, H), 1.61-1.66 (m, 2H), 1.70-1.74 (m, H), 1.82-1.89 (m, 3Н), 1.94-2.04 (m, 3Н), 2.17 (s, 3Н), 2.15-2.23 (m, ³H), 2.32 (q, H), 2.65 (t, 2H), 2.71 (t, H), 3.08 (t, H), 3.18-3.33 (m, 4H), 5.58 (br, H), 5.65 (br, H), 7.53 (d, H), 8.34 (m, H), 8.36 (m, H).

MC, m/z=347 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 34: N-(3-{2-[2-(3-аминоргорокси)этокси]этокси}пропил)-N'-(3-{5-[(2S)-1-метил пирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}пропил)сукцинамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 24, начиная с соединения Получения 23, в виде бледно-желтой смолы (120 мг.51%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.71-1.87 (m, 6H), 1.90-2.02 (m, H), 2.16 (s, 3Н), 2.17-2.24 (m, H), 2.30 (q, H), 2.40-2.51 (m, 6H), 2.61-2.67 (m, 2H), 2.87 (t, 2H), 3.22-3.29 (m, 3Н), 3.31 (q, 2H), 3.51-3.65 (m, 12H), 6.85 (br, H), 6.95 (br, H), 7.53 (s, H), 8.33 (m, H). 8.35 (m, H).

MC, m/z=522 ЭРИ+[M+H]⁺

Получение 35: трет-бутил-(транс-4-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси) этил]карбамоил}циклогексил)карбамат

Раствор 2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этанамина (Получение 12) (55 мг, 0,25 ммоль) в 2-метилтетрагидрофуране (2 мл) обрабатывали при перемешивании транс-4-mpem-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислотой (91 мг, 0,373 ммоль), затем Т₃Р (317 мкл, 0,498 ммоль) и Et₃N (118 мкл, 0,91 ммоль). После перемешивания в течение 3 часов раствор обрабатывали ТзР (69 мкл, 0,498 ммоль). После перемешивания в течение 18 часов раствор концентрировали в вакууме, и остаток переносили в МеОН и наносили на картридж SCX-2, который элюировали метанолом, затем раствором аммиака в МеОН (примерно 2М). Фракции, содержащие продукт, концентрировали в вакууме, и остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью EtOAc:МеОН:NH₃ (градиент от 1:0:0 до 90:10:1). Это вещество затем растворяли в DCM и обрабатывали PS-изоцианатной смолой в течение 3 часов, затем фильтровали и упаривали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтой смолы (35 мг, 35%);

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.14-1.25 (m, 2H), 1.42 (d, 9H), 1.47-1.58 (m, 2H), 1.75-1.85 (m, 3H), 1.87-2.06 (m, 4H), 2.09-2.18 (m, 1H), 2.21 (s, 3H), 2.23-2.32 (m, 1H), 2.38-2.45 (q, 1H), 3.24-3.29 (m, 3H), 3.55-3.58 (t,2H), 4.11-4.14 (t, 2H), 7.45-7.43 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.15-8.16 (d, 1H).

MC m/z=447 ЭРИ+[М+Н]⁺, 447 ХИ [М+Н]⁺

Получение 36: трет-бутил-{2-[2-(2-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]амино}-2-оксоэтокси)этокси]этил}карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя [2-(2-трет-бутоксикарбониламино-этокси)-этокси]-уксусную кислоту (полученную, как описано в Angew. Chemie Int. Ed. (2006), 45(30), 4936-4940) вместо транс-4-mpem-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (50 мг, 43%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.41 (s, 9H), 1.72-1.81 (m, 1H), 1.84-2.01 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 1H), 2.33-2.40 (q, 1H), 3.16-3.26 (m, 4H), 3.50-3.52 (t, 2H), 3.62-3.69 (m, 6H), 4.01 (s, 2H), 4.16-4.19 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.15-8.16 (d, 1H).

MC m/z=467 ЭРИ+[M+H]⁺, 467 ХИ [M+H]⁺

Получение 37: трет-бутил-(2-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил] амино}-2-оксоэтил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя mpem-бутоксикарбониламино-уксусную кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (50 мг, 53%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.42 (s, 9H), 1.87-2.09 (m, 3H), 2.30-2.38 (m, 4H), 2.60-2.67 (q, 1H), 3.37-3.43 (brt, 1H), 3.52-3.56 (brt, 1H), 3.61-3.64 (t, 2H), 3.70 (s, 2H), 4.14-4.17 (t, 2H), 7.49-7.50 (m, 1H), 8.14-8.15 (d, 1H), 8.20-8.21 (d, 1H).

MC m/z=379 ЭРИ+[М+Н]⁺, 379 ХИ [M+H]⁺

Получение 38: трет-бутил-(3-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]амино}-3-оксопропил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя трет-бутоксикарбониламино-пропионовую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (70 мг, 72%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.39 (s, 9H), 1.75-1.84 (m, 1H), 1.87-2.04 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 2.23-2.31 (m, 1H), 2.37-2.47 (m, 3H), 3.24-3.33 (m, 4H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.12-4.15 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1H), 8.10-8.11 (d, 1H), 8.16-8.17 (d, 1H).

MC m/z=393 ЭРИ+[M+H]⁺, 393 ХИ [M+H]⁺

Получение 39: трет-бутил-(4-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]амино}-4-оксобутил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя трет-бутоксикарбониламино-бутановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (43 мг, 42%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.41 (s, 9H), 1.70-1.78 (m, 2H), 1.96-2.12 (m, 3H), 2.21-2.24 (t, 2H), 2.33-2.42 (m, 4H), 2.69-2.76 (q, 1H), 3.02-3.07 (m, 2H), 3.43-3.49 (brt, 1H), 3.58-3.61 (t, 2H), 3.64-3.69 (brt, 1H), 4.15-4.18 (t, 2H), 7.51-7.52 (m, 1H), 8.16-8.17 (d, 1H), 8.23-8.24 (d, 1H).

MC m/z=407 ЭРИ+[М+Н]⁺, 407 ХИ [М+Н]⁺

Получение 40: трет-бутил-(5-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил] амино}-5-оксопентил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя трет-бутоксикарбониламино-пентановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (49 мг, 47%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₂) δ=1.41-1.50 (m, 11H), 1.57-1.65 (m, 2H), 2.01-2.18 (m, 3H), 2.20-2.24 (t, 2H), 2.37-2.44 (m, 1H), 2.46 (s, 3H), 2.78-2.85 (q, 1H), 3.00-3.05 (m, 2H), 3.49-3.55 (m, 1H), 3.58-3.61 (t, 2H), 3.76-3.80 (brt, 1H), 4.15-4.16 (t, 2H), 7.55-7.56 (m, 1H), 8.18-8.19 (d, 1H), 8.25-8.26 (d, 1H).

MC m/z=421 ЭРИ+[M+H]⁺, 421 ХИ [М+Н]⁺

Получение 41: трет-бутил-(6-{[2-({5-[(2Ы)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]амино}-6-оксогексил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя трет-бутоксикарбониламино-гексановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (65 мг, 60%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.29-1.35 (m, 2H), 1.42-1.49 (m, 11H), 1.57-1.65 (m, 2H), 2.05-2.15 (m, 3H), 2.19-2.23 (t, 2H), 2.38-2.46 (m, 1H), 2.48 (s, 3H), 2.82-2.89 (m, 1H), 2.96-3.00 (t, 2H), 3.53-3.61 (m, 3H), 3.62-3.66 (brt, 1H), 4.15-4.18 (t, 2H), 7.55-7.56 (m, 1H), 8.19-8.20 (d, 1H), 8.26-8.27 (d, 1H).

MC m/z=435 ЭРИ+[М+Н]⁺, 435 ХИ [М+H]⁺

Получение 42: трет-бутил-(7-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]амино}-7-оксогептил)карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя трет-бутоксикарбониламино-гептановую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (67 мг, 60%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.28-1.34 (m, 4H), 1.39-1.45 (m, 11H), 1.55-1.64 (m, 2H), 2.03-2.15 (m, 3H), 2.19-2.22 (t, 2H), 2.38-2.46 (m, 1H), 2.48 (s, 3H), 2.81-2.88 (m, 1H), 2.97-3.00 (t, 2H), 3.51-3.57 (m, 1H), 3.58-3.61 (t, 2H). 3.80-3.84 (m, 1H), 4.15-4.18 (t, 2H), 7.55-7.57 (m, 1H), 8.19 (d, 1H), 8.16 (d, 1H).

MC m/z=449 ЭРИ+[М+Н]⁺, 449 ХИ [М+Н]⁺

Получение 43: трет-бутил-[2-(2-{[2-({5-[(23)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]амино}-2-оксоэтокси)этил]карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя (2-трет-бутоксикарбониламино-этокси)-уксусную кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде бледно-желтой смолы (42 мг, 42%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.42 (s, 9H), 2.15-2.32 (m, 3H), 2.43-2.52 (s, 1H), 2.61 (s, 3H), 3.03-3.10 (m, 1H), 3.24-3.29 (m, 2H), 3.52-3.55 (t, 2H), 3.66-3.69 (m, 3H), 3.98 (s, 2H), 4.06-4.13 (m, 1H), 4.21-4.24 (t, 2H), 7.62-7.63 (m, 1H), 8.24 (d, 1H), 8.32-8.33 (d, 1H).

MC m/z=423 ЭРИ+[М+Н]⁺, 423 ХИ [М+Н]⁺

Получение 44: трет-бутил-[21-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)-15,18-диоксо-4,7,10-триокса-14,19-диазагеникоз-1-ил]карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя N-(3-{2-[2-(3-трет-бутоксикарбониламино-пропокси)-этокси]-этокси}-пропил)-сукцинамовую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде оранжевой смолы (80 мг, 51%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.42 (s, 9H), 1.68-1.76 (m, 4H), 1.97-2.15 (m, 3H), 2.35-2.52 (m, 9H), 2.71-2.80 (m, 1H). 3.09-3.14 (m, 2H), 3.20-3.26 (m, 2H), 3.48-3.51 (t, 5H), 3.55-3.64 (m, 10H), 3.66-3.76 (m, 1H), 4.14-4.17 (t, 2H), 7.53-7.54 (m, 1H), 8.17-8.18 (d, 1H), 8.24-8.25 (d, 1H).

MC m/z=625 ЭРИ+[M+H]⁺, 625 ХИ [M+H]⁺

Получение 45: трет-бутил-[18-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)-15-оксо-3,6,9,12-тетраокса-1 6-азаоктадец-1 -ил]карбамат

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 35, используя 3-(2-{2-[2-(2-трет-бутоксикарбониламино-этокси)-этокси]-этокси}-этокси)-пропионовую кислоту вместо транс-4-трет-бутоксикарбонил-циклогексанкарбоновой кислоты, в виде оранжевой смолы (80 мг, 56%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.42 (s, 9H), 2.03-2.20 (m, 3H), 2.38-2.50 (m, 6H), 2.85-2.91 (m, 1H), 3.19-3.22 (m, 2H), 3.47-3.50 (t, 2H), 3.53-3.63 (m, 15H), 3.71-3.74 (t, 2H), 3.84-3.92 (m, 1H), 4.17-4.19 (t, 2H), 7.58-7.59 (m, 1H), 8.20-8.21 (d, 1H), 8.28(d, 1H).

MC m/z=570 ЭРИ+[M+H]⁺, 570 ХИ [М+Н]⁺

Получение 46: транс-4-амино-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]циклогексанкарбоксамид

Раствор трет-бутил-(транс-4-{[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]карбамоил}циклогексил)карбамата (Получение 35) (35 мг, 0,078 ммоль) в DCM (3 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (1 мл). Полученный раствор перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи, после чего его концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в МеОН, наносили на картридж SCX-2 и элюировали МеОН, затем раствором аммиака в МеОН (2М). Фракции, содержащие продукт, концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевой смолы (17 мг, 62%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.16-1.26 (m, 2H), 1.47-1.57 (m, 2H), 1.71-2.01 (m, 8H), 2.13-2.30 (m, 4H), 2.33-2.40 (q, 1H), 2.68-2.76 (m, 1H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.56-3.59 (t, 2H), 4.12-4.14 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1H), 8.09-8.10 (d, 1H), 8.14-8.15 (d, 1H).

MC m/z=347 ЭРИ+[М+H]⁺, 347 ХИ [M+H]⁺

Получение 47: 2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]ацетамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 36, в виде оранжевой смолы (37 мг, 95%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.72-1.81 (m, 1H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s,³H), 2.22-2.30 (m, 1H), 2.34-2.41 (q, 1H), 2.83-2.86 (t, 2H), 3.19-3.26 (m, 2H), 3.54-3.57 (t, 2H), 3.65-3.71 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 4.16-4.19 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1H), 8.10-8.11 (d, 1H), 8.15 (d, 1H).

MC m/z=367 ЭРИ+[M+H]⁺, 367 ХИ [М+Н]⁺

Получение 48: N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]глицинамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 37, в виде оранжевой смолы (37 мг, 100%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.74-1.84 (m, 1H), 1.87-2.05 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.23-2.32 (m, 1H), 2.38-2.44 (q, 1H), 3.23-3.28 (m, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.63-3.66 (t, 2H), 4.15-4.17 (t, 2H), 7.45-7.47 (m, 1H), 8.10-8.11 (d, 1H), 8.15-8.16 (d, 1H).

MC m/z=279 ЭРИ+[М+Н]⁺, 279 ХИ [M+H]⁺

Получение 49: N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]-бета-аланинамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 38, в виде оранжевой смолы (52 мг, 100%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.72-1.81 (m, 1H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 1H), 2.33-2.44 (m, 3H), 2.93-2.96 (t, 2H), 3.16-3.26 (m, 2H), 3.60-3.62 (t, 2H), 4.13-4.16 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.14-8.15 (d, 1H).

MC m/z=293 ЭРИ+[M+H]⁺, 293 ХИ [M+H]⁺

Получение 50: 4-амино-N-12-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]бутанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с Получения 39, в виде оранжевой смолы (28 мг, 88%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.73-1.82 (m, 3H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 3H), 2.33-2.40 (q,1H), 2.68-2.72 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.12-4.15 (t, 2H) 7.43-7.44 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.14-8.15 (d, 1H).

MC m/z=307 ЭРИ+[М+Н]⁺, 307 ХИ [М+Н]⁺

Получение 51: 5-амино-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]пентанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 40, в виде оранжевой смолы (30 мг, 81%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.48-1.56 (m, 2H), 1.61-1.68 (m, 2H), 1.71-1.81 (m, 1H), 1.85-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.22-2.30 (m, 3H), 2.33-2.40 (q, 1H), 2.68-2.72 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.12-4.15 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.14-8.15 (d, 1H).

MC m/z=321 ЭРИ+[М+Н]⁺, 321 ХИ [М+H]⁺

Получение 52: 6-амино-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]гексанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 41, в виде оранжевой смолы (38 мг, 76%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.31-1.39 (m, 2H), 1.48-1.55 (m, 2H), 1.59-1.66 (m, 2H), 1.72-1.81 (m, 1H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 3H), 2.33-2.40 (q, 1H), 2.65-2.69 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.57-3.60 (t, 2H), 4.15-4.12 (t, 2H), 7.43-7.44 (m,1H). 8.09-8.10 (d, 1H), 8.14-8.15 (d, 1H).

MC m/z=335 ЭРИ+[M+H]⁺, 335 ХИ [М+H]⁺

Получение 53: 7-амино-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]гептанамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 42, в виде оранжевой смолы (37 мг, 72%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.32-1.37 (m, 4H), 1.44-1.51 (m, 2H), 1.57-1.65 (m, 2H), 1.72-1.82 (m, 1H), 1.83-2.03 (m, 2H), 2.18-2.30 (m, 6H), 2.33-2.40 (q, 1H), 2.65-2.68 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.57-3.60 (t, 2H), 4.12-4.15 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1H), 8.09-8.10 (d,1H), 8.14-8.15 (d, 1H).

MC m/z=349 ЭРИ+[М+Н]⁺, 349 ХИ [М+H]⁺

Получение 54: 2-(2-аминоэтокси)-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]ацетамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 43, в виде оранжевой смолы (27 мг, 84%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.72-1.82 (m, 1H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.22-2.30 (m, 1H), 2.34-2.40 (q, 1H), 2.86-2.89 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.55-3.58 (t, 2H), 3.66-3.68 (t, 2H), 4.00 (s, 2H), 4.16-4.19 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.15 (d, 1H).

MC m/z=323 ЭРИ+[М+Н]⁺, 323 ХИ [М+Н]⁺

Получение 55: N-(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропил)-N'-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]сукцинамид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 44, в виде оранжевой смолы (59 мг, 88%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.70-1.80 (m, 5H), 1.86-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 1H), 2.33-2.40 (q, 1H), 2.44-2.52 (m, 4H), 2.76-2.80 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 4H), 3.48-3.51 (t, 2H), 3.55-3.63 (m, 12H), 4.11-4.14 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.15 (d, 1H).

MC m/z=524 ЭРИ+[M+H]⁺, 524 ХИ [М+H]⁺

Получение 56: 1-амино-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-амид

Указанное в заголовке соединение было получено общим способом, описанным выше для Получения 46, начиная с соединения Получения 45, в виде оранжевой смолы (55 мг, 85%).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ=1.71-1.81 (m, 1H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.22-2.30 (m, 1H), 2.33-2.40 (q, 1H), 2.45-2.48 (t, 2H), 2.78-2.80 (t, 2H), 3.18-3.25 (m, 2H), 3.50-3.53 (t, 2H), 3.58-3.62 (m, 14H), 3.71-3.74 (t, 2H), 4.13-4.15 (t, 2H), 7.44-7.45 (m,1H), 8.10 (d, 1H), 8.15-8.16 (d, 1H).

MC m/z=469 ЭРИ+[M+H]⁺, 469 ХИ [M+H]⁺

Получение 57: 4-меркапто-N-[2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этил]бутанамид

Раствор 2-({5-[(2S)-1-метилпирролидин-2-ил]пиридин-3-ил}окси)этанамина (Получение 12) (1100 мг, 4,971 ммоль) в воде (10 мл) обрабатывали у-тиобутиролактоном (861 мкл, 9,94 ммоль), и реакционную смесь нагревали до 60°С в течение ночи. Затем смесь упаривали в вакууме до остатка в виде бесцветной смолы, который адсорбировали на силикагель из МеОН. Его затем подвергали хроматографии на колонке ISCO, 40 г, элюируя от EtOAc до EtOAc:МеОН:NH₃ 80:20:1. Соответствующие фракции упаривали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветной смолы, 690 мг. Выход=43%.

¹H ЯМР (400 МГц, CD₃OD): δ=1.77-2.06 (m, 6H), 2.22-2.35 (m, 6H), 2.41-2.51 (m, 3H), 3.26-3.32 (m, H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.13-4.15 (t, 2H), 7.45-7.47 (m, H), 8.11-8.12 (d,H), 8.17 (d,H).

MC m/z=324 ЭРИ+[М+Н]⁺ и 322 ХИ- [М-Н]^-

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Гаптен из Получения 4 связывали с белком дифтерийного анатоксина в соответствии с описанной ниже методикой.

а) Гаптен получали в виде желтого масла и хранили при 2-8°С до дня использования (в течение вплоть до одной недели; более длительное хранение осуществляли при -20°С). Это масло растворяли либо в забуференном фосфатами физиологическом растворе, модифицированном по Дульбекко, без Са или Mg (DPBS), либо в деионизированной воде в концентрации 50 мг гаптена на мл раствора. В результате получали желто-коричневую суспензию или раствор.

б) Отдельно получали аликвоту концентрированного дифтерийного анатоксина (DT) и, используя гель-фильтрационную обессоливающую колонку (Bio-Rad), буфер DT заменяли на DPBS. Элюат из колонки представлял собой 4 мл раствора в концентрации приблизительно 11 мг/мл по результатам анализа методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий, Pierce Chemical) с использованием стандартной кривой для бычьего сывороточного альбумина. Аликвоту этого раствора разбавляли дополнительным количеством DPBS с получением 4 мл раствора в концентрации 5 мг/мл белка в DPBS.

в) Эту аликвоту DT подвергали взаимодействию с ангидридом янтарной кислоты для создания модифицированного сукцинилированного дифтерийного анатоксина. Аликвоту 4 мл DT в DPBS объединяли с 80 мг ангидрида янтарной кислоты в виде твердого вещества и помещали на вращатель пробирок для обеспечения спокойного перемешивания при комнатной температуре в течение 3 ч. Было отмечено, что с использованием этого метода конечный продукт не представлял собой прозрачный раствор. По окончании 3-часового периода времени реакции аликвоту наносили на гель-фильтрационную обессоливающую колонку и элюировали в DPBS для удаления непрореагировавших компонентов с молекулами небольшого размера. Это увеличивало объем образца в сумме до 6 мл.

г) 28 мг сульфо-N-гидроксисукцинимида (s-NHS) в виде твердого вещества добавляли к аликвоте 6 мл сукцинилированного DT, и оставляли s-NHS растворяться с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. Затем к смеси добавляли 28 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) в виде твердого вещества и обеспечивали его растворение с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. Реакционную смесь (сукцинилированный DT/EDC/s-NHS) инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, добавляли 200 мкл раствор гаптена, приготовленного ранее, и реакционную смесь недолго перемешивали с использованием Vortex для смешивания.

д) Смесь подвергали взаимодействию в течение 3-4 ч при спокойном перемешивании на вращателе пробирок при комнатной температуре. По окончании периода времени реакции аликвоту наносили на гель-фильтрационную обессоливающую колонку и элюировали в DPBS для удаления непрореагировавших компонентов, имеющих молекулы небольшого размера. Это увеличивало объем образца в сумме до 8 мл. Эти 8 мл элюата затем концентрировали с использованием центрифужных ультрафильтров 3k MWCO (Millipore) до приблизительно 3,0-3,5 мл.

е) С использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта конечный конъюгат анализировали на содержание белка с использованием анализа методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий Pierce), и конечную концентрацию определяли как 2,3 мг/мл. Конъюгат анализировали на включение гаптена с использованием ультрафиолетовой спектроскопии в области 250-270 нм против неконъюгированного контроля, нормированного в отношении содержания белка, и было обнаружено более сильное поглощение в этой области по сравнению с нативным анатоксином. Конъюгат также анализировали методом SDS-PAGE электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и в отношении содержания эндотоксина с использованием LAL-теста (LAL = лизат клеток крови краба). В конце 100 мкг образца конъюгата подвергали гидролизу и анализировали с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) для определения количества включенных гаптенов на молекулу белка. Было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 19 гаптенов на мономер белка.

ж) В конце образец подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкм шприцевой фильтр и асептически делили на аликвоты по 0,5 мл. Эти асептические аликвоты хранили при -80°С до отправки к месту исследования на сухом льду.

Пример 2. Гаптен из Получения 12 связывали с белком дифтерийного анатоксина с использованием общей методики, описанной выше в Примере 1, со следующими изменениями: на стадии (г) 186 мкл раствора гаптена добавляли в реакционную смесь; и на стадии (е) конечную концентрацию определяли как 3,3 мг/мл, и было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 13 гаптенов на мономер белка.

Пример 3. Гаптен из Получения 7 связывали с белком дифтерийного анатоксина с использованием общей методики, описанной выше в Примере 1, со следующими изменениями на стадиях с, е и f.

На стадии (в) порцию 3 мл аликвоты наносили на гель-фильтрационную обессоливающую колонку и элюировали в DPBS для удаления непрореагировавших компонентов, имеющих молекулы небольшого размера, в результате чего объем очищенного образца увеличивался в сумме до 4 мл. Стадию (г) выполняли следующим образом: 80 мкл раствора гаптена добавляли к аликвоте 4 мл сукцинилированного DT и спокойно переворачивали для смешивания. Затем в смесь добавляли 28 мг сульфо-N-гидроксисущинимида (s-NHS) в виде твердого вещества и обеспечивали его растворение с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. В конце в смесь добавляли 28 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) в виде твердого вещества и оставляли растворяться, переворачивая пробирку и спокойно смешивая.

На стадии (д) смесь подвергали взаимодействию в течение 2 ч, после элюирования объем образца конъюгата в сумме увеличивался до 6 мл, и 6 мл элюата затем концентрировали с использованием центрифужных ультрафильтров 10k MWCO (Millipore) до приблизительно 2,5-3,0 мл.

На стадии (е) конечную концентрацию определяли как 2,4 мг/мл, и было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 14,5 гаптенов на мономер белка.

Пример 4. Гаптен из Получения 8 связывали с белком дифтерийного анатоксина с использованием общей методики, описанной выше в Примере 1, со следующими изменениями: стадию (г) выполняли следующим образом: 120 мкл раствора гаптена добавляли к аликвоте 6 мл сукцинилированного DT. Смесь быстро перемешивали на Vortex. Затем добавляли 28 мг сульфо-N-гидроксисукцинимида (s-NHS) в виде твердого вещества и обеспечивали его растворение с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. В конце в смесь добавляли 28 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) в виде твердого вещества и обеспечивали его растворение с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания; и на стадии (е) конечную концентрацию определяли как 2,5 мг/мл, и было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 19,3 гаптенов на мономер белка.

Пример 5. Конъюгаты гаптен-спейсер из Получений 24-34 и 46-56 связывали с белком дифтерийного анатоксина, как описано ниже.

а) Конъюгаты гаптен-спейсер получали в виде желтого масла и хранили при температуре от 2 до 8°С до дня использования (в течение вплоть до одной недели; более длительное хранение осуществляли при -20°С). Это масло растворяли в забуференном фосфатами физиологическом растворе, модифицированном по Дульбекко, без Са или Mg (DPBS), в концентрации 50 мг гаптена на мл раствора. В результате получали желто-коричневую суспензию или раствор. Продукт из Получения 33 полностью не растворялся в деионизированной воде, и поэтому его дополнительно растворяли в 50% метаноле до конечной концентрации 25 мг конъюгата гаптен-спейсер на мл раствора.

б) Отдельно получали аликвоту концентрированного дифтерийного анатоксина (DT) и, используя гель-фильтрационную обессоливающую колонку (Bio-Rad), буфер DT заменяли на DPBS. Элюат из колонки представлял собой 4 мл раствора в концентрации приблизительно 11 мг/мл, как определено анализом методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий, Pierce Chemical) с использованием стандартной кривой для бычьего сывороточного альбумина. Аликвоту этого элюата разбавляли дополнительным количеством DPBS с получением 2 мл раствора в концентрации 5 мг/мл белка в DPBS.

в) Эту аликвоту DT подвергали взаимодействию с ангидридом янтарной кислоты для создания модифицированного сукцинилированного дифтерийного анатоксина. Аликвоту 2 мл DT в DPBS объединяли с 40 мг ангидрида янтарной кислоты в виде твердого вещества и помещали на вращатель пробирок для обеспечения спокойного перемешивания при комнатной температуре в течение 3 часов. Было отмечено, что при использовании этого способа конечный продукт не являлся прозрачным раствором. По окончании 3-часового периода времени реакции аликвоту наносили на гель-фильтрационную обессоливающую колонку и элюировали в DPBS для удаления непрореагировавших компонентов, имеющих молекулы небольшого размера. Это увеличивало объем образца в сумме до 3 мл.

г) 9 мг сульфо-N-гидроксисукцинимида (s-NHS) в виде твердого вещества добавляли к аликвоте 3 мл DT и обеспечивали растворение s-NHS с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. Затем в смесь добавляли 9 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) в виде твердого вещества, и обеспечивали его растворение с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. 50 мкл раствора конъюгата гаптен-спейсер раствор, полученного выше (100 мкл для соединения Получения 33) добавляли в реакционную смесь (сукцинилированный DT/EDC/s-NHS).

д) Смесь подвергали взаимодействию в течение 3-4 часов при спокойном перемешивании на вращателе пробирок при комнатной температуре. По окончании периода времени реакции аликвоту наносили на гель-фильтрационную обессоливающую колонку и элюировали в DPBS для удаления непрореагировавших компонентов, имеющих молекулы небольшого размера. Это увеличивало объем образца конъюгата в сумме до 4 мл.

е) С использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина конечный конъюгат анализировали на содержание белка с использованием анализа методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий), и определяли конечную концентрацию, которая указана в Таблице 1. Конъюгат анализировали в отношении включения гаптена с использованием ультрафиолетовой спектроскопии в области от 250 до 270 нм против неконъюгированного контроля, нормированного в отношении содержания белка, и было обнаружено более сильное поглощение в этой области по сравнению с нативным анатоксином. Конъюгат также анализировали методом SDS-PAGE электрофореза и в отношении содержания эндотоксина с использованием LAL-теста. В конце 100 мкг образца конъюгата подвергали гидролизу и анализировали с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ для определения количества включенных гаптенов на молекулу белка. Гаптеновая нагрузка для протестированных образцов конкретно указана ниже в Таблицах 1 и 2.

ж) В конце образец подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкм шприцевой фильтр и асептически делили на аликвоты по 1,0 мл. Эти асептические аликвоты хранили при -80°С до отправки к месту исследования на сухом льду.

Таблица 1
Конъюгат	Концентрация белка (мг/мл)	Гаптеновая нагрузка
DT-гаптен-спейсер Получение 24	1,69	11
DT-гаптен-спейсер Получение 25	1,82	21
DT-гаптен-спейсер Получение 26	1,84	22
DT-гаптен-спейсер Получение 27	2,22	16
DT-гаптен-спейсер Получение 28	1,91	16
DT-гаптен-спейсер Получение 29	1,60	19
DT-гаптен-спейсер Получение 30	1,81	14
DT-гаптен-спейсер Получение 31	2,18	15
DT-гаптен-спейсер Получение 32	1,62	15
DT-гаптен-спейсер Получение 33	1,51	11
DT-гаптен-спейсер Получение 34	1,78	14

Таблица 2
Конъюгат	Концентрация белка (мг/мл)	Гаптеновая нагрузка 4
DT-гаптен-спейсер Получение 46	1,39	3,6
DT-гаптен-спейсер Получение 47	1,56	23,6
DT-гаптен-спейсер Получение 48	1,43	22,8
DT-гаптен-спейсер Получение 49	1,41	19,2
DT-гаптен-спейсер Получение 50	1,58	19,7
DT-гаптен-спейсер Получение 51	1,48	14,2
DT-гаптен-спейсер Получение 52	1,57	11
DT-гаптен-спейсер Получение 53	1,60	12,1
DT-гаптен-спейсер Получение 54	1,89	29,3
DT-гаптен-спейсер Получение 55	1,32	12,6
DT-гаптен-спейсер Получение 56	1,45	20,9

Пример 6. Гаптены с реакционноспособной аминогруппой также могут быть конъюгированы с дифтерийным анатоксином без добавления ангидрида янтарной кислоты. Пример гаптена из Получения 12, конъюгированного с дифтерийным анатоксином, подробно изложен ниже, но это также может быть осуществлено с продуктами из Получений 4, 7, 8, 24-34 и 46-56.

а) Гаптен получали в виде желтого масла и хранили при температуре от 2 до 8°С до дня использования (в течение вплоть до одной недели; более длительное хранение осуществляли при -20°С). Это масло растворяли в забуференном фосфатами физиологическом растворе, модифицированном по Дульбекко, без Са или Mg (DPBS), при концентрации 50 мг гаптена на мл раствора. В результате получали желто-коричневую суспензию или раствор.

б) Отдельно получали аликвоту концентрированного дифтерийного анатоксина (DT) и, используя гель-фильтрационную обессоливающую колонку (Bio-Rad), буфер DT заменяли на DPBS. Элюат из колонки представлял собой 4 мл раствора в концентрации приблизительно 11 мг/мл, как определено анализом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий, Pierce Chemical) с использованием стандартной кривой для бычьего сывороточного альбумина. Аликвоту этого элюата разбавляли дополнительным количеством DPBS с получением 2 мл раствора в концентрации 5 мг/мл белка в DPBS.

в) 9 мг сульфо-N-гидроксисукцинимида (s-NHS) в виде твердого вещества добавляли к аликвоте 2 мл DT и обеспечивали растворение s-NHS с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. Затем в смесь добавляли 9 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) в виде твердого вещества и обеспечивали его растворение с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. 50 мкл полученного ранее раствора конъюгата гаптен-спейсер добавляли в реакционную смесь (DT/EDC/s-NHS). На этой стадии рН доводили до значения рН 5,6 добавлением по каплям 1М HCl.

г) Смесь подвергали взаимодействию в течение 3-4 часов при спокойном перемешивании на вращателе пробирок при комнатной температуре. По окончании периода времени реакции аликвоту наносили на гель-фильтрационную обессоливающую колонку и элюировали в DPBS для удаления непрореагировавших компонентов, имеющих молекулы небольшого размера. Это увеличивало объем образца конъюгата в сумме до 3 мл.

д) С использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина конечный конъюгат анализировали на содержание белка с использованием анализа методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий), и конечную концентрацию определяли как 3,01 мг/мл. Конъюгат анализировали в отношении включения гаптена с использованием ультрафиолетовой спектроскопии в области 280 нм против неконъюгированного контроля, нормированного в отношении содержания белка, и было обнаружено более сильное поглощение в этой области по сравнению с нативным анатоксином. Конъюгат также анализировали методом SDS-PAGE электрофореза и в отношении содержания эндотоксина с использованием LAL-теста. В конце 100 мкг образца конъюгата подвергали гидролизу и анализировали с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ для определения количества включенных гаптенов на молекулу белка. Было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 11,6 гаптенов на мономер белка.

е) В конце образец подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкм шприцевой фильтр и асептически делили на аликвоты по 1,0 мл. Эти асептические аликвоты хранили при -80°С до отправки к месту исследования на сухом льду.

Пример 7. Продукт из Получения 12 также может быть связан с CRM₁₉₇, так же, как и с дифтерийным анатоксином. Пример такого конъюгирования приведен ниже. Хотя это не показано, такой же способ можно применять к другим содержащим аминогруппу гаптенам, таким как 4, 7, 8, 24-34 и 46-56.

а) Гаптен из Получения 12 получали в виде желтого масла и хранили при -20°С. Это масло растворяли в забуференном фосфатами физиологическом растворе, модифицированном по Дульбекко, без Са или Mg (DPBS), при концентрации 50 мг гаптена на мл раствора. В результате получали желто-коричневую суспензию или раствор.

б) Отдельно аликвоту 20 мл концентрированного CRM₁₉₇ (5,91 мг/мл) оттаивали с -80°С до 2-8°С. Аликвоту 8,62 мл оттаявшего вещества отбирали и разбавляли 1,38 мл DPBS с получением 10 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл белка в DPBS.

в) 500 мкл раствора гаптена, полученного ранее, добавляли к 10 мл раствора CRM₁₉₇, причем его добавляли медленно и по каплям, а затем оставляли взаимодействовать на вращателе пробирок в течение 5 мин.

г) По истечении этого времени 90 мг сульфо-N-гидроксисукцинимида (s-NHS) в виде твердого вещества затем добавляли к 10 мл раствора CRM₁₉₇. Растворение s-NHS обеспечивали с помощью переворачивания пробирки и спокойного перемешивания. Раствор затем оставляли взаимодействовать на вращателе пробирок в течение 5 мин.

д) Через 5 минут к раствору CRM₁₉₇ добавляли 90 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), снова в виде твердого вещества, и эту смесь оставляли растворяться, переворачивая пробирку при спокойном смешивании. На этой стадии рН доводили до значения рН 5,6 добавлением по каплям 1М HCl.

е) Реакционную смесь затем переносили в холодное помещение (2-8°С) и оставляли взаимодействовать на вращателе пробирок в течение 6 часов.

ж) По окончании периода времени реакции образец обессоливали в dPBS с использованием колонок 5×NAP25 для удаления избытка непрореагировавших реагентов (ON: 2 мл, OFF: 3 мл). Конечный объем увеличивался до 15 мл.

з) С использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина конечный конъюгат анализировали на содержание белка с использованием анализа методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий), и конечную концентрацию определяли как 2,88 мг/мл. Конъюгат анализировали в отношении включения гаптена с использованием ультрафиолетовой спектроскопии в области 280 нм против неконъюгированного контроля, нормированного в отношении содержания белка, и было обнаружено более сильное поглощение в этой области по сравнению с нативным анатоксином. Конъюгат также анализировали методом SDS-PAGE электрофореза и в отношении содержания эндотоксина с использованием LAL-теста. В конце 100 мкг образца конъюгата подвергали гидролизу и анализировали с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ для определения количества включенных гаптенов на молекулу белка. Было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 8,0 гаптенов на мономер белка.

и) В конце образец подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкм шприцевой фильтр и асептически делили на аликвоты по 1,0 мл. Эти асептические аликвоты хранили при -80°С до отправки к месту исследования на сухом льду.

Пример 8. Было обнаружено, что с увеличением концентрации sNHS/EDC в реакционной смеси количество гаптенов на белке-носителе можно контролировать. Пример конъюгирования продукта из Получения 7 с дифтерийным анатоксином приведен ниже. Способ является таким, как описано в Примере 6, со следующими изменениями на стадиях (в) и (д):

На стадии (с): на этой стадии количество сульфо-N-гидроксисукцинимида (s-NHS) и гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), добавляемых к аликвоте 2 мл обессоленного DT, можно варьировать. В этом эксперименте 9 мг sNHS и EDC добавляли к одной аликвоте (это условие 2) и 36 мг sNHS и EDC добавляли к другой аликвоте (это условие 4). рН образцов не доводили до значения рН 5,6 добавлением по каплям 1М HCl.

На стадии (д): для конъюгата, изготовленного с использованием условия 2, конечную концентрацию определяли как 3,14 мг/мл, и было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 8,3 гаптенов на мономер белка. Для конъюгата, изготовленного с использованием условия 4, конечную концентрацию определяли как 2,46 мг/мл, и было обнаружено, что конъюгат гаптен-DT имеет 13,2 гаптенов на мономер белка.

Пример 9. Получение тиолированных конъюгатов гаптен-спейсер на CRM₁₉₇ и инактивированном формалином дифтерийном анатоксине (DT) посредством конъюгирования с использованием эфира, образованного N-гидроксисукцинимидом с бромуксусной кислотой (BAANS).

а) 3 мл CRM₁₉₇ (17,73 мг при 5,91 мг/мл) и 3 мл DT (24 мг при 8 мг/мл) оттаивали и обессоливали в 100 мМ фосфатный буфер, рН 8,0, с использованием обессоливающих колонок 10DG (Pierce) (on: 3 мл, off: 4 мл). Концентрацию доводили до 4 мг/мл с использованием того же буфера.

б) Отбирали аликвоту 1 мл из обессоленных образцов CRM₁₉₇ и DT и охлаждали до 2-8°С.

в) 20 мг конъюгата гаптен-спейсер из Получения 57 растворяли в 300 мкл DMSO и 700 мкл dPBS до конечной концентрации 20 мг/мл.

г) 500 мкл (10 мг) раствора конъюгата гаптен-спейсер добавляли к 500 мкл предварительно промытого геля ТСЕР ((трис(2-карбоксиэтил)фосфин)) (Pierce) и инкубировали в течение 3 часов при перемешивании при комнатной температуре. Оставшийся раствор гаптена замораживали при -20°С для длительного хранения.

д) 90 минут в стадию (г), 10 мг BAANS (Sigma) растворяли в 500 мкл DMSO до конечной концентрации 20 мг/мл.

е) 1,5 мг (75 мкл) BAANS добавляли к 1 мл DT/CRMigy, медленно и по каплям (при 4 мг/мл). Эту смесь подвергали взаимодействию в течение 90 минут при температуре ниже 11°С (добавляли 0,375 мг BAANS на мг CRM₁₉₇/DT).

ж) Через 90 минут все еще при температуре ниже 11°С бромацетилированный CRM₁₉₇/DT обессоливали в холодный 100 мМ буфер на основе карбоната/бикарбоната натрия, рН 9,1, с использованием колонки NAP10 (1 мл on, 1,5 мл off).

з) Конъюгат гаптен-спейсер аспирировали из геля ТСЕР, и 250 мкл (5 мг) конъюгата гаптен-спейсер добавляли в оба активированных образца CRM₁₉₇/DT, снова медленно и по каплям, при перемешивании для предотвращения образования градиентов концентрации.

и) После добавления конъюгата гаптен-спейсер проверяли рН и доводили его до значения 9,1 добавлением по каплям 0,1М NaOH/HCl, если это было необходимо.

к) Реакционную смесь выдерживали в отсутствие света при перемешивании в течение 18 часов.

л) По истечении этого времени 2 мкл N-ацетилцистеамина (NAC) добавляли в каждую реакционную смесь и подвергали взаимодействию в отсутствие света в течение 3 часов при перемешивании (0,5 мл на г CRM₁₉₇/DT).

м) После реакции смесь обессоливали в PBS, модифицированный по Дульбекко, с использованием обессоливающей колонки 10DG (BioRad) (3 мл on, 4 мл off).

н) В конце образец подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкм шприцевой фильтр и асептически делили на аликвоты по 1,0 мл. Эти асептические аликвоты хранили при 2-8°С до отправки к месту исследования.

о) С использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина конечный конъюгат анализировали на содержание белка с использованием анализа методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий), и конечную концентрацию определяли как 1,59 мг/мл. Конъюгат также анализировали методом SDS-PAGE электрофореза и в отношении содержания эндотоксина с использованием LAL-теста. В конце 150 мкг образца конъюгата подвергали гидролизу и анализировали с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ для определения количества включенных гаптенов на молекулу белка. Было обнаружено, что конъюгат гаптен-CRM₁₉₇ имеет 11,6 гаптенов.

Пример 10. Было обнаружено, что с увеличением концентрации BMNS в реакционной смеси количество гаптенов/конъюгатов гаптен-спейсер на белке-носителе можно контролировать. Пример конъюгирования продукта из Получения 57 с CRM₁₉₇ представлен ниже.

а) 9 мл CRM₁₉₇ (53,19 мг при 5,91 мг/мл) оттаивали и обессоливали в 100 мМ фосфатного буфера, рН 8,0, с использованием обессоливающих колонок 10DG (Pierce) (on: 3 мл, off: 4 мл). Концентрацию доводили до 4 мг/мл с использованием того же буфера.

б) 30 мг конъюгата гаптен-спейсер из Получения 57 растворяли в 1,5 мл DMSO (конечная концентрация 20 мг/мл).

в) 1 мл геля ТСЕР (Pierce) готовили путем промывки дважды в PBS, модифицированном по Дульбекко, затем добавляли 1,5 мл раствора, содержащего конъюгат гаптен-спейсер. Эту смесь затем инкубировали при 2-8°С на вращающейся платформе в течение 2 часов.

г) После инкубирования в течение 1 часа с ТСЕР 10 мл раствор 4 мг/мл CRM₁₉₇ делили на аликвоты 5 х 2 мл в отдельных реакционных сосудах и выдерживали в холодном помещении в течение 30 минут до доведения температуры раствора до 2-8°С. Все последующие стадии осуществляли при температуре 2-8°С.

д) Одновременно исходный раствор BAANS готовили путем растворения 20 мг BAANS в 1 мл DMSO. 5 реакционных сосудов маркировали указанием условия 1, 2, 3, 4 или 5. После того, как температура аликвот CRM₁₉₇ достигала 2-8°С, различные количества раствора BAANS (50 мкл, 100 мкл, 150 мкл, 225 мкл и 300 мкл) добавляли в реакционные сосуды 5х2 мл, как указано в Таблице 2. Раствор BAANS добавляли медленно (по каплям) и при перемешивании.

е) Аликвоты подвергали взаимодействию в течение 30 минут при 2-8°С на вращающейся платформе.

ж) После инкубирования в течение 30 мин 5×2 мл бромацетилированного CRM₁₉₇ обессоливали в 100 мМ буфер карбонат/бикарбонат натрия, рН 9,1, с использованием колонок NAP25 (Gibco) (ON: 2 мл, OFF: 3 мл).

з) Гель ТСЕР удаляли из образцов гаптенов, и 5,6 мг (280 мкл) конъюгата гаптен-спейсер добавляли (медленно, по каплям) при перемешивании, в каждый из обессоленных бромацетилированных образцов CRM₁₉₇. Реакционные сосуды накрывали фольгой для защиты содержимого от света.

и) Смеси подвергали взаимодействию в течение 18 часов на вращающейся платформе.

к) Непрореагировавшие BrAc-группы гасили добавлением в реакционную смесь 0,5 мл NAC на г CRM₁₉₇ (то есть 4 мкл на реакцию). Смеси давали возможность взаимодействовать в течение 3 часов на вращающейся платформе (все еще накрытой фольгой для защиты от света).

л) В конце каждую реакционную смесь обессоливали в PBS, модифицированный по Дульбекко, с использованием колонок DG10 (ON: 3 мл, OFF: 4 мл). Конечный объем составлял 4 мл.

м) Образцы подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкм шприцевой фильтр и асептически делили на аликвоты. Эти асептические аликвоты хранили при 2-8°С до отправки к месту исследования.

н) С использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина анализировали конечные конъюгаты на содержание белка с использованием анализа методом Брэдфорд (реактив кумасси бриллиантовый синий), определяли конечную концентрацию, которая указана в Таблице 3. Конъюгаты также анализировали методом SDS-PAGE электрофореза и в отношении содержания эндотоксина с использованием LAL-теста. В конце 450 мкг образца каждого конъюгата подвергали гидролизу и анализировали с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ (N=3) для определения количества включенных гаптенов на молекулу белка (данные по гаптеновой нагрузке приведены в Таблице 5).

Таблица 3
Конъюгат	CRM197 (мг)	BAANS (мг)	Количество добавленного раствора BAANS (20 мг/мл)	Молярный избыток по сравнению с CRM197
CRM197-Получение 57 условие 1	8	1	50 мкл	30
CRM197-Получение 57 условие 2	8	2	100 мкл	60

CRM197-Получение 57 условие 3	8	3	150 мкл	90
CRM197-Получение 57 условие 4	8	4.5	225 мкл	135
CRM197-Получение 57 условие 5	8	6	300 мкл	180

Таблица 4
Конъюгат	Концентрация белка (мг/мл)
CRM197-Получение 57 условие 1	1,76
CRM197-Получение 57 условие 2	1,79
CRM197-Получение 57 условие 3	1,73
CRM197-Получение 57 условие 4	1,57
CRM197-Получение 57 условие 5	1,63

Таблица 5
Образец	Rep	Суммарная нагрузка	Неконъюгированный	Конъюгированный	Средняя нагрузка
CRM197-Получение 57 условие 1	1	6,1	ND	6,1	6,7
	2	8,5	ND	8,5
3	5,5	ND	5,5
CRM197-Получение 57 условие 2	1	7,8	ND	7,8	9,1
	2	10,8	ND	10,8
3	8,7	ND	8,7
CRM197-Получение 57 условие 3	1	9,1	ND	9,1	11,9
	2	12,5	ND	12,5
3	14	ND	14
CRM197-Получение 57 условие 4	1	12,5	ND	12,5	14,5
	2	16,8	ND	16,8
3	14,2	ND	14,2
CRM197-Получение 57 условие 5	1	12,2	ND	12,2	15,1
	2	15,5	ND	15,5
3	17,6	ND	17,6

Пример 11. Мышей BALB/c (Charles River, Montreal, QC.) (n=12 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примеров 1-4 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Уровни антиникотиновых IgG антител в плазме крови измеряли методом ELISA, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.1, откуда можно видеть, что достигается сильный антиникотиновый антительный ответ для каждого протестированного конъюгата через 4 недели после примирующей инъекции, и этот ответ длится или увеличивается через 2 недели после каждой первой и второй реиммунизирующих инъекций.

Пример 12. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примеров 1-4 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Индексы авидности вычисляли в разные моменты времени. Индекс авидности соответствует концентрации тиоцианата аммония, необходимой для элюирования 50% антиникотиновых антител из планшетов, покрытых никотин-BSA, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.2, откуда можно видеть, что антитела у мышей, индуцированные протестированными конъюгатами, проявляют высокую авидность через 4 недели после примирующей инъекции, которая длится или увеличивается после каждой первой и второй реиммунизирующих инъекций.

Пример 13. Мышей BALB/c (n=6 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примеров 1-4 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Через 2 недели после последней реиммунизации вводили внутривенной инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли отношение ³H в головном мозге ³H в плазме крови, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.3, откуда можно видеть, что отношение плазма/головной мозг протестированных конъюгатов значительно больше, чем у контрольных животных, и это указывает на то, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, являются специфическими в отношении никотина и секвестируют никотин в крови и предотвращают захват никотина в головной мозг.

Пример 14. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примеров 1-4 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Через 2 недели после второй реиммунизирующей инъекции взаимодействие антиникотиновых антител с никотином определяли методом конкурентного анализа ELISA, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.4, откуда можно видеть, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, распознают и связываются с никотином.

Пример 15. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примеров 1 и 2 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Через 2 недели после второй реиммунизирующей инъекции специфичность антиникотиновых антител к никотину, котинину, ацетилхолину и варениклину определяли методом конкурентного анализа ELISA, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.5, откуда можно видеть, что имеет место доза-зависимое ингибирование связывания антиникотиновых антител с ELISA-планшетами, покрытыми никотином, по мере увеличения количества добавленного никотина. Однако никакого такого эффекта не наблюдается с варениклином, котинином или ацетилхолином, что свидетельствует о том, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, обладают специфичностью в отношении никотина, но не котинина, варениклина или ацетилхолина.

Пример 16. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примера 5 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.6, 7, 8 и 9, откуда можно видеть, что достигается очень сильный антиникотиновый антительный ответ для каждого протестированного конъюгата через 4 недели после примирующей инъекции, причем этот ответ увеличивается через 2 недели после реиммунизирующей инъекции. Кроме того, уровни антиникотиновых антител, а также авидность антиникотиновых антител варьируют в зависимости от используемого спейсера. Все протестированные конъюгаты обеспечивают в результате более высокое соотношение в плазме/в головном мозге, чем у контрольных животных, и это свидетельствует о том, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, могут секвестировать никотин в крови и предотвращать его захват в головной мозг в большей степени, чем у контрольных животных.

Пример 17. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примеров 6 и 7 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Уровни антиникотиновых антител (суммарные IgG) в плазме крови измеряли методом ELISA. Через 2 недели после последней реиммунизации вводили внутривенной инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения уровней ³H относительно контрольных животных, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.12 (уровни антиникотиновых антител) и Фиг.13 (% изменения уровней ³H), откуда можно видеть, что иммунный ответ достигается для каждого протестированного конъюгата, причем этот ответ увеличивался доза-зависимым образом. Это свидетельствует о том, что оба DT и CRM197 являются подходящими носителями для никотиновых гаптенов. Кроме того, все протестированные конъюгаты обеспечивают в результате более низкие уровни ³H-никотина, поступающего в головной мозг, чем у контрольных животных, и это свидетельствует о том, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, могут секвестировать никотин в крови и предупреждать его захват в головной мозг в большей степени, чем у контрольных животных.

Пример 18. Мышей BALB/c (n=12 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгатов из Примеров 6, 7 и 8 внутримышечной инъекцией (в дни 0, 28, 42) в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 50 мкг CpG 24555. Уровни антиникотиновых IgG АЬ в плазме крови измеряли методом ELISA. Через 2 недели после последней реиммунизации вводили в.в. инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения уровней ³H относительно контрольных животных, как описано выше.

Результаты представлены на Фиг.14 (уровни антиникотиновых антител) и Фиг.15 (% изменения уровней ³Н), откуда можно видеть, что иммунный ответ достигается в случае каждого протестированного конъюгата, причем этот ответ увеличивается с увеличением гаптеновой нагрузки. Кроме того, все протестированные конъюгаты обеспечивают в результате более низкие уровни ³H-никотина, поступающего в головной мозг, чем у контрольных животных, и это свидетельствует о том, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, могут секвестировать никотин в крови и предотвращать его захват в головной мозг в большей степени, чем у контрольных животных.

Пример 19. Мышей BALB/c (n=10 на группу) иммунизировали 10 мкг конъюгата из Примера 7 внутримышечной инъекцией в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 10 мкг CpG 24555 или в присутствии ISCOMATRIX (IMX; от 0,1 до 3,0 единиц). Уровни антиникотиновых IgG Ab в плазме крови измеряли методом ELISA (в дни 21 и 28), и авидность измеряли ELISA-анализом ингибирования. Результаты представлены на Фиг.16 и Фиг.17, откуда можно видеть, что иммунный ответ (уровни Ab и авидность) достигаются с использованием CpG 24555 и гидрата окиси алюминия в качестве комбинированного адъюванта или с использованием ISCOMATRIX в качестве единственного адъюванта, и этот ответ увеличивается с увеличением дозы ISCOMATRIX.

Через 1 неделю после 2-й иммунизации вводили в.в. инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения уровней ³H-никотина в крови и в головном мозге относительно контрольных животных. Результаты представлены на Фиг.18, откуда можно видеть, что использование CpG 24555 и гидрата окиси алюминия в качестве комбинированных адъювантов или ISCOMATRIX в качестве единственного адъюванта обеспечивает более низкие уровни ³H-никотина, поступающего в головной мозг, чем у контрольных животных, и это свидетельствует о том, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, могут секвестировать никотин в крови и предотвращать его захват в головной мозг в большей степени, чем у неиммунизированных контрольных животных.

Пример 20. Образцы, описанные в Таблице 6 ниже, получали следующим образом:

а) Замороженный CRM₁₉₇ (200 мл при 5,9 мг/мл) оттаивали в течение ночи при 4°С.

б) Сразу после оттаивания CRMw концентрировали с 200 мл до 100 мл посредством ультрафильтрации (UF) с использованием мембраны из полиэфирсульфона (PES) Kvick Start с отсечкой молекулярной массы 10 кДа.

в) Концентрированный CRM₁₉₇ подвергали диафильтрации (DF) с 8 TOV (оборотные объемы) с использованием 50 мМ MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), 50 мМ NaCl, pH 7,2. После UF/DF (ультрафильтрации/диафильтрации) CRM₁₉₇ фильтровали с использованием стерильного капсульного фильтра SARTOPORE 2 150.

г) Концентрацию CRM₁₉₇ определяли путем измерения поглощения при А₂₈₀ с использованием коэффициента возбуждения 0,942. Концентрация составляла 9,65 мг/мл.

д) После UF/DF CRM₁₉₇ разбавляли до 7,18 мг/мл, начиная с 9,65 мг/мл, с использованием 50 мМ MOPS, 50 мМ NaCl, pH 7,2.

е) В отдельном сосуде 6М раствор HCl (7,46 мл) медленно добавляли к 7460 мг гаптена из Получения 12 с одновременным охлаждением в ледяной бане. Затем добавляли буфер 50 мМ MOPS, 50 мМ NaCl, pH 7,2 (2,00 мл), и pH проверяли, используя рН-бумагу. pH составлял приблизительно 9. 6М HCl добавляли маленькими порциями до достижения значения pH 7,5 (добавляли 1,70 мл HCI). Общий объем раствора составлял 18,65 мл и, соответственно, концентрация составляла 400 мг/мл гаптена из Получения 12.

ж) В отдельном сосуде 7000 мг сульфо-N-гидроксисукцинимида (sNHS) растворяли в растворе 50 мМ MOPS, 50 мМ NaCl, pH 7,2 (14 мл) и добавляли 19,25М раствор NaOH небольшими порциям до достижения pH 7,13 (добавляли 1,44 мл NaOH). Общий объем раствора составлял 18,50 мл, и концентрация в результате составляла 378 мг/мл NHS.

з) В отдельном сосуде 8000 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) растворяли в 5 мл 50 мМ MOPS, 50 мМ NaCl, pH 7,2. Общий объем раствора составлял 12,0 мл, и концентрация в результате составляла 666 мг/мл EDC. Раствор EDC готовили последним перед тем, как добавлять для проведения реакций конъюгирования.

и) После UF/DF CRMigy, гаптен из Получения 12, sNHS и EDC растворы объединяли таким образом, что получилось 24 образца, указанные в Таблице 6. Для этих 24 образцов точно вычисленные количества растворов смешивали вместе следующим образом: UF/DF CRM₁₉₇, гаптен из Получения 12 и sNHS объединяли, и рН этой смеси проверяли. Для образцов с номерами 10 и 18 рН дополнительно корректировали с использованием 1 н. NaOH для доведения значения рН до приблизительно 7,5. В конце к образцам добавляли EDC. Каждую реакционную пробирку недолго вращали не вортексе и инкубировали при 15°С в водяной бане в течение 18 ч.

к) После инкубирования в течение 18 часов заменяли буфер для образцов с использованием центрифужных концентраторов Amicon ultra с отсечкой молекулярной массы 30 кДа. Использовали буфер 20 мМ фосфата калия, 20 мМ гистидина, рН 7,0. Концентрацию белка определяли с использованием коммерчески доступного микронабора ВСА.

л) 200 мг/мл сахарозы растворяли в воде и добавляли к каждому из 24 конъюгированных образцов в соотношении 1:1 (по объему). После этого добавляли PS80 до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Образцы хранили при 4°С для краткосрочного хранения и пои -20°С для долгосрочного хранения.

Таблица 6
Образец	Молярное соотношение	Молярное соотношение гаптен из Получения 12: CRM197	Молярное соотношение EDC: CRM197	CRM197 (мг/мл)	IC50	Эффективность
1	2600	2550	3000	3,0	7,95	41,0
2	5000	2550	3000	3,0	4,85	46,0
3	3800	4672	3000	3,0	9,05	50,0
4	3800	3258	4634	3,0	10,1	33,0
5	3800	3258	3408	4.6	8,05	38,0
6	200	2550	3000	3,0	5,65	43,0
7	1400	428	3000	3,0	18.25	26,0
8	1400	1842	1366	3,0	5.3	48,0

9	1400	1842	2592	1,4	4,75	45,0
10	3800	428	3000	3,0	20,4	21,0
11	3800	1842	1366	3,0	5,6	32,0
12	3800	1842	2592	1.4	4,65	33,0
13	1400	4672	3000	3,0	8,43	32,0
14	2600	3964	1366	3,0	3,87	26,0
15	2600	3964	2592	1,4	6,84	41,0
16	1400	3258	4634	3,0	7,97	32,0
17	2600	1136	4634	3,0	15,81	27,0
18	2600	2550	4226	1,4	12,16	36,0
19	1400	3258	3408	4,6	19,82	20,0
20	2600	1136	3408	4,6	18,37	33,0
21	2600	2550	1774	4,6	10,12	42,0
22	2600	2550	3000	3,0	8,51	40,0
23	2600	2550	3000	3.0	8,3	46,0
24	2600	2550	3000	3,0	16,71	44,0

Аналитическая методология, использованная для исследования образцов 1-24, подробно изложена ниже.

SELDI-MS. Усиленная поверхностью лазерная десорбция/ионизация (SELDI) представляет собой метод масс-спектрометрии, который используется для анализа белковых смесей. Этот анализ обеспечивает получение данных о приросте чистой массы каркаса CRMigy в процессе конъюгирования. Изменение массы описывается в виде аддуктов к каркасу. В идеале, аддукты соизмеримы с анализом плотности гаптен-специфических эпитопов. Аддукты = (Масса_{Конъюгат}-Масса_Каркас)/Масса_Гаптен. Замечено, что уровни аддуктов в избытке значения ED указывает, что масса, отличающаяся от массы гаптена, присоединяется к каркасу, и что образцы с высоким аддуктом также имеют высокое содержание HMMS.

Эксклюзионная хроматография. Эксклюзионный анализ был разработан для анализа HMMS (высокомолекулярных соединений), димеров, мономеров и LMMS (низкомолекулярных соединений) с целью выяснения технологических параметров, которые сильно влияют на относительное содержание этих компонентов. Этот метод предоставляет данные по относительной площади в процентах для группы пиков HMMS, димера, мономера и группы пиков LMMS. Замечено, что технологическая стехиометрия и соотношения исходных веществ сильно влияют на кажущееся распределение площади пика между HMMS, димером, мономером и LMMS.

Плотность эпитопа. Анализ методом обращеннофазовой жидкостной хроматографии в сочетании с получением образца кислотным гидролизом был разработан для определения количества гаптена, конъюгированного с белком-носителем CRM₁₉₇. Молекула гаптена конъюгируется с каркасом CRM₁₉₇ через амидную связь; эта связь гидролизуется, высвобождая гаптен наряду с заместителями-аминокислотами в соответствии с химизмом стандартного гидролиза. Количество конъюгированного гаптена 7 является мерой технологической согласованности, качества продукта и эффективности.

Результаты определения характеристик образцов 1-24 приведены в Таблице 7. Эти данные демонстрируют тесную связь между эффективностью и плотностью эпитопа гаптена, связанного с CRM₁₉₇. Они также демонстрируют, что значения оптимальной плотности эпитопа коррелируют с высоким содержанием мономера, низким содержанием HMMS и низкими аддуктами.

Таблица 7
Образец	Кислотный гидролиз Плотность эпитопа	SELDI-MS Кажущаяся плотность эпитопа	Высокомолекулярные соединения (HMMS), %	Димер, %	Мономер, %	Низкомолекулярные соединения (LMMS), %
1	18,6	19,9	0,0	0,0	100,0	0,0
2	13,0	15,8	0,0	0,0	100,0	0,0
3	14,3	12,2	0,0	0,0	94,1	5,9
4	27,1	30,4	1,9	0,0	95,1	3,0
5	20,8	24,8	1,3	0,0	98,7	0,0
6	15,2	17,4	0,0	0,0	100,0	0,0
7	13,1	34,3	20,0	20,4	49,8	9,7

8	11,5	12,8	0,0	0,0	100,0	0,0
9	4,8	12,7	0,0	0,0	100,0	0,0
10	5,4	30,5	10,2	9,2	72,1	8,5
11	6,7	6,8	1,6	6,3	84,8	7.3
12	9,0	12,9	0,0	0,0	100,0	0,0
13	17,4	23,9	5,0	11,8	83,2	0,0
14	4,5	4,8	4,6	4,5	79,5	11,3
15	7,9	10,3	0,3	0,0	99,7	0,0
16	25,0	31,7	0,0	0,0	100,0	0,0
17	15,6	41,6	7,7	10,2	82,1	0,0
18	7,0	21,9	0,0	0,0	100,0	0,0
19	30,0	36,3	0,0	0,0	100,0	0,0
20	17,5	42,2	5,0	0,0	86,3	8,7
21	10,5	12,1	0,0	0,0	99,3	0,7
22	13,2	16,7	14,4	0,0	57,0	28,6
23	18,1	25,0	0,0	0,0	100,0	0,0
24	16,1	23,6	0,0	0,0	100,0	0,0

Пример 21. Мышей BALB/c (n=10 на группу) иммунизировали 10 мкг образцов 1-24 (смотри Пример 20, Таблицы 6 и 7) внутримышечной инъекцией в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 10 мкг CpG 24555. Уровни антиникотиновых IgG Ab в плазме крови измеряли методом ELISA (в дни 21 и 28), и авидность измеряли ELISA анализом ингибирования. Результаты представлены на Фиг.19 и Фиг.20, откуда можно видеть, что иммунный ответ достигается в случае каждого протестированного конъюгата, и этот ответ увеличивается с увеличением % мономера и является оптимальным при гаптеновой нагрузке от 10 до 18 гаптенов на единицу носителя.

Через 1 неделю после 2-й иммунизации вводили в.в. инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения ³H-никотина в крови и головном мозге относительно контрольных животных. Результаты представлены на Фиг.21 и Фиг.22, откуда можно видеть, что все протестированные конъюгаты обеспечивают более низкие уровни ³H-никотина, поступающего в головной мозг, чем у неиммунизированных контрольных животных, и это свидетельствует о том, что антитела, индуцированные протестированными конъюгатами, могут секвестировать никотин в крови и предотвращать его захват в головной мозг в большей степени, чем у контрольных животных, и что эффективность повышается с увеличением % мономера (Фиг.21) и является оптимальной при гаптеновой нагрузке от 10 до 18 гаптенов на единицу носителя (Фиг.22).

Пример 22. Образцы 1-24 (смотри Пример 20, Таблицы 6 и 7) тестировали в отношении связывания с Alhydrogel. Мышей BALB/c (n=10 на группу) также иммунизировали 10 мкг этих разных конъюгатов внутримышечной инъекцией в присутствии гидрата окиси алюминия (квасцы; Alhydrogel-85: 40 мкг Al³⁺) и 10 мкг CpG 24555. Через 1 неделю после 2-й иммунизации вводили в.в. инъекцией ³H-никотин (0,05 мг/кг никотина, содержащего 3 мкКи ³H-никотина), кровь собирали, животных перфузировали, головной мозг извлекали, количественно определяли уровни ³H и определяли % изменения ³H-никотина в крови и головном мозге относительно контрольных животных. Результаты представлены на Фиг.23, откуда можно видеть, что конъюгаты с более высоким % содержания мономера имеют более высокий % связывания с Alhydrogel, и что это коррелирует с более высокой эффективностью, которая продемонстрирована более высоким снижением количества ³H-никотина в головном мозге.

1. Конъюгат гаптен-носитель формулы (III):

где
W представляет собой -О- и находится в положении 5 пиридинового кольца;
-(спейсер)- представляет собой С₁-С₈алкиленовую группу, С₃-С₁₀циклоалкиленовую группу или С₁-С₁₂алкиленовую группу, прерванную 1-4 атомами кислорода и возможно прерванную группой -N(H)C(O)-;
X* представляет собой -NH- или -S-;
m означает 1;
n означает целое число от 1 до 1000; и
Y представляет собой возможно модифицированный белок-носитель, выбранный из бактериальных анатоксинов, иммуногенных веществ, вирусов, вирусоподобных частиц, белковых комплексов, белков, полипептидов, липосом и иммуностимулирующих комплексов.

2. Конъюгат гаптен-носитель по п. 1, где белок-носитель представляет собой возможно модифицированный белок, выбранный из производных столбнячного токсина, производных дифтерийного токсина, гемоцианина лимфы улитки (KLH), гемоцианина, белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) из Neisseria meningitidis, В-субъединицы термолабильного токсина Escherichia coli, рекомбинантного экзобелка А из Pseudomonas aeruginosa (rEPA) и других вирусоподобных частиц, таких как вирусоподобные частицы, собранные из рекомбинантного белка оболочки бактериофага Qb, поверхностный антиген гепатита В, коровый антиген гепатита В или виросома.

3. Конъюгат гаптен-носитель формулы (III) по п. 1 или 2, где носитель представляет собой белок, выбранный из дифтерийного анатоксина и CRM197, где каждый независимо возможно модифицирован.

4. Композиция для продуцирования антиникотиновых антител, содержащая:
множество конъюгатов гаптен-носитель по любому из пп. 1-3; и
один или более адъювантов.

5. Композиция по п. 4, где один из одного или более адъювантов представляет собой олигонуклеотид с SEQ ID NO: 1.

6. Композиция по п. 4, где один из одного или более адъювантов представляет собой соль алюминия.

7. Композиция по п. 6, где соль алюминия представляет собой гидрат окиси алюминия.

8. Композиция по п. 7, где адъювантами являются олигонуклеотид с SEQ ID NO: 1 и гидрат окиси алюминия.