Способ получения химического вещества



Способ получения химического вещества
Способ получения химического вещества

 


Владельцы патента RU 2595387:

ТОРЭЙ ИНДАСТРИЗ, ИНК. (JP)

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) посредством непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы. Способ включает фильтрацию культуральной жидкости через разделительную мембрану, сохранение не подвергнутой фильтрованию жидкости или возвращение не подвергнутой фильтрованию жидкости в культуральной(ую) жидкости(ь), добавление в культуральную жидкость исходного материала для ферментации и выделение химического продукта. Используемый микроорганизм(ы) подвергается подавлению катаболитами. Отношение пентозы к гексозе в сахарном сиропе от 1:9 до 9:1. Концентрация пентозы в фильтрате не более 5 г/л, при этом пентозой является ксилоза. Изобретение обеспечивает высокий выход химического вещества. 4 з.п. ф-лы, 35 табл., 37 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения химического продукта посредством непрерывной ферментации (культивирования) с использованием исходного материала для ферментации, содержащего гексозу и пентозу.

Предпосылки создания изобретения

Ввиду актуализации проблемы выброса углекислого газа в атмосферу и энергетической проблемы, получаемые из биомассы химические продукты, представленные биологически разлагаемыми полимерными материалами, такими как молочная кислота и биотопливо, такое как этанол, привлекли большее внимание в качестве продуктов, обладающих устойчивостью, и с возможностью оценки жизненного цикла (LCA). Эти биологически разлагаемые полимерные материалы и биотопливо обычно создаются в виде продуктов ферментации микроорганизмами, с использованием в качестве исходного материала для ферментации глюкозы, которая является гексозой, очищаемой из годной в пищу биомассы, такой как кукуруза. Однако использование годной в пищу биомассы может быть причиной повышения ее цены из-за конкуренции с продовольствием, приводя к нестабильной поставке исходного материала. В связи с этим предпринимаются попытки использовать сахара, получаемые из не годной в пищу биомассы, такой как стебли риса, в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмами (смотрите патентный документ 1).

В тех случаях, когда получаемый из не годной в пищу биомассы сахар используют в качестве исходного материалами для ферментации, целлюлозу, гемицеллюлозу и т.п., содержащуюся в не годной в пищу биомассе, разлагают на сахара с помощью осахаривающего фермента. В этом процессе получают не только гексозы, такие как глюкоза, но также пентозы, такие как ксилоза, и в результате смешанные сахара, содержащие гексозу и пентозу, используют в качестве исходного материала для ферментации, если получаемый из не годной в пищу биомассы сахар используют в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмами (смотрите патентный документ 1).

В качестве способа ферментации, в котором получаемый из не годной в пищу биомассы сахар, который является смешанным сахаром, содержащим гексозу и пентозу, используется в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмами, может использоваться непрерывная ферментация, но выход продуктов ферментации, фактически достигаемый при непрерывной ферментации, не был исследован (смотрите патентный документ 1). С другой стороны, как это известно в данной области техники, среда для культивирования постоянно используется для ферментации в случае непрерывной ферментации с использованием смешанного сахара, содержащего гексозу и пентозу в качестве исходного материала для ферментации, и по этой причине выход продуктов ферментации при непрерывной ферментации намного ниже, чем при периодической ферментации, поскольку микроорганизм постоянно подвергается подавлению катаболитами в отличие от периодической ферментации (смотрите непатентный документ 1). Таким образом, в соответствии с известным уровнем техники, считалось, что микроорганизм, который не подвергается подавлению катаболитами, должен использоваться для ферментации для увеличения эффективности непрерывной ферментации с использованием смешанного сахара, содержащего гексозу и пентозу в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмом.

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

ПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ

Патентный документ 1: WO 2010/067785

НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ

Непатентный документ 1: Do Yun Kim, Seong Chun Yim, Pyung Cheon Lee, Woo Gi Lee, Sang Yup Lee, Ho Nam Chang, Batch and continuous fermentation of succinic acid from wood hydrolysate by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, Enzyme and Microbial Technology, 35, (2004), 648-653.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЗАДАЧИ, РЕШАЕМЫЕ НАСТОЯЩИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ.

Множество микроорганизмов, которые подвергаются подавлению катаболитами, известно в качестве микроорганизмов, способных к ферментативной продукции биологически разлагаемых полимерных материалов и биотоплива. С другой стороны, известно, что непрерывная ферментация с использованием смешанного сахара, содержащего гексозу и пентозу, в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмом, приводит к весьма уменьшенному выходу продуктов ферментации вследствие подавления катаболитами. В связи с этим настоящее изобретение нацелено на увеличение выхода продуктов ферментации при непрерывной ферментации с использованием смешанного сахара, содержащего гексозу и пентозу, в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмом, который подвергается подавлению катаболитами.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ

В результате глубокого изучения для разрешения описанной выше проблемы авторы настоящего изобретения установили, что проблему можно решить с помощью способа получения химического продукта посредством непрерывной ферментации с использованием смешанного сахара, содержащего гексозу и пентозу, в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмом, причем микроорганизм, который подвергается подавлению катаболитами, используют для непрерывной ферментации при условии использования разделительной мембраны, в силу чего достигается настоящее изобретение.

Т.е. настоящее изобретение является изобретением, описанным ниже в (1)-(5).

(1) Способ получения химического продукта посредством непрерывной ферментации, включающий фильтрование суспензионной культуры микроорганизма(ов) (культуральной жидкости) через разделительную мембрану; сохранение не подвергнутой фильтрованию жидкости, или возращение не подвергнутой фильтрованию жидкости, в культуральной(ую) жидкости(ь); добавление в культуральную жидкость исходного материала для ферментации и выделение продукта в фильтрате, причем указанный(ые) микроорганизм(ы) является(ются) микроорганизмом(ами), который(ые) подвергается(ются) подавлению катаболитами, а указанный исходный материал для ферментации включает гексозу и пентозу.

(2) Способ получения химического продукта в соответствии с (1), в котором концентрация пентозы в общем количестве фильтрата составляет не более чем 5 г/л.

(3) Способ получения химического продукта в соответствии с (1) или (2), в котором весовое соотношение между гексозой и пентозой, содержащимися в исходном материале для ферментации, составляет от 1:9 до 9:1.

(4) Способ получения химического продукта в соответствии с (1) или (2), в котором исходный материал для ферментации включает сахарный сироп, получаемый из биомассы.

(5) Способ получения химического продукта в соответствии с любым из (1)-(4), в котором указанной пентозой является ксилоза.

ЭФФЕКТ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

С помощью настоящего изобретения можно получать химический продукт с высоким выходом несмотря на тот факт, что смешанный сахар, содержащий гексозу и пентозу, используется в качестве исходного материала для ферментации микроорганизмом(ами), который подвергается подавлению катаболитами.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящим изобретением является способ ферментативной получения химического продукта посредством культивирования микроорганизма(ов) с использованием исходного материала для ферментации, который включает фильтрование культуральной жидкости через разделительную мембрану; сохранение не подвергнутой фильтрованию жидкости, или возращение не подвергнутой фильтрованию жидкости в культуральной(ую) жидкости(ь); добавление в культуральную жидкость исходного материала для ферментации и выделение продукта в фильтрате, осуществляя тем самым непрерывную ферментацию, причем используемым микроорганизмом(ами) является микроорганизм(ы), который(ые) подвергается(ются) подавлению катаболитами, а указанный исходный материал для ферментации включает гексозу и пентозу.

В способе получения химического продукта настоящего изобретения источник углерода в исходном материале для ферментации включает смешанный сахар, содержащий пентозу и гексозу. Пятиуглеродный сахар, также называемой пентозой, содержит 5 атомов углерода, создающих сахар. Пентозу можно отнести к альфопептозе, которая содержит альдегидную группу в 1-положении, и к кетопентозе, которая содержит кетонную группу во 2-положении. Примеры альдопептозы включают ксилозу, арабинозу, рибозу и ликсозу, а примеры кетопентозы включают рибулозу и ксилозу. Используемая в настоящем изобретении пентоза может быть любой пентозой при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, и в связи с большим количеством в природе, доступностью и т.п. предпочтительными являются ксилоза и арабиноза, а более предпочтительной является ксилоза.

Шестиуглеродный сахар, также называемой гексозой, содержит 6 атомов углерода, создающих сахар. Гексозу можно отнести к альдозе, которая содержит альдегидную группу в 1-положении, и к кетозе, которая содержит кетонную группу во 2-положении. Примеры альдозы включают глюкозу, маннозу, галактозу, аллозу, гулозу и талозу, а примеры кетозы включают фруктозу, псикозу и сорбозу. Используемая в настоящем изобретении гексоза может быть любой гексозой при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, и в связи с большим количеством в природе, доступностью и т.п. предпочтительными являются глюкоза, манноза и галактоза, а более предпочтительной является глюкоза.

Используемый в настоящем изобретении смешанный сахар не ограничивается, и смешанным сахаром является предпочтительно сахарный сироп, получаемый из содержащей целлюлозу биомассы, которая, как известно, содержит и гексозу, и пентозу. Примеры содержащей целлюлозу биомассы включают травяные биомассы, такие как багасса, просо прутьевидное, кукурузная солома, стебли риса и пшеничная солома, и древесные биомассы, такие как деревья и отходы строительства. Содержащие целлюлозу биомассы содержат целлюлозу или гемицеллюлозу, которые являются полисахаридами, создаваемыми при конденсации сахаров с дегидратацией. В результате гидролиза таких полисахаридов образуются сахарные сиропы, которые могут использоваться в качестве исходных материалов для ферментации. Способом приготовления сахарного сиропа, получаемого из содержащей целлюлозу биомассы, может быть любой способ, и примеры раскрытых способов получения такого сахара включают способ, в котором сахарный сироп получают посредством гидролиза в кислой среде биомассы с использованием концентрированной серной кислоты (JP H11-506934 A, JP 2005-229821 A), и способ, в котором биомассу подвергают обработке - гидролизу с использованием разбавленной серной кислоты, а затем обрабатывают ферментативно с использованием целлюлазы и/или т.п. для получения сахарного сиропа (A. Aden et al., “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover” NREL Technical Report (2002)). Кроме того, примеры раскрытых способов, в которых кислоты не используются, включают способ, в котором биомассу гидролизуют с использованием субкритической воды при приблизительно 250-500°С для получения сахарного сиропа (JP 2003-212888 A), способ, в котором биомассу подвергают обработке субкритической водой, а затем обрабатывают ферментативно для получения сахарного сиропа (JP 2001-95597 A), и способ, в котором биомассу подвергают обработке - гидролизу с использованием находящейся под давлением горячей воды при 240-280°С, а затем обрабатывают ферментативно для получения сахарного сиропа (JP 3041380 В). За этими обработками может следовать очистка полученного сахарного сиропа. Пример способа описан в WO2010/067785.

Весовое соотношение между пентозой и гексозой, содержащимися в смешанном сахаре, не ограничивается и предпочтительно составляет от 1:9 до 9:1 в виде отношения (пентоза):(гексоза) при выражении весового соотношения между пентозой и гексозой в смешанном сахаре. Это соотношение является соотношением сахаров в тех случаях, когда смешанный сахар, как предполагается, является сахарным сиропом, получаемым из содержащей целлюлозу биомассы.

Общая концентрация сахара в исходном материале для ферментации, используемом в настоящем изобретении, не ограничивается и предпочтительно является максимально возможной в пределах диапазона, в котором получение химического продукта микроорганизмом(ами) не ограничивается. Конкретнее, концентрация источника углерода в среде для культивирования составляет предпочтительно 15-500 г/л, более предпочтительно 20-300 г/л. В тех случаях, когда общая концентрация составляет не более чем 15 г/л, эффект увеличения выхода, исходя из пентозы, может уменьшаться. Кроме того, в тех случаях, когда общая концентрация сахара является низкой, эффективность получения химического продукта также уменьшается.

Концентрация гексозы в исходном материале для ферментации, используемом в настоящем изобретении, не ограничивается при условии, что общая концентрация сахара и соотношении между пентозой и гексозой находятся в пределах диапазонов, описанных выше. При использовании способа получения химического продукта настоящего изобретения хороший выход может быть получен даже при использовании смешанного сахарного сиропа, содержащего гексозу в концентрации, составляющей не менее чем 5 г/л.

Используемым в настоящем изобретении исходным материалом для ферментации может предпочтительно быть обычная жидкая среда, содержащая источник углерода, источник азота, неорганическую соль и, в необходимых случаях, органический питательный микроэлемент(ы), такой как аминокислота(ы) и витамин(ы).

Примеры источника азота, используемого в настоящем изобретении, включают газообразный аммиак, водный раствор аммиака, соли аммония, мочевину и соли азотной кислоты, и другие органические источники азота, используемые дополнительно, такие как жмыхи, полученные в результате гидролиза сои жидкости, продукты расщепления казеина, другие аминокислоты, витамины, кукурузный сироп, дрожжи или дрожжевые экстракты, мясные экстракты, пептиды, такие как пептоны, и клетки различных ферментирующих микроорганизмов и их гидролизаты. Примеры неорганических солей, которые могут быть добавлены в соответствующих случаях, включают соли фосфорной кислоты, соли магния, соли кальция, соли железа и соли марганца.

В тех случаях, когда для используемого в настоящем изобретении микроорганизма(ов) требуется специфическое питательное вещество для его роста, питательное вещество добавляют в виде препарата или в виде природного продукта, содержащего питательное вещество. Если необходимо добавляют противовспениватель. В настоящем изобретении культуральная жидкость (суспензионная культура) означает жидкость, полученную в результате выращивания микроорганизма(ов) в исходном материале для ферментации. Состав добавляемого исходного материала для ферментации может изменяться в соответствующих случаях относительно состава исходного материала для ферментации, используемого в начале культивирования, так что выработка представляющего интерес химического продукта увеличивается.

Ниже дается объяснение пористой мембраны, используемой в качестве разделительной мембраны в настоящем изобретении.

Пористая мембрана, используемая в настоящем изобретении, не ограничивается при условии, что ее функцией является отделение культуральной жидкости, полученной в результате культивирования микроорганизма(ов) в сосуде для культивирования с мешалкой или биореакторе с мешалкой, от микроорганизма(ов) с помощью фильтрации. Примеры пористых мембран, которые могут использоваться, включают пористые керамические мембраны, пористые стеклянные мембраны, пористые мембраны из органических полимеров, металлические волокнистые структуры и нетканые материалы. Среди них, пористые мембраны из органических полимеров и керамические мембраны являются особенно предпочтительными.

Ниже дается объяснение устройства пористой мембраны, используемой в качестве разделительной мембраны в настоящем изобретении. Используемая в настоящем изобретении пористая мембрана имеет показатели разделения и проницаемость, подходящие для свойств и применения жидкости, подвергаемой обработке.

Пористой мембраной является предпочтительно пористая мембрана, включающая пористый слой смолы, в связи с блокирующими характеристиками, проницаемостью и показателями разделения, например, грязеотталкиванием.

Пористая мембрана, включающая пористый слой смолы, предпочтительно имеет пористый слой смолы, который функционирует в качестве разделительного функционального слоя на поверхности пористого материала основы. Пористый материал основы поддерживает пористый слой смолы для усиления разделительной мембраны.

В тех случаях, когда используемая в настоящем изобретении пористая мембрана имеет пористый слой смолы на поверхности пористого материала основы, в пористый материал основы может быть внедрен или может не быть внедрен пористый слой смолы, что может быть выбрано в зависимости от использования мембраны.

Средняя толщина пористого материала основы составляет предпочтительно от 50 мкм до 3000 мкм.

Пористый материал основы состоит из органического материала и/или неорганического материала и т.д., и предпочтительно используют органическое волокно. Предпочтительные примеры пористого материала основы включают тканые материалы и нетканые материалы, состоящие из органических волокон, таких как целлюлозные волокна, волокна из триацетата целлюлозы, полиэфирные волокна, полипропиленовые волокна и полиэтиленовые волокна. Более предпочтительно используется нетканый материал, поскольку его плотность можно относительно легко контролировать, его можно просто создать, и он является недорогим.

В качестве пористого слоя смолы может предпочтительно использоваться органическая полимерная мембрана. Примеры материала органической полимерной мембраны включают полиэтилен, полипропилен, поливинилхлорид, поливинилиденфторид, полисульфон, полиэфирсульфон, полиакрилонитрил, целлюлозу и триацетат целлюлозы. Органическая полимерная мембрана может представлять собой смесь полимеров, содержащую один или более этих полимеров в качестве основного компонента. Основной компонент здесь означает, что компонент содержится в количестве, составляющем не менее 50% в весовом отношении, предпочтительно не менее 60% в весовом отношении. Предпочтительные примеры материала органической полимерной мембраны включают те, которые можно легко создать с помощью технологий и являются превосходными по физической прочности и химической устойчивости, такие как поливинилхлорид, поливинилиденфторид, полисульфон, полиэфирсульфон и полиакрилонитрил. Поливинилиденфторид или содержащая его смола в качестве основного компонента используется предпочтительно.

В качестве поливинилиденфторида предпочтительно используют гомополимер винилиденфторида. Кроме того, в качестве поливинилиденфторида также предпочтительно используется сополимер с виловыми мономерами, способными к сополимеризации с винилиденфторидом. Примеры виниловых мономеров, способных к сополимеризации с винилиденфторидом, включают тетрафторэтилен, гексафторпропилен и этиленфторид трихлорид.

Пористая мембрана, которая может использоваться в качестве разделительной мембраны в настоящем изобретении, не ограничивается при условии, что микроорганизм(ы), используемый(ые) для ферментации, не может (могут) проходить через мембрану, и предпочтительно мембрану выбирают в пределах диапазона, в котором секреции из микроорганизма(ов), используемого для ферментации, или частицы в исходном материале для ферментации не вызывают закупоривание, и показатели фильтрации устойчиво сохраняются в течение длительного времени. По этой причине средний размер пор пористой разделительной мембраны предпочтительно находится между не менее чем 0,01 мкм и не менее чем 5 мкм. Более предпочтительно средний размер пор находится между не менее чем 0,01 мкм и не менее чем 1 мкм, поскольку в этом диапазоне можно достичь и высокие блокирующие характеристики, которые не допускают просачивание микроорганизмов, и высокую проницаемость, и проницаемость может сохраняться с высокой точностью и воспроизводимостью в течение длительного периода времени.

В тех случаях, когда размер пор близок к размеру микроорганизма(ов), поры могут блокироваться микроорганизмом(ами). По этой причине средний размер пор пористой мембраны составляет предпочтительно менее чем 1 мкм. Для предотвращения просачивания микроорганизма(ов), т.е. уменьшения скорости удаления микроорганизма(ов), средний размер пор пористой мембраны является предпочтительно не слишком большим по сравнению с размером микроорганизма(ов). В тех случаях, когда используется микроорганизм с небольшим размером клетки, такой как бактерия, средний размер пор составляет предпочтительно не более чем 0,4 мкм, более предпочтительно менее чем 0,2 мкм.

В некоторых случаях микроорганизм(ы) может (могут) продуцировать вещества, отличные от представляющего интерес химического продукта, например, вещества, которые, по-видимому, агрегируют, такие как белки и полисахариды. Кроме того, в некоторых случаях гибель части микроорганизма(ов) в ферментационной культуральной жидкости может служить причиной клеточного дебриса. Для предотвращения закупоривания пористой мембраны из-за этих веществ, средний размер пор составляет еще более предпочтительно не более чем 0,1 мкм.

В тех случаях, когда средний размер пор является слишком маленьким, проницаемость пористой мембраны уменьшается, и таким образом невозможно выполнить эффективный процесс даже с использованием чистой мембраны. По этой причине средний размер пор пористой мембраны в настоящем изобретении предпочтительно составляет не менее чем 0,01 мкм, более предпочтительно не менее чем 0,02 мкм, еще более предпочтительно не менее чем 0,04 мкм.

Средний размер пор можно определить посредством измерения диаметров всех пор, которые можно наблюдать на площади 9,2 мкм × 10,4 мкм под сканирующим электронным микроскопом при увеличении 10000Х, а затем усреднения измеренных значений. Альтернативно, средний размер пор можно определить посредством фотографирования поверхности мембраны под сканирующим электронным микроскопом при увеличении 10000Х, и выбора наугад не менее 10 пор, предпочтительно не менее 20 пор, с последующим измерением диаметров этих пор и расчетом среднечислового. В тех случаях, когда пора не является круглой, ее размер можно определить с помощью способа, в котором определяют круг, площадь которого равна площади поры (эквивалентной кругу), используя устройство для обработки изображений или т.п., и затем диметр эквивалентного круга рассматривается в качестве диаметра поры.

Среднеквадратическое отклонение σ среднего размера пор пористой мембраны, используемой в настоящем изобретении, составляет предпочтительно не более чем 0,1 мкм. Среднеквадратическое отклонение σ среднего размера пор является предпочтительно минимально возможным. Среднеквадратическое отклонение σ среднего размера пор рассчитывают согласно уравнению 1, представленному ниже, где N представляет собой число пор, наблюдаемых на вышеотмеченной площади 9,2 мкм × 10,4 мкм, Xk представляет собой соответствующие измеренные диаметры, и X(ave) представляет собой среднее значение для диметра пор.

Уравнение 1

В пористой мембране, используемой в настоящем изобретении, проницаемость для ферментационной культуральной жидкости является одной из важных характеристик. В качестве показателя проницаемости может использоваться коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды. В настоящем изобретении коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды составляет предпочтительно не менее чем 5,6×10-10 м32/сек/Па при расчете посредством измерения количества просачивания воды c высотой столба = 1 м, используя очищенную воду при температуре, равной 20°С, приготовленную с использованием обратноосмотической мембраны. В тех случаях, когда коэффициент проницаемости для чистой воды составляет от 5,6×10-10 м32/сек/Па до 6×10-7 м32/сек/Па, можно достичь количества просачивания, которое является с практической точки зрения достаточным.

В пористой мембране, используемой в настоящем изобретении, шероховатость поверхности является средним значением высоты в вертикальном относительно поверхности направлении. Шероховатость поверхности мембраны является фактором, который оказывает влияние на то, насколько легко микроорганизм, прикрепленный к поверхности разделительной мембраны, отсоединяется под действием промывки поверхности мембраны движущейся жидкостью, порожденной перемешиванием или циркуляционным насосом. Шероховатость поверхности пористой мембраны не ограничивается при условии, что она находится в пределах диапазона, в котором микроорганизм(ы) и другие твердые частицы, прикрепленные к мембране, могут отсоединиться. Шероховатость поверхности составляет предпочтительно не более чем 0,1 мкм. В тех случаях, когда шероховатость поверхности составляет не более чем 0,1 мкм, микроорганизм(ы) и другие твердые частицы, прикрепленные к мембране, могут легко отсоединиться.

Было установлено, что процесс, в случае которого не требуется чрезмерная сила для промывки поверхности мембраны, можно выполнить более легко посредством использования, более предпочтительно, пористой мембраны с шероховатостью поверхности мембраны, составляющей не более чем 0,1 мкм, средним размером пор, находящимся между не менее чем 0,01 мкм и менее чем 1 мкм, и коэффициентом проницаемости для чистой воды, составляющим не менее чем 2×10-9 м32/сек/Па. В тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны составляет не более чем 0,1 мкм, поперечная сила, порождаемая на поверхности мембраны во временя фильтрации микроорганизма(ов), может быть уменьшенной, и поэтому разрушение микроорганизма(ов) может быть сдержано, и может быть также сдержано закупоривание пористой мембраны. Таким образом, можно более легко выполнять долговременную неизменную фильтрацию. Кроме того, в тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны составляет не более чем 0,1 мкм, непрерывную ферментацию можно осуществлять с использованием меньшего перепада давлений между сторонами мембраны. Следовательно, даже в тех случаях, когда произошло закупоривание пористой мембраны, можно достичь лучших показателей восстановления с использованием промывки по сравнению со случаями, когда процесс выполняют с использованием большего перепада давлений между сторонами мембраны. Поскольку сдерживание закупоривания пористой мембраны делает возможной неизменную постоянную ферментацию, шероховатость поверхности пористой мембраны является предпочтительно минимально возможной.

Шероховатость поверхности пористой мембраны здесь определяют с использованием следующего атомно-силового микроскопа (AFM) в следующих условиях.

- Устройство

Атомно-силовой микроскоп («Nanoscope IIIa», производства Digital Instruments, Inc.)

- Условия

Зонд:

SiN кантилевер (производства Digital Instruments, Inc.)

Способ сканирования:

Контактный режим (измерение в воздухе)

Подводный полуконтактный способ (измерение под водой)

Площадь сканирования:

10 мкм × 25 мкм (измерение в воздухе)

5 мкм × 10 мкм (измерение под водой)

Разрешающая способность при сканировании

512×512

- Приготовление образца

Когда осуществляли измерение, образец мембраны замачивали в этаноле при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем замачивали в воде RO-воде в течение 24 часов для ее помывки, с последующей сушкой на воздухе. RO-вода означает воду, приготовленную посредством фильтрации через обратноосмотическую мембрану (RO-мембрану), которая является типом фильтрующей мембраны для удаления примесей, таких как ионы и соли. Размер пор RO-мембраны составляет не более чем приблизительно 2 нм.

Шероховатость поверхности мембраны drough рассчитывают согласно уравнению 2, представленному ниже, на основе высоты каждой точки в направлении Z-оси, определяемой с использованием атомно-силового микроскопа (AFM).

Уравнение 2

drough: средняя шероховатость поверхности (мкм)

Zn: высота в направлении Z-оси (мкм)

Z: средняя высота на подвергнутой сканированию площади (мкм)

Формой пористой мембраны, используемой в настоящем изобретении, является предпочтительно плоская мембрана. В тех случаях, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, ее среднюю толщину выбирают в зависимости от ее применения. Средняя толщина в тех случаях, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, находится предпочтительно между 20 мкм и 5000 мкм, более предпочтительно между 50 мкм и 2000 мкм. Кроме того, формой пористой мембраны, используемой в настоящем изобретении, является предпочтительно мембрана из полых волокон. В тех случаях, когда пористой мембраной является мембрана из полых волокон, внутренний диметр полого волокна составляет предпочтительно от 200 мкм до 5000 мкм, а толщина мембраны составляет предпочтительно от 20 мкм до 2000 мкм. В полом волокне может содержаться материал или переплетение, образованный(ое) при превращении органических волокон или неорганических волокон в цилиндрическую форму.

Пористую мембрану, описанную выше, можно создать, например, с использованием способа производства, описанного в WO2007/097260.

В другом предпочтительном варианте осуществления разделительной мембраной в настоящем изобретении может быть мембрана, содержащая по крайней мере керамический материал. Керамический материал в настоящем изобретении означает вещество, которое содержит оксид металла и было подвергнуто спеканию в результате термической обработке при высокой температуре. Примеры оксида металла включают оксид алюминия, оксид магния, диоксид титана и двуокись циркония. Разделительная мембрана может быть образована не только оксидом(ами) металла или может содержать диоксид кремния и/или карбид кремния, и/или муллит и/или кордиерит, которые являются компонентами кремнезема и оксида(ов) металла.

Компоненты, образующие разделительную мембрану, отличные от керамического материала, не ограничиваются при условии, что компоненты могут образовывать пористое тело в качестве разделительной мембраны.

Даже в тех случаях, когда разделительная мембрана содержит керамический материал, форма разделительной мембраны не ограничивается и может быть любой из монолитной мембраны, плоской мембраны, трубчатой мембраны и т.п. В связи с эффективностью упаковки в контейнер разделительная мембрана предпочтительно имеет колоннообразную форму, в которой отверстие(я) для проникновения образовано(ы) в продольном направлении. В связи с увеличением эффективности упаковки, разделительная мембрана является предпочтительно монолитной мембраной.

Причина, по которой разделительная мембрана предпочтительно имеет отверстие(я) для проникновения в продольном направлении, является следующей. В тех случаях, когда разделительную мембрану, имеющую колоннообразную форму, помещают в модульный контейнер для его использования в качестве модуля с разделительной мембраной, модуляризация разделительной мембраны возможна при выборе предпочтительного образа действия из типа внешнего нажимного действия и внутреннего нажимного действия, и с использованием этого модуля может выполняться фильтрация. В настоящем изобретении сторону, на которой разделительная мембрана контактирует с ферментационной культуральной жидкостью, называют в дальнейшем первичной стороной, а сторону, на которой получают фильтрат, содержащий химический продукт, в результате фильтрации, называют в дальнейшем вторичной стороной.

В тех случаях, когда используют модуль внутреннего нажимного действия, канал на первичной стороне является узким. По этой причине можно сберечь мощность циркуляционного насоса во время поперечнопроточной фильтрации. Кроме того, механизм действия, способствующий освобождению от суспендированного вещества, собранного на поверхности разделительной мембраны, является сильным, и по этой причине поверхность разделительной мембраны, по-видимому, остается чистой, что является предпочтительным. Однако для получения этого эффекта необходимо, чтобы разделительная мембрана внутреннего нажимного действия имела входное отверстие и выходное отверстие для ферментационной культуральной жидкости. Предпочтительно входное отверстие и выходное отверстие находятся в положении, когда они расположены на прямой линии с образованием отверстия для проникновения, поскольку сопротивление потоку является небольшим в таком случае. Коме того, в тех случаях, когда разделительная мембрана имеет колоннообразную форму, а отверстие(я) для проникновения открыты в продольном направлении, можно изготовить тонкий контейнер, содержащий разделительную мембрану. Тонкий модуль с разделительной мембраной является предпочтительным ввиду производительности и манипулирования.

Пористость разделительной мембраны не ограничивается, но в тех случаях, когда пористость является слишком низкой, эффективность фильтрации является низкой, а в тех случаях, когда пористость является слишком высокой, прочность является низкой. Для достижения и высокой эффективности фильтрации, и высокой прочности разделительной мембраны, а также устойчивости к повторной стерилизации паром, пористость составляет предпочтительно от 20% до 60%

Пористость определяют согласно следующему уравнению.

Пористость [%] = 100 × (вес мембраны во влажном состоянии [г] - вес мембраны в сухом состоянии [г])/плотность воды [г/см3]/(объем мембраны [см3])

Средний размер пор разделительной мембраны составляет предпочтительно от 0,01 мкм до 1 мкм, и мембрана со средним размером пор в пределах этого диапазона с меньшей вероятностью подергается закупориванию и характеризуется превосходной эффективностью фильтрации. Кроме того, при использовании среднего размера пор в пределах диапазона от 0,02 мкм до 0,2 мкм вещества, которые легко вызывают закупоривание разделительной мембраны, такие как побочные продукты ферментации микроорганизмом или подвергнутыми культивированию клетками, включая белки и полисахариды, и клеточный дебрис, образуемый в результате гибели микроорганизма/подвергнутых культивированию клеток в культуральной жидкости, становятся менее подходящими для вызова закупоривания, что является особенно предпочтительным.

В разделительной мембране, имеющей отверстие(я) для проникновения и колоннообразную структуру, внешняя поверхность находится на вторичной стороне. Следовательно, предпочтительно, когда обеспечивается модульный контейнер для сбора фильтрата, и когда разделительная мембрана упаковывается в контейнер с образованием модуля, который будет использоваться. Одна или более разделительных мембран упаковываются в один модуль.

Модульный контейнер предпочтительно состоит из материала, устойчивого к повторной стерилизации паром. Примеры материала, устойчивого к повторной стерилизации паром, включают нержавеющую сталь и керамические материалы с низкой средней пористостью.

Такой керамический мембранный модуль можно создать, например, с помощью способа производства, описанного в WO2012/086763, или можно использовать имеющийся в продаже модуль. Конкретные примеры имеющегося в продаже модуля включают мембрану для микрофильтрации MEMBRALOX (Pall Corporation) и керамический мембранный фильтр Cefilt MF Membrane (NGK Insulators, Ltd.).

Далее ниже дается объяснение непрерывной ферментации.

В способе получения химического продукта настоящего изобретения перепад давлений между сторонами мембраны во время фильтрации не ограничивается при условии, что ферментационную культуральную жидкость можно подвергнуть фильтрации. Однако в тех случаях, когда обработку - фильтрацию выполняют для фильтрации культуральной жидкости через органическую полимерную мембрану с использованием перепада давлений между сторонами мембраны, составляющего более чем 150 кПа, структура органической полимерной мембраны с высокой долей вероятности будет разрушаться, и по этой причине способность продуцировать химический продукт будет ухудшена. В тех случаях, когда перепад давлений между сторонами мембраны составляет менее чем 0,1 кПа, может быть не получено достаточное количество фильтрата ферментационной культуральной жидкости, и выработка при продукции химического продукта является, как правило, низкой. Соответственно, когда органическая полимерная мембрана используется в способе получения химического продукта настоящего изобретения, перепад давлений между сторонами мембраны, который является фильтрационным давлением, находится предпочтительно в диапазоне от 0,1 кПа до 150 кПа, поскольку в таком случае количество фильтрата ферментационной культуральной жидкости может быть большим, и не происходит уменьшение способности продуцировать химический продукт вследствие разрушения структуры мембраны. Следовательно, способность продуцировать химический продукт может оставаться высокой в таком случае. В случаях органической полимерной мембраны перепад давлений между сторонами мембраны находится более предпочтительно в пределах диапазона от 0,1 кПа до 50 кПа, еще более предпочтительно в пределах диапазона от 0,1 до 20 кПа.

Также в тех случаях, когда используется керамическая мембрана, перепад давлений между сторонами мембраны во время фильтрации не ограничивается при условии, что ферментационную культуральную жидкость можно подвергнуть фильтрации. Перепад давлений между сторонами мембраны составляет предпочтительно не более чем 500 кПа. В тех случаях, когда процесс проводят при разнице давлений, составляющей не менее чем 500 кПа, закупоривание мембраны может происходить с вызовом проблемы в процессе непрерывной ферментации.

В виде движущей силы фильтрации может использоваться сифон, используя перепад между уровнями жидкостей (перепад между располагаемыми высотами) между ферментационной культуральной жидкостью и жидкостью, обработанной благодаря пористой мембране, или поперечнопроточный циркуляционный насос, для создания перепада давлений между сторонами мембраны в разделительной мембране. Кроме того, в качестве движущей силы фильтрации всасывающий насос может быть помещен с вторичной стороны разделительной мембраны. В тех случаях, когда используется поперечнопроточный циркуляционный насос, перепад давлений между сторонами мембраны можно контролировать с помощью всасывающего насоса. Перепад давлений между сторонами мембраны можно также контролировать с помощью давления газа или жидкости, который используют для применения давления со стороны ферментационной жидкости. В тех случаях, когда осуществляют такой контроль давления, перепад между давлением со стороны ферментационной жидкости и давлением со стороны жидкости, обработанной благодаря пористой мембране, может рассматриваться как перепад давлений между сторонами мембраны и может использоваться для контролирования перепада давлений между сторонами мембраны.

В настоящем изобретении концентрация пентозы в общем количестве фильтрата, который прошел через разделительную мембрану, предпочтительно сохраняется на уровне, составляющем не более чем 5 г/л. В тех случаях, когда непрерывную ферментацию микроорганизмом(ами), который подвергается подавлению катаболитами, осуществляют с использованием исходного материала для ферментации, содержащего смешанный сахар, содержащий гексозу и пентозу, культуральная среда постоянно используется для ферментации. По этой причине микроорганизм(ы) подвергается подавлению катаболитами более непрерывно, чем в случаях периодической ферментации. В результате только пентоза остается в большом количестве в культуральной жидкости, и выход продукции уменьшается. В настоящем изобретении, посредством использования разделительной мембраны при непрерывной ферментации, концентрация пентозы в общем количестве фильтра может сохраняться на уровне, составляющем не более чем 5 г/л, даже в тех случаях, когда используется микроорганизм(ы), который подвергается подавлению катаболитами. В результате выход продукции химического продукта может быть увеличен по сравнению с непрерывной ферментацией без использования разделительной мембраны. В тех случаях, когда пентоза остается на уровне, не меньшем чем 5 г/л. в общем количестве фильтрата, полученного с использованием разделительной мембраны, эффект увеличения выхода, исходя из пентозы, может быть уменьшен, приводя к уменьшенному выходу продукции. Выход продукции здесь означает выход продукции при непрерывной ферментации и рассчитывается согласно уравнению 3, представленному ниже, где количество химического продукта (г), продуцированного в результате потребления материала источника углерода во время определенного периода, делят на количество источника углерода, поданного (г) во время этого периода. При этом расчете сахар, который не использовался для продукции продукта, также включают в количество поданного источника углерода.

Выход продукции (г/г) = Количество продукта (г)/Количество подданного источника углерода (г) (уравнение 3).

Концентрацию пентозы в общем количестве фильтрата можно контролировать в соответствии с условиями культивирования. Например, посредством изменения концентрации сахара в исходном материале для ферментации, скорости подачи сахара и/или степени разбавления можно уменьшить концентрацию пентозы в общем количестве фильтрата. Альтернативно, посредством увеличения питательных веществ(а), содержащихся в исходном материале для ферментации, потребление сахара микроорганизмом(ами) можно увеличить, а концентрацию пентозы в общем количестве фильтрата можно уменьшить.

В настоящем изобретении рН и температура во время ферментационного культивирования микроорганизма(ов) не ограничиваются при условии, что они находятся в пределах диапазонов, в которых микроорганизм(ы) может (могут) расти. Культивирование предпочтительно осуществляют при рН в пределах диапазона от 4 до 8 и при температуре в диапазоне от 20 до 75°С. рН культуральной жидкости доводят заранее с использованием неорганической или органической кислоты, щелочи, мочевины, карбоната кальция, газообразного аммиака или т.п. до заранее заданного рН в диапазоне, обычно, от 4 до 8. В тех случаях, когда необходимо увеличить скорость подачи кислорода, скорость подачи можно увеличить, например, посредством сохранения концентрации кислорода на уровне, составляющем не менее чем 21%, с помощью добавления кислорода в воздух, увеличения давления в культуральной жидкости, увеличения скорости перемешивания и/или увеличения скорости аэрации.

В способе получения химического продукта настоящего изобретения непрерывная ферментация (фильтрация культуральной жидкости) может начинаться после увеличения концентрации микроорганизмов с помощью выполнения периодического культивирования или культивирования с подпиткой на ранней стадии культивирования. Альтернативно, клетки микроорганизма могут быть засеяны в высокой концентрации, и непрерывная ферментация может затем проводиться с начала культивирования. В способе получения химического продукта настоящего изобретения подача среды для культивирования и фильтрация культуральной жидкости могут выполняться, исходя из соответствующего выбора(ов) времени. Необязательно, чтобы выборы времени начала подачи среды для культивирования и фильтрации культуральной жидкости были одинаковыми. Подача среды для культивирования и фильтрация культуральной жидкости могут выполняться или постоянно, или периодически.

Питательное вещество(а), необходимое для роста клеток микроорганизма, может быть добавлено в свежую культуральную жидкость для допуска непрерывного роста клеток. Для достижения эффективной выработки концентрацию микроорганизма в культуральной жидкости предпочтительно поддерживают из условия, чтобы сохранялась высокая выработка химического продукта. Хорошей эффективности продукции можно достичь посредством поддержания концентрации микроорганизма в культуральной жидкости, например, на уровне, составляющем не менее 5 г/л на основе веса в сухом состоянии.

При необходимости, во время непрерывной ферментации в способе получения химического продукта настоящего изобретения, концентрацию микроорганизмов в сосуде для культивирования можно контролировать посредством удаления части культуральной жидкости, содержащей микроорганизмы(ы), из ферментера и затем разбавления культуральной жидкости в сосуде средой для культивирования. Например, когда концентрация микроорганизмов в ферментере является слишком высокой, по-видимому, происходит закупоривание разделительной мембраны. Закупоривания можно избежать посредством удаления части культуральной жидкости, содержащей микроорганизмы(ы), и затем разбавления культуральной жидкости в ферментере средой для культивирования. Кроме того, показатели продукции химического продукта можно изменять в зависимости от концентрации микроорганизмов в ферментере. Показатели продукции можно поддерживать посредством удаления части культуральной жидкости, содержащей микроорганизмы(ы), и затем разбавления культуральной жидкости в ферментере средой для культивирования, используя показатели продукции в качестве показателя.

В способе получения химического продукта настоящего изобретения число ферментеров не ограничивается при условии, что осуществляется непрерывное культивирование с ферментацией в результате роста клеток микроорганизма при допуске продукции клетками продукта.

В настоящем изобретении можно достичь более высокой скорости продукции на объем по сравнению с традиционной периодической ферментацией, и, следовательно, возможна очень эффективная непрерывная ферментационная продукция. Скорость продукции при непрерывном культивировании с ферментацией здесь можно рассчитать согласно уравнению (4), представленному ниже.

Скорость ферментационной продукции (г/л/ч) = Концентрация продукта в фильтрате (г/л) × Скорость удаления ферментационной культуральной жидкости (л/ч)/Рабочий объем жидкости в устройстве (л) (уравнение 4).

Скорость ферментационной продукции в случае периодического культивирования можно определить делением количества продукта (г) после полного потребления источника углерода в исходном материале на время (ч), требуемое для потребления источника углерода, и объем (л) ферментационной культуральной жидкости в это время.

Выход в случае непрерывного культивирования можно рассчитать согласно уравнению (5), представленному ниже, делением количества химического продукта (г), продуцированного в результате потребления источника углерода в исходном материале во время заранее заданного периода времени, на значение, полученное вычитанием количества источника углерода, неиспользованного микроорганизмом(ами), (г) из количества источника углерода (г), поданного во время этого периода. Выход, как используется в настоящем описании, означает именно это, кроме особо оговоренных случаев.

Выход (г/г) = Количество продукта (г)/{Количество подданного источника углерода (г) - Количество неиспользованного источника углерода (г)} (уравнение 5).

Используемое в настоящем изобретении устройство для непрерывной ферментации не ограничивается при условии, что оно является устройством для получения химического продукта в результате непрерывной ферментации, в котором ферментируемая микроорганизмом(ами) культуральная жидкость фильтруется через разделительную мембрану, и продукт выделяют из фильтрата, в то время как не подвергнутая фильтрованию жидкость остается, или возвращается, в ферментационную культуральную(ой) жидкость(и); в ферментационную культуральную жидкость добавляют исходный материал для ферментации, и выделяют продукт в фильтрате. Конкретные примеры устройства, в котором используется органическая полимерная мембрана, включают устройства, описанные в WO2007/097260. Конкретные примеры устройства, в котором используется керамическая мембрана, включают устройства, описанные в WO2012/086763.

Затем ниже дается объяснение микроорганизма(ов), который(ые) может (могут) использоваться в способе получения химического продукта настоящего изобретения.

Микроорганизм, который подвергается подавлению катаболитами, используемый в настоящем изобретении, как правило, означает микроорганизм, который метаболизирует пентозу, и чье потребление пентозы подавляется при проведении ферментации с использованием исходного материала для ферментации, включающего смешанный сахар, содержащий гексозу и пентозу. Конкретнее, в настоящем изобретении, «микроорганизм, который подвергается подавлению катаболитами», относится к микроорганизму, который способен метаболизировать глюкозу и ксилозу, и чье потребление ксилозы является более медленным в среде для культивирования, включающей смешанный сахар, содержащий глюкозу и ксилозу, чем в среде для культивирования, включающей только ксилозу, при его культивировании с использованием периодической культуры.

Скорость потребления ксилозы в среде для культивирования, содержащей только ксилозу, рассчитывают согласно уравнению 6, приведенному ниже.

Скорость потребления ксилозы (г/л/ч) = Общее количество ксилозы (г), содержащейся в исходном материале для ферментации, в начале культивирования/Время (ч), требуемое для полного потребления ксилозы, содержащейся в исходном материале для ферментации, после начала культивирования/Количество ферментационной жидкости (л) (уравнение 6).

Скорость потребления ксилозы в среде для культивирования, включающей смешанный сахар, содержащий глюкозу и ксилозу, означает скорость потребления ксилозы в присутствии глюкозы в среде для культивирования, включающей смешанный сахар, содержащий глюкозу и ксилозу, и рассчитывают согласно уравнению 7, приведенному ниже.

Скорость потребления ксилозы (г/л/ч) = Количество ксилозы (г), потребленной с начала культивирования до момента времени Т/Продолжительность (ч) от начала культивирования до момента времени Т/Количество ферментационной жидкости (л) (уравнение 7).

При расчете скоростей потребления ксилозы в уравнении 6 и уравнении 7 устанавливают весовое соотношение между глюкозой и ксилозой в смешанном сахаре = 1:1. При сравнении скоростей потребления ксилозы концентрация сахара не ограничивается при условии, что микроорганизм может полностью потребить сахар, не оставляя остаточный сахар. Концентрацию сахара в среде для культивирования, содержащей только ксилозу, устанавливают равной общей концентрации сахара в среде для культивирования, содержащей смешанный сахар, содержащий глюкозу и ксилозу.

В уравнении 7 моментом времени Т является момент времени полного потребления глюкозы. Момент времени Т можно определить посредством определения концентрации глюкозы в отобранном образце культуральной жидкости с помощью HPLC, или с использованием набора или сенсора. В тех случаях, когда полное потребление глюкозы имело место позже полного потребления ксилозы, момент времени Т определяют как момент времени полного потребления ксилозы. Также в таких случаях, момент времени Т можно определить посредством определения концентрации ксилозы так же, как в способе определения концентрации глюкозы. В тех случаях, когда количество ферментационной жидкости изменено в результате добавления нейтрализатора или в результате отбора образца во время культивирования, расчет выполняют, принимая во внимание количество жидкости, добавленной в культуральную жидкость, или уменьшенное количество жидкости.

Микроорганизм, который подвергается подавлению катаболитами, выбирают из дрожжей, таких как хлебопекарные дрожжи, бактерии, такие как E.coli и коринебактерии; мицелиальные грибы; актиномицеты и т.п., которые часто используются в бродильном производстве. Конкретные примеры микроорганизмов, которые можно выбрать, включают дрожжи, такие как Pichia, Candida, Pachysolen, Kluyveromyces, Hansenula, Torulopsis, Debaryomyces, Issachenkia, Brettanomyces, Lindnera и Wickerhamomyces; энтеробактерии, такие как Clostridium, Enterobacter, Escherichia и Klebsiella; лактобактерии, такие как Lactobacillus и Lactococcus; актиномицеты, такие как Actinoplanes, Arthrobacter и Streptomyces; и микроорганизмы, относящиеся к Bacillus, Paenibacillus, Aerobacter, Ampullariella, Staphylococcus, Thermoanaerobacter или Thermus.

Микроорганизм, который подвергается подавлению катаболитами, можно выбрать или из микроорганизмов, выделенных из природной среды, или из микроорганизмов, которые изначально не метаболизируют пентозу, но модифицированы в результате мутации или генетической рекомбинации, так что они метаболизируют пентозу. Конкретные примеры микроорганизмов, которые модифицированы в результате генетической рекомбинации, так что они метаболизируют пентозу, включают микроорганизмы, в которые ген для метаболизма пентозы введен или усилен в результате генетической рекомбинации. Конкретные примеры генов для метаболизма ксилозы среди пентоз включают гены для таких ферментов, как ксилозоизомераза, ксилозоредуктаза, ксилитолдегидрогеназа и ксилозокиназа, а примеры микроорганизмов, которым придана способность к метаболизму ксилозы с помощью такой генетической рекомбинации, включают микроорганизмы, описанные в JP 2006-525029 A, JP 2009-112289 A и JP 2010-504756 A.

Химический продукт, получаемый согласно настоящему изобретению, не ограничивается при условии, что он является веществом, продуцируемым в ферментационной культуральной жидкости описанными выше микроорганизмами. Примеры химического продукта включают спирты, органические кислоты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, которые являются веществами, производимыми в крупном масштабе в бродильном производстве. Примеры веществ включают спирты, такие как этанол, 1,3-пропандиол, 1,3-бутандиол, 2,3-бутандиол, 1,4-бутандиол, глицерин, бутанол, изобутанол, 2-бутанол и изопропанол; органические кислоты, такие как уксусная кислота, молочная кислота, адипиновая кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, итаконовая кислота и лимонная кислота; нуклеиновые кислоты, такие как нуклеозиды, включая инозин и гуанозин, и нуклеотиды, включая инозиновую кислоту и гуаниловую кислоту; и соединения диамины, такие как кадаверин. Кроме того, настоящее изобретение может также использоваться для получения таких веществ, как ферменты, антибиотики и рекомбинантные белки. Эти химические продукты можно выделить из фильтрата с помощью хорошо известных методов (разделения с использованием мембраны, концентрирования, дистилляции, кристаллизации, экстракции и т.п.)

ПРИМЕРЫ

Теперь настоящее изобретение будет описано конкретно через примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается ими.

Справочный пример 1: Способ анализа глюкозы, ксилозы, этанола и 2,3-бутандиола

Концентрации глюкозы, ксилозы, этанола и 2,3-бутандиола в ферментационной жидкости определяли в следующих условиях HPLC при сравнении со стандартными образцами.

Колонка: Shodex SH1011 (производства Showa Denko K.K.)

Подвижная фаза: 5 мМ серная кислота (скорость потока: 0,6 мл/мин)

Реакционная жидкость: нет

Способ детектирования: RI (дифференциальный показатель преломления)

Температура: 65°С

Справочный пример 1: Способ анализа молочной кислоты

Количественный анализ молочной кислоты в ферментационной жидкости проводили в следующих условиях HPLC при сравнении со стандартными образцами.

Колонка: Shim-Pack SpR-H (производства Shimadzu Corporation)

Подвижная фаза: 5 мМ пара-толуолсульфокислота (скорость потока: 0,8 мл/мин)

Реакционная жидкость: 5 мМ пара-толуолсульфокислота, 20 мМ Bis-Tris, 0,1 мМ EDTA-2Na (скорость потока: 0,8 мл/мин)

Способ детектирования: электропроводность

Температура: 45°С

Справочный пример 3: Расчет скорости потребления ксилозы Bacillus coagulans

Рассчитывали скорость потребления ксилозы при ферментации с продукцией молочной кислоты с помощью микроорганизма для молочнокислого брожения, штамма NBRC12714 Bacillus coagulans. В качестве среды для культивирования использовали содержащую ксилозу среду для молочнокислого брожения, имеющую состав, представленный в таблице 1, или содержащую смешанный сахар среду 1 для молочнокислого брожения, представленную в таблице 2. Отбор образцов выполняли соответствующим образом. Концентрации глюкозы и ксилозы в культуральной жидкости определяли с помощью способа справочного примера 1, а концентрацию молочной кислоты в качестве продукта определяли с помощью способа справочного примера 2.

Таблица 1
Содержащая ксилозу среда для молочнокислого брожения
Ксилоза 100 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Сульфат аммония 1 г
K2HPO4 0,4 г
Единица (1/литр)
Таблица 2
Содержащая смешанный сахар среда 1 для молочнокислого брожения
Глюкоза 50 г
Ксилоза 50 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Сульфат аммония 1 г
K2HPO4 0,4 г
Единица (1/литр)

Штамм NBRC12714 Bacillus coagulans культивировали в 50 мл среды для предварительного культивирования (10 г/л полипептона, 2 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сульфата магния 7Н2О), дополненной карбонатом кальция, в колбе в течение 24 часов с перемешиванием (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1 л содержащей ксилозу среды для молочнокислого брожения или содержащей смешанный сахар среды 1 для молочнокислого брожения с продуванием газом-азотом, и периодическую ферментацию выполняли в следующих условиях.

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 50 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде (газ-азот): 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде: 200 (об./мин)

Доведение рН: с доведением до рН 7 с использованием 5н Ca(OH)2

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Скорости потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде для молочнокислого брожения или содержащей смешанный сахар среде 1 для молочнокислого брожения рассчитывали согласно уравнению 6 и уравнению 7, представленным выше, соответственно. Результаты расчетов представлены в таблице 7. Исходя из этих результатов, вынесли решение, что штамм NBRC12714 Bacillus coagulans является микроорганизмом, который подвергается подавлению катаболитами.

Справочный пример 4: Расчет скорости потребления ксилозы Candida tropicalis

Рассчитывали скорость потребления ксилозы при ферментации с продукцией этанола с помощью микроорганизма для этилового брожения, штамма NBRC0199 Candida tropicalis. В качестве среды для культивирования использовали содержащую ксилозу среду для этилового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 3, или содержащую смешанный сахар среду 1 для этилового брожения, представленную в таблице 4. Отбор образцов выполняли соответствующим образом. Концентрации глюкозы и ксилозы в культуральной жидкости и концентрацию этанола в качестве продукта определяли с помощью способа справочного примера 1.

Таблица 3
Содержащая ксилозу среда для этилового брожения
Ксилоза 100 г
Пептон 20 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Единица (1/литр)
Таблица 4
Содержащая смешанный сахар среда 1 для этилового брожения
Глюкоза 50 г
Ксилоза 50 г
Пептон 20 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Единица (1/литр)

Штамм NBRC0199 Candida tropicalis культивировали в 2 мл среды YPD в пробирке при 30°С в течение ночи с перемешиванием (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл свежей среды YPD, и культивирование осуществляли в течение ночи с перемешиванием в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 2 л содержащей ксилозу среды для этилового брожения или содержащей смешанный сахар среды для этилового брожения, и периодическое культивирование выполняли в следующих условиях.

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде: 800 (об./мин)

Доведение рН: нет

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Скорости потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде для этилового брожения и содержащей смешанный сахар среде 1 для этилового брожения рассчитывали согласно уравнению 6 и уравнению 7, представленным выше, соответственно. Результаты расчетов представлены в таблице 7. Исходя из этих результатов, вынесли решение, что штамм NBRC0199 Candida tropicalis является микроорганизмом, который подвергается подавлению катаболитами.

Справочный пример 5: Расчет скорости потребления ксилозы Paenibacillus polymyxa

Рассчитывали скорость потребления ксилозы при ферментации с продукцией 2,3-бутандиола с помощью микроорганизма для 2,3-бутандиолового брожения, штамма ATCC12321 Paenibacillus polymyxa. В качестве среды для культивирования использовали содержащую ксилозу среду для 2,3-бутандиолового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 5, или содержащую смешанный сахар среду 1 для 2,3-бутандиолового брожения, представленную в таблице 6. Отбор образцов выполняли соответствующим образом, и концентрации глюкозы и ксилозы в культуральной жидкости и концентрацию 2,3-бутандиола в качестве продукта определяли с помощью способа справочного примера 1.

Таблица 5
Содержащая ксилозу среда для 2,3-бутандиолового брожения
Ксилоза 60 г
Дрожжевой экстракт 13,1 г
Сульфат аммония 5,8 г
KH2PO4 1,75 г
K2HPO4 9,2 г
(NH4)2HPO4 2,9 г
CaCl2·2H2O 8,8 мг
FeSO4·7H2O 44 мг
MnSO4·5H2O 1,28 мг
ZnSO4·7H2O 0,9 мг
MgSO4·7H2O 219 мг
EDTA·2Na 44 мг
Единица (1/литр)
Таблица 6
Содержащая смешанный сахар среда 1 для 2,3-бутандиолового брожения
Глюкоза 30 г
Ксилоза 30 г
Дрожжевой экстракт 13,1 г
Сульфат аммония 5,8 г
KH2PO4 1,75 г
K2HPO4 9,2 г
(NH4)2HPO4 2,9 г
CaCl2·2H2O 8,8 мг
FeSO4·7H2O 44 мг
MnSO4·5H2O 1,28 мг
ZnSO4·7H2O 0,9 мг
MgSO4·7H2O 219 мг
EDTA·2Na 44 мг
Единица (1/литр)

Штамм ATCC12321 Paenibacillus polymyxa культивировали в 50 мл среды для предварительного культивирования (5 г/л глюкозы; 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) в пробирке с перемешиванием в течение 24 часов (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1 л содержащей ксилозу среды для 2,3-бутандиолового брожения или содержащей смешанный сахар среды для 2,3-бутандиолового брожения, и периодическое культивирование выполняли в следующих условиях.

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде: 800 (об./мин)

Доведение рН: с доведением до рН 6,5 с использованием 5н NaOH.

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Скорости потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде для 2,3-бутандиолового брожения и содержащей смешанный сахар среде 1 для 2,3-бутандиолового брожения рассчитывали согласно уравнению 6 и уравнению 7, представленным выше, соответственно. Результаты расчетов представлены в таблице 7. Исходя из этих результатов, вынесли решение, что штамм ATCC12321 Paenibacillus polymyxa является микроорганизмом, который подвергается подавлению катаболитами.

Таблица 7
Справочный пример 3 Справочный пример 4 Справочный пример 5
Скорость потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде (г/л/ч) 0,78 2,70 0,82
Скорость потребления ксилозы в содержащей смешанный сахар среде (г/л/ч) 0,33 0,48 0,08

Сравнительный пример 1: Продукция L-молочной кислоты посредством периодического культивирования Bacillus coagulans c использованием гексозы (глюкозы) в качестве исходного материала для ферментации.

В качестве микроорганизма для ферментации с продукцией L-молочной кислоты использовали штамм NBRC12714 Bacillus coagulans, а в качестве среды для культивирования использовали среду для молочнокислого брожения, имеющую состав, представленный в таблице 8. Штамм NBRC12714 Bacillus coagulans культивировали в 50 мл среды для предварительного культивирования (10 г/л полипептона, 2 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сульфата магния 7Н2О), дополненной карбонатом кальция, в колбе в течение 24 часов с перемешиванием (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1 л среды для молочнокислого брожения с продуванием газом-азотом, и периодическое культивирование выполняли в течение 96 часов в условиях справочного примера 3 (таблица 11).

Таблица 8
Среда для молочнокислого брожения
Глюкоза 100 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Сульфат аммония 1 г
K2HPO4 0,4 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 2: Продукция L-молочной кислоты посредством периодического культивирования Bacillus coagulans с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

Штамм NBRC12714 Bacillus coagulans подвергали периодическому культивированию в течение 128 часов с использованием содержащей смешанный сахар среды для молочнокислого брожения, представленной в таблице 2, в тех же условиях, что и в сравнительном примере 1 (таблица 11).

Сравнительный пример 3: Продукция L-молочной кислоты посредством непрерывного культивирования Bacillus coagulans с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, осуществляли непрерывное культивирование с использованием содержащей смешанный сахар среды 1 для молочнокислого брожения, имеющей состав, представленный в таблице 2, без использования разделительной мембраны. Штамм NBRC12714 Bacillus coagulans культивировали с перемешиванием в условиях, одинаковых с условиями для предварительного культивирования в сравнительном примере 1 (культура до предварительной культуры). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в 1,5 л содержащей смешанный сахар среды для молочнокислого брожения с продуванием газом-азотом. В реакционном сосуде для ферментации, заполненным азотом, выполняли периодическое культивирование с перемешиванием со скорость 200 об./мин с помощью мешалки, присоединенной к реакционному сосуду для ферментации, при контролировании температуры, до полного потребления сахара в культуральной жидкости (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали процесс откачивания для сбора ферментационной жидкости, и постоянно подавали среду для культивирования. При контролировании количества сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, так что количество ферментационной жидкости в устройстве для непрерывной ферментации составляло 1,5 л, выполняли непрерывное культивирование в течение 300 часов в следующих условиях для продукции молочной кислоты (таблица 11).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 50 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде (газ-азот): 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде: 200 (об./мин)

Доведение рН: с доведением до рН 7 с использованием 5н Ca(OH)2

Количество собираемой ферментационной жидкости: 3 (л/день)

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Пример 1: Продукция L-молочной кислоты посредством непрерывного культивирования Bacillus coagulans с использованием смешанного сахара (глюкоза, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны 1.

С использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, осуществляли непрерывное культивирование с использованием содержащей смешанный сахар среды для молочнокислого брожения, имеющей состав, представленный в таблице 2, с использованием разделительной мембраны. Используемый элемент с разделительной мембраной был в форме полых волокон. Штамм NBRC12714 Bacillus coagulans культивировали с перемешиванием в условиях, одинаковых с условиями для предварительного культивирования в сравнительном примере 1 (культура до предварительной культуры). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в 1,5 л содержащей смешанный сахар среды для молочнокислого брожения с продуванием газом-азотом. В реакционном сосуде для ферментации, заполненным азотом, выполняли периодическое культивирование с перемешиванием со скорость 200 об./мин с помощью мешалки, присоединенной к реакционному сосуду для ферментации, при контролировании температуры, до полного потребления сахара в культуральной жидкости (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали процесс перекачивания для циркуляции ферментационной жидкости, и постоянно подавали среду для культивирования. При контролировании количества культуральной жидкости, подвергаемой фильтрации, так что количество ферментационной жидкости в устройстве для непрерывной ферментации составляло 1,5 л, выполняли непрерывное культивирование в течение 290 часов в следующих условиях для продукции молочной кислоты (таблица 11).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: фильтрующая мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации элемента с разделительной мембраной: 473 (см3)

Установка температуры: 50 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде для ферментации (газ-азот): 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде для ферментации: 200 (об./мин)

Количество собираемой ферментационной жидкости: 3 (л/день)

Стерилизация: все используемые сосуды для культивирования, включающие элемент с разделительной мембраной, и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Используемой мембраной была мембрана со следующими свойствами, и допускали изменение перепада давлений между сторонами мембраны в пределах диапазона от 0,1 до 20 кПа.

Средний размер пор: 0,1 мкм

Среднеквадратическое отклонение среднего размера пор: 0,035 мкм

Шероховатость поверхности мембраны: 0,06 мкм

Коэффициент проницаемости для чистой воды: 50×10-9 м32/сек/Па.

Пример 2: Непрерывное культивирование Bacillus coagulans с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны 2.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 2 для молочнокислого брожения, представленной в таблице 9, осуществляли непрерывное культивирование в течение 305 часов с использованием разделительной мембраны в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в примере 1, для продукции L-молочной кислоты (таблица 11).

Таблица 9
Содержащая смешанный сахар среда 2 для молочнокислого брожения
Глюкоза 80 г
Ксилоза 20 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Сульфат аммония 1 г
K2HPO4 0,4 г
Единица (1/литр)

Пример 3: Непрерывное культивирование Bacillus с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны 3.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 3 для молочнокислого брожения, представленной в таблице 10, осуществляли непрерывное культивирование в течение 300 часов с использованием разделительной мембраны в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в примере 1, для продукции L-молочной кислоты (таблица 11).

Таблица 10
Содержащая смешанный сахар среда 3 для молочнокислого брожения
Глюкоза 20 г
Ксилоза 80 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Сульфат аммония 1 г
K2HPO4 0,4 г
Единица (1/литр)
Таблица 11
Сравнительный пример 1 Сравнительный пример 2 Сравнительный пример 3 Пример 1 Пример 2 Пример 3
Период времени ферментации (ч) 96 128 300 290 305 300
Общее количество поданной глюкозы (г) 100 50 1870 1810 3050 750
Общее количество поданной ксилозы (г) 0 50 1870 1810 760 3000
Общая продукция молочной кислоты 75 66 1700 3040 3180 3150
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 1310 35 40 40
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 0 35 1 1 1
Выход (г/г) 0,75 0,66 0,70 0,85 0,84 0,85

Сравнительный пример 4: Продукция этанола посредством периодического культивирования Candida tropicalis с использованием гексозы (глюкозы) в качестве исходного материала для ферментации.

Штамм NBRC0199 Candida tropicalis использовали в качестве микроорганизма для этилового брожения, а в качестве среды для культивирования использовали среду для этилового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 12. Штамм NBRC0199 Candida tropicalis культивировали в 2 мл среды YPD в пробирке при 30°С в течение ночи с перемешиванием (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл свежей среды YPD, и культивирование осуществляли в течение ночи с перемешиванием в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1,5 л среды для этилового брожения, и периодическое культивирование выполняли в течение 16 часов в следующих условиях для продукции этанола (таблица 14).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде: 800 (об./мин)

Доведение рН: нет

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Таблица 12
Среда для этилового брожения
Глюкоза 70 г
Пептон 20 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 5: Продукция этанола посредством периодического культивирования Candida tropicalis с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 2 для этилового брожения, представленной в таблице 13, осуществляли периодическое культивирование в течение 23 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 4, для продукции этанола (таблица 14).

Таблица 13
Содержащая смешанный сахар среда 2 для этилового брожения
Глюкоза 30 г
Ксилоза 40 г
Пептон 20 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 6: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Candida tropicalis с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 2 для этилового брожения, представленной в таблице 13, в качестве среды для культивирования, осуществляли непрерывную ферментацию без использования разделительной мембраны. Штамм NBRC0199 Candida tropicalis культивировали в 2 мл среды YPD в пробирке при 30°С в течение ночи с перемешиванием (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл свежей среды YPD, и культивирование осуществляли в течение ночи с перемешиванием в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера (культура до предварительной культуры). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в 1,5 л содержащей смешанный сахар среды 2 для этилового брожения в устройстве для непрерывной ферментации, и культивирование выполняли в течение 16 часов с перемешиванием со скорость 800 об./мин с помощью мешалки, присоединенной к реакционному сосуду для ферментации, при контролировании скорости аэрации и температуры в реакционном сосуде для ферментации (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали процесс откачивания для сбора ферментационной жидкости, и постоянно подавали среду для культивирования. При контролировании количества сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, так что количество ферментационной жидкости в устройстве для непрерывной ферментации составляло 1,5 л, выполняли непрерывное культивирование в течение 295 часов в следующих условиях для продукции этанола (таблица 14).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде для ферментации: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде для ферментации: 800 (об./мин)

Доведение рН: нет

Количество собираемой ферментационной жидкости: 1 (л/день)

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Пример 4: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Candida tropicalis с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 2 для этилового брожения, имеющей состав, представленный в таблице 13, в качестве среды для культивирования, осуществляли непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Используемый элемент с разделительной мембраной был в форме плоской мембраны. Штамм NBRC0199 Candida tropicalis культивировали в 2 мл среды YPD в пробирке при 30°С в течение ночи (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл свежей среды YPD, и культивирование осуществляли в течение ночи с перемешиванием в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера (культура до предварительной культуры). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в 1,5 л содержащей смешанный сахар среды 2 для этилового брожения в устройстве для непрерывной ферментации, и культивирование выполняли в течение 36 часов с перемешиванием со скорость 800 об./мин с помощью мешалки, присоединенной к реакционному сосуду для ферментации, при контролировании скорости аэрации и температуры в реакционном сосуде для ферментации (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали процесс перекачивания для циркуляции ферментационной жидкости, и постоянно подавали среду для культивирования. При контролировании количества культуральной жидкости, подвергаемой фильтрации, так что количество ферментационной жидкости в устройстве для непрерывной ферментации составляло 1,5 л, выполняли непрерывное культивирование в течение 300 часов в следующих условиях для продукции этанола (таблица 14).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: фильтрующая мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации элемента с разделительной мембраной: 120 (см3)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде для ферментации: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде для ферментации: 800 (об./мин)

Доведение рН: нет

Количество собираемой ферментационной жидкости: 1 (л/день)

Стерилизация: все используемые сосуды для культивирования, включающие элемент с разделительной мембраной, и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Используемой мембраной была мембрана со свойствами, одинаковыми с таковыми, описанными в примере 1, и допускали изменение перепада давлений между сторонами мембраны в пределах диапазона от 0,1 до 19,6 кПа.

Таблица 14
Сравнительный пример 4 Сравнительный пример 5 Сравнительный пример 6 Пример 4
Период времени ферментации (ч) 16 23 295 300
Общее количество поданной глюкозы (г) 70 30 370 375
Общее количество поданной ксилозы (г) 0 40 490 500
Общая продукция этанола (г) 32 17 215 290
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 50 13
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 0 4 1
Выход (г/г) 0,46 0,24 0,27 0,34

Сравнительный пример 7: Продукция 2,3-бутандиола посредством периодического культивирования Paenibacillus polymyxa с использованием гексозы (глюкозы) в качестве исходного материала для ферментации.

Использовали штамм ATCC12321 Paenibacillus polymyxa, который является продуцирующим 2,3-бутандиол микроорганизмом, и среду для 2,3-бутандиолового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 15, в качестве среды для культивирования.

Таблица 15
Среда для 2,3-бутандиолового брожения
Глюкоза 60 г
Дрожжевой экстракт 13,1 г
Сульфат аммония 5,8 г
KH2PO4 1,75 г
K2HPO4 9,2 г
(NH4)2HPO4 2,9 г
CaCI2·2H2O 8,8 мг
FeSO4·7H2O 44 мг
MnSO4·5H2O 1,28 мг
ZnSO4·7H2O 0,9 мг
MgSO4·7H2O 219 мг
EDTA·2Na 44 мг
Единица (1/литр)

Штамм ATCC12321 Paenibacillus polymyxa культивировали в 50 мл среды для предварительного культивирования (5 г/л глюкозы; 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) в пробирке с перемешиванием в течение 24 часов (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1 л среды для 2,3-бутандиолового брожения, и периодическое культивирование выполняли в следующих условиях в течение 27 часов для продукции 2,3-бутандиола.

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде: 800 (об./мин)

Доведение рН: с доведением до рН 6,5 с использованием 5н NaOH.

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Сравнительный пример 8: Продукция 2,3-бутандиола посредством периодического культивирования Paenibacillus polymyxa с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 2 для 2,3-бутандиолового брожения, представленной в таблице 16, осуществляли периодическое культивирование в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 7, в течение 50 часов для продукции 2,3-бутандиола (таблица 17).

Таблица 16
Содержащая смешанный сахар среда 2 для 2,3-бутандиолового брожения
Глюкоза 20 г
Ксилоза 40 г
Дрожжевой экстракт 13,1 г
Сульфат аммония 5,8 г
KH2PO4 1,75 г
K2HPO4 9,2 г
(NH4)2HPO4 2,9 г
CaCl2·2H2O 8,8 мг
FeSO4·7H2O 44 мг
MnSO4·5H2O 1,28 мг
ZnSO4·7H2O 0,9 мг
MgSO4·7H2O 219 мг
EDTA·2Na 44 мг
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 9: Продукция 2,3-бутандиола посредством непрерывного культивирования Paenibacillus polymyxa с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, осуществляли непрерывное культивирование без использования разделительной мембраны. Штамм ATCC12321 Paenibacillus polymyxa культивировали с перемешиванием в условиях, одинаковых с теми, которые описаны для предварительного культивирования в сравнительном примере 7 (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1,2 л содержащей смешанный сахар среды 2 для 2,3-бутандиолового брожения, представленной в таблице 16. Периодическое культивирование выполняли в реакционном сосуде для ферментации с перемешиванием со скорость 200 об./мин с помощью мешалки, присоединенной к сосуду, при контролировании температуры, до полного потребления сахара в культуральной жидкости (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали процесс откачивания для сбора ферментационной жидкости, и постоянно подавали среду для культивирования. При контролировании количества сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, так что количество ферментационной жидкости в устройстве для непрерывной ферментации составляло 1,2 л, выполняли непрерывное культивирование в течение 280 часов в следующих условиях для продукции 2,3-бутандиола (таблица 17).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде: 800 (об./мин)

Доведение рН: с доведением до рН 6,5 с использованием 5н NaOH.

Количество собираемой ферментационной жидкости: 0,6 (л/день)

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Пример 5: Продукция 2,3-бутандиола посредством непрерывного культивирования Paenibacillus polymyxa с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны.

С использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, осуществляли непрерывное культивирование с использованием разделительной мембраны. Используемый элемент с разделительной мембраной был в форме плоской мембраны. Штамм ATCC12321 Paenibacillus polymyxa культивировали с перемешиванием в условиях, одинаковых с теми, которые описаны для предварительного культивирования в сравнительном примере 7 (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1,2 л содержащей смешанный сахар среды 2 для 2,3-бутандиолового брожения. Периодическое культивирование выполняли в реакционном сосуде для ферментации с перемешиванием со скорость 200 об./мин с помощью мешалки, присоединенной к сосуду, при контролировании температуры, до полного потребления сахара в культуральной жидкости (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали процесс перекачивания для циркуляции ферментационной жидкости, и постоянно подавали среду для культивирования. При контролировании количества культуральной жидкости, подвергаемой фильтрации, так что количество ферментационной жидкости в устройстве для непрерывной ферментации составляло 1,2 л, выполняли непрерывное культивирование в течение 310 часов в следующих условиях для продукции 2,3-бутандиола (таблица 17).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: фильтрующая мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации элемента с разделительной мембраной: 120 (см3)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде для ферментации: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде для ферментации: 800 (об./мин)

Количество собираемой ферментационной жидкости: 0,6 (л/день)

Стерилизация: все используемые сосуды для культивирования, включающие элемент с разделительной мембраной, и среды для культивирования подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Используемой мембраной была мембрана со свойствами, одинаковыми с таковыми, описанными в примере 1, и допускали изменение перепада давлений между сторонами мембраны в пределах диапазона от 0,1 до 20 кПа.

Таблица 17
Сравнительный пример 7 Сравнительный пример 8 Сравнительный пример 9 Пример 5
Период времени ферментации (ч) 27 50 280 310
Общее количество поданной глюкозы (г) 60 20 155 170
Общее количество поданной ксилозы (г) 0 40 305 340
Общая продукция 2,3-бутандиола (г) 15 2 45 145
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 115 5
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 0 15 0,6
Выход (г/г) 0,25 0,03 0,13 0,29

Справочный пример 6: Расчет скорости потребления ксилозы Pichia stipitis.

Периодическую ферментацию выполняли в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в справочном примере 4, с использованием в качестве среды для культивирования содержащую ксилозу среду для этилового брожения, представленную в таблице 3, или содержащую смешанный сахар среду 1 для этилового брожения, представленную в таблице 4, для расчета скорости потребления ксилозы микроорганизмом для этилового брожения, штаммом NBRC1687 Pichia stipitis, при ферментации с продукцией этанола.

Скорости потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде для этилового брожения и содержащей смешанный сахар среде 1 для этилового брожения рассчитывали согласно уравнению 6 и уравнению 7, представленным выше, соответственно. Результаты расчета представлены в таблице 22. Исходя из этих результатов, вынесли решение, что штамм NBRC1687 Pichia stipitis является микроорганизмом, который подвергается подавлению катаболитами.

Справочный пример 7: Расчет скорости потребления ксилозы Candida utilis

В качестве микроорганизма использовали штамм CuLpDH Candida utilis, который был приготовлен с использованием способа, описанного в WO2010/140602. В качестве среды для культивирования использовали содержащую ксилозу среду для ферментации с продукцией D-молочной кислоты, имеющую состав, представленный в таблице 18, или содержащую смешанный сахар среду для ферментации с продукцией D-молочной кислоты, представленную в таблице 19. Периодическое культивирование выполняли в течение 40 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 1, за исключением того, что рН доводили до 6,0 с использованием 1н гидроксида кальция, и рассчитывали скорость потребления ксилозы при ферментации с продукцией D-молочной кислоты.

Скорости потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде для ферментации с продукцией D-молочной кислоты и содержащей смешанный сахар среде для ферментации с продукцией D-молочной кислоты рассчитывали согласно уравнению 6 и уравнению 7, представленным выше, соответственно. Результаты расчета представлены в таблице 22. Исходя из этих результатов, вынесли решение, что штамм CuLpDH Candida utilis является микроорганизмом, который подвергается подавлению катаболитами.

Таблица 18
Содержащая ксилозу среда для ферментации с продукцией D-молочной кислоты
Глюкоза 100 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Бактопептон 20 г
Единица (1/литр)
Таблица 19
Содержащая смешанный сахар среда 1 для ферментации с продукцией D-молочной кислоты
Глюкоза 50 г
Ксилоза 50 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Бактопептон 20 г
Единица (1/литр)

Справочный пример 8: Расчет скорости потребления ксилозы штаммом KO11 Escherichia coli

Рассчитывали скорость потребления ксилозы при ферментации с продукцией этанола микроорганизмом для этилового брожения, штаммом KO11 Escherichia coli. В качестве среды для культивирования использовали содержащую ксилозу среду 2 для этилового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 20, или содержащую смешанный сахар среду 3 для этилового брожения, представленную в таблице 21. Отбор образцов выполняли соответствующим образом, и концентрации глюкозы и ксилозы в культуральной жидкости и концентрацию этанола в качестве продукта определяли с помощью способа справочного примера 1.

Таблица 20
Содержащая ксилозу среда 2 для этилового брожения
Ксилоза 60 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Триптон 5 г
NaCl 5 г
Единица (1/литр)
Таблица 21
Содержащая смешанный сахар среда 3 для этилового брожения
Глюкоза 30 г
Ксилоза 30 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Триптон 5 г
NaCl 5 г
Единица (1/литр)

Штамм KO11 Escherichia coli культивировали в 2 мл среды для предварительного культивирования (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) в пробирке при 30°С в течение ночи (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл среды для предварительного культивирования, помещенной в 500-мл разделенную перегородками колбу Эрленмейера, (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1,5 л содержащей ксилозу среды 2 для этилового брожения или содержащей смешанный сахар среды 3 для этилового брожения, и периодическое культивирование выполняли в течение 16 часов в следующих рабочих условиях при контролировании температуры и рН.

Объем сосуда для культивирования: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Аэрация в реакционном сосуде для ферментации: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде для ферментации: 800 (об./мин)

Доведение рН: с доведением до рН 6 с использованием 5н Ca(OH)2

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для ферментации подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Скорости потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде 2 для этилового брожения и содержащей смешанный сахар среде 3 для этилового брожения рассчитывали согласно уравнению 6 и уравнению 7, представленным выше, соответственно. Результаты расчетов представлены в таблице 22. Исходя из этих результатов, вынесли решение, что штамм KO11 Escherichia coli является микроорганизмом, который подвергается подавлению катаболитами.

Таблица 22
Сравнительный пример 6 Сравнительный пример 7 Сравнительный пример 8
Скорость потребления ксилозы в содержащей ксилозу среде (г/л/ч) 2,22 1,59 1,46
Скорость потребления ксилозы в содержащей смешанный сахар среде (г/л/ч) 0,25 0,09 0,16

Сравнительный пример 10: Продукция этанола посредством периодического культивирования Pichia stipites с использованием гексозы в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием штамма NBRC1687 Pichia stipitis в качестве микроорганизма, выполняли периодическое культивирование в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 4, в течение 23 часов для продукции этанола (таблица 23).

Сравнительный пример 11: Продукция этанола посредством периодического культивирования Pichia stipites с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием штамма NBRC1687 Pichia stipitis в качестве микроорганизма, выполняли периодическое культивирование в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 5, в течение 40 часов для продукции этанола (таблица 23).

Сравнительный пример 12: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Pichia stipites с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием штамма NBRC1687 Pichia stipitis в качестве микроорганизма, выполняли непрерывную ферментацию с использованием исходного материала в виде смешанного сахара, без использования разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляли в течение 298 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 6, за исключением того, что период времени предварительного культивирования составлял 40 часов, для продукции этанола (таблица 23).

Пример 6: Продукция этанола посредством непрерывной ферментации с использованием Pichia stipites с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны 1.

С использованием штамма NBRC1687 Pichia stipitis в качестве микроорганизма, выполняли непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляли в течение 305 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в примере 4, за исключением того, что период времени предварительного культивирования составлял 48 часов, а перепад давлений между сторонами мембраны составлял от 0,1 до 19,8 кПа, для продукции этанола (таблица 23).

Таблица 23
Сравнительный пример 10 Сравнительный пример 11 Сравнительный пример 12 Пример 4
Период времени ферментации (ч) 23 40 298 305
Общее количество поданной глюкозы (г) 105 48 596 610
Общее количество поданной ксилозы (г) 0 63 782 801
Общая продукция этанола (г) 50 32 390 548
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 160 40
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 0 13 3
Выход (г/г) 0,48 0,29 0,32 0,4

Сравнительный пример 13: Продукция D-молочной кислоты посредством периодического культивирования Candida utilis с использованием гексозы в качестве исходного материала для ферментации.

В качестве микроорганизма использовали штамм CuLpDH Candida utilis, который был приготовлен с помощью способа, описанного в WO2010/140602. Периодическое культивирование выполняли в течение 23 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 4, за исключением того, что рН доводили до 6,0 с использованием 1н гидроксида кальция, и использовали содержащую смешанный сахар среду 2 для ферментации с продукцией D-молочной кислоты, для продукции D-молочной кислоты (таблица 25).

Таблица 24
Содержащая смешанный сахар среда 2 для ферментации с продукцией D-молочной кислоты
Глюкоза 20 г
Ксилоза 50 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Бактопептон 20 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 14: Продукция D-молочной кислоты посредством периодического культивирования Candida utilis с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

Периодическое культивирование выполняли в течение 40 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 5, за исключением того, что в качестве микроорганизма использовали штамм CuLpDH Candida utilis, рН доводили до 6,0 с использованием 1н гидроксида кальция, и в качестве среды для культивирования использовали содержащую смешанный сахар среду 2 для ферментации с продукцией D-молочной кислоты, представленную в таблице 24, для продукции D-молочной кислоты (таблица 25).

Сравнительный пример 15: Продукция D-молочной кислоты посредством непрерывной ферментации с использованием Candida utilis, c использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

Непрерывную ферментацию осуществляли с использованием штамма CuLpDH Candida utilis в качестве микроорганизма, без использования разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляли в течение 290 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 6, за исключением того, что период времени предварительного культивирования составлял 40 часов, рН доводили до 6,0 с использованием 1н гидроксида кальция, и в качестве среды для культивирования использовали содержащую смешанный сахар среду 2 для ферментации с продукцией D-молочной кислоты, представленную в таблице 24, для продукции D-молочной кислоты (таблица 25).

Пример 7: Продукция D-молочной кислоты посредством непрерывной ферментации с использованием Candida utilis, с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны 1.

Непрерывную ферментацию осуществляли с использованием штамма CuLpDH Candida utilis в качестве микроорганизма, с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляли в течение 310 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в примере 4, за исключением того, что период времени предварительного культивирования составлял 50 часов, рН доводили до 6,0 с использованием 1н гидроксида кальция, и в качестве среды для культивирования использовали содержащую смешанный сахар среду 2 для ферментации с продукцией D-молочной кислоты, представленную в таблице 24, для продукции D-молочной кислоты.

Таблица 25
Сравнительный пример 13 Сравнительный пример 14 Сравнительный пример 15 Пример 7
Период времени ферментации (ч) 23 40 290 310
Общее количество поданной глюкозы (г) 108 49 592 633
Общее количество поданной ксилозы (г) 0 65 785 840
Общая продукция D-молочной кислоты (г) 31 24 295 421
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 0 95 20
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 0 8 2
Выход (г/г) 0,29 0,21 0,23 0,29

Сравнительный пример 16: Продукция этанола посредством периодической ферментации с использованием Escherichia coli с использованием гексозы в качестве исходного материала для ферментации.

Штамм KO11 Escherichia coli культивировали в 2 мл среды для предварительного культивирования (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) в пробирке при 30°С в течение ночи (предварительная культура). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл среды для предварительного культивирования, помещенной в 500-мл разделенную перегородками колбу Эрленмейера, и выполняли культивирование в течение ночи (предварительная культура). Предварительную культуральную жидкость засевали в 1 л среды 2 для этилового брожения, имеющей состав, представленный в таблице 26, и периодическую ферментацию выполняли в течение 16 часов в следующих рабочих условиях при контролировании температуры и рН, для продукции этанола (таблица 28).

Объем сосуда для культивирования: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Kla (коэффициент массопередачи по кислороду): 30 (ч-1)

Доведение рН: с доведением до рН 6 с использованием 5н Ca(OH)2

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для ферментации подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Таблица 26
Среда 2 для этилового брожения
Глюкоза 40 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Триптон 5 г
NaCl 5 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 17: Продукция этанола посредством периодической ферментации с использованием Escherichia coli, с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 4 для этилового брожения, имеющей состав, представленный в таблице 27, в качестве среды для ферментации, выполняли периодическую ферментацию в течение 24 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 16, для продукции этанола (таблица 28).

Таблица 27
Содержащая смешанный сахар среда 4 для этилового брожения
Глюкоза 30 г
Ксилоза 40 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Триптон 5 г
NaCl 5 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 18: Продукция этанола посредством непрерывной ферментации с помощью Escherichia coli, с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

Непрерывную ферментацию осуществляли, с использованием смешанного сахар в качестве исходного материала для ферментации, без использования разделительной мембраны. Штамм KO11 Escherichia coli культивировали в 2 мл среды для предварительного культивирования (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) в пробирке при 30°С в течение ночи (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл среды для предварительного культивирования в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера, и выполняли культивирование в течение ночи (предварительная культура). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в содержащую смешанный сахар среду 4 для этилового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 27, помещенную в устройство для непрерывного культивирования (устройство, одинаковое с устройством, представленным на фиг.2 WO2007/097260, за исключением того, что элемент с разделительной мембраной был исключен), и периодическую ферментацию выполняли в течение 24 часов в рабочих условиях, изложенных ниже, при контролировании температуры и рН (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали непрерывное культивирование для продукции этанола. Для подачи содержащей смешанный сахар среды 4 для этилового брожения, имеющей состав, представленный в таблице 27, и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, использовали насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO) для подачи среды для культивирования непосредственно в сосуд для культивирования и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, непосредственно из сосуда для культивирования. При контролировании скорости подачи среды для культивирования, так что количество культуральной жидкости в сосуде для культивирования составляло 1,5 л при постоянной скорости сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, осуществляли продукцию этанола в течение 290 часов (таблица 28).

Объем сосуда для культивирования: 2 (л)

Установка температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч-1)

Доведение рН: с доведением до рН 6 с использованием 5н Ca(OH)2

Скорость сбора ферментационной жидкости: 2 (л/день)

Стерилизация: все используемые сосуды и среды для ферментации подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Пример 8: Продукция этанола посредством непрерывной ферментации с использованием Escherichia coli, с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны.

С использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации, осуществляли непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Штамм KO11 Escherichia coli культивировали в 2 мл среды для предварительного культивирования (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) в пробирке при 30°С в течение ночи (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл среды для предварительного культивирования в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера, и выполняли культивирование в течение ночи (предварительная культура). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в содержащую смешанный сахар среду 4 для этилового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 27, помещенную в устройство для непрерывной ферментации, оснащенное интегрированной мембраной со свойствами, изложенными ниже, (устройство, представленное на фиг.2 WO2007/097260), и периодическую ферментацию выполняли в течение 24 часов в рабочих условиях, изложенных ниже, при контролировании температуры и рН (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали непрерывное культивирование для продукции этанола. Для подачи содержащей смешанный сахар среды 4 для этилового брожения, имеющей состав, представленный в таблице 27, и фильтрации культуральной жидкости использовали насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO). Среду для культивирования подавали непосредственно в сосуд для культивирования, а культуральную жидкость фильтровали через элемент, имеющий иммобилизованную разделительную мембрану. При контролировании скорости подачи среды для культивирования, так что количество культуральной жидкости в сосуде для культивирования составляло 1,5 л при постоянной скорости фильтрации культуральной жидкости, и допуске изменения перепада давлений между сторонами мембраны в пределах диапазона от 0,1 до 19,8 кПа, осуществляли непрерывную ферментацию в течение 310 часов для продукции этанола (таблица 28).

Объем реакционного сосуда для ферментации: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: фильтрующая мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации элемента с разделительной мембраной: 473 (см3)

Коэффициент проницаемости разделительной мембраны для чистой воды: 50×10-9 м32/сек/Па.

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 мкм

Среднеквадратическое отклонение среднего размера пор: ±0,035 мкм

Шероховатость поверхности разделительной мембраны: 0,06 мкм

Установка температуры: 30 (°С)

Доведение рН: с доведением до рН 6 с использованием 5н Ca(OH)2

Скорость сбора ферментационной жидкости: 2 (л/день)

Стерилизация: используемый сосуд для ферментации, включающий элемент с разделительной мембраной, и все используемые среды подвергали стерилизации паром под высоким давлением при автоклавировании при 121°С в течение 20 мин.

Таблица 28
Сравнительный пример 16 Сравнительный пример 17 Сравнительный пример 18 Пример 8
Период времени ферментации (ч) 16 24 290 310
Общее количество поданной глюкозы (г) 42 31 749 801
Общее количество поданной ксилозы (г) 0 40 967 1033
Общая продукция этанола (г) 15 16 246 691
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 0 17 1
Выход (г/г) 0,35 0,22 0,19 0,38

Сравнительный пример 19: Продукция L-молочной кислоты посредством периодического культивирования Bacillus coagulans с использованием полученного из биомассы сахарного сиропа (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

В качестве исходного материала для ферментации использовали полученный из биомассы сахарный сироп. Для приготовления содержащей сахарный сироп среды для молочнокислого брожения использовали полученную в результате осахаривания целлюлозы жидкость, приготовленную с использованием мембраны для нанофильтрации, с помощью способа приготовления, описанного в примере 2 WO2010/067785. Среду готовили, как представлено в таблице 29, используя реагенты соответствующим образом. Периодическое культивирование выполняли в течение 70 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 2, за исключением того, что использовали отличную среду для культивирования, и 4н KOH использовали в качестве нейтрализатора, для продукции L-молочной кислоты (таблица 30).

Таблица 29
Содержащая сахарный сироп среда для молочнокислого брожения
Глюкоза 60 г
Ксилоза 20 г
Дрожжевой экстракт 5 г
Сульфат аммония 1 г
K2HPO4 0,4 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 20: Продукция L-молочной кислоты посредством непрерывного культивирования Bacillus coagulans с использованием полученного из биомассы сахарного сиропа (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

В качестве исходного материала для ферментации использовали полученный из биомассы сахарный сироп. В качестве содержащей сахарный сироп среды для молочнокислого брожения использовали среду для культивирования, описанную в таблице 29, аналогично сравнительному примеру 19. Непрерывное культивирование выполняли в течение 250 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 3, за исключением того, что использовали отличную среду для культивирования, и 4н KOH использовали в качестве нейтрализатора, для продукции молочной кислоты (таблица 30).

Пример 9: Продукция L-молочной кислоты посредством непрерывного культивирования Bacillus coagulans с использованием полученного из биомассы сахарного сиропа (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны.

В качестве исходного материала для ферментации использовали полученный из биомассы сахарный сироп. В качестве содержащей сахарный сироп среды для молочнокислого брожения использовали среду для культивирования, описанную в таблице 29, аналогично сравнительному примеру 19. Непрерывное культивирование выполняли с использованием разделительной мембраны, в течение 260 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в примере 1, за исключением того, что использовали отличную среду для культивирования, и 4н KOH использовали в качестве нейтрализатора, для продукции L-молочной кислоты (таблица 30).

Таблица 30
Сравнительный пример 19 Сравнительный пример 20 Пример 9
Период времени ферментации (ч) 70 250 260
Общее количество поданной глюкозы (г) 60 1875 1950
Общее количество поданной ксилозы (г) 20 625 650
Общая продукция L-молочной кислоты 52 1254 2176
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 410 40
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 13 1
Выход (г/г) 0,65 0,60 0,85

Сравнительный пример 21: Продукция этанола посредством периодического культивирования Escherichia coli с использованием полученного из биомассы сахарного сиропа (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

В качестве исходного материала для ферментации использовали полученный из биомассы сахарный сироп. Для приготовления содержащей сахарный сироп среды для этилового брожения использовали полученную в результате осахаривания целлюлозы жидкость, приготовленную с использованием мембраны для нанофильтрации, с помощью способа приготовления, описанного в примере 2 WO2010/067785. Среду готовили, как представлено в таблице 31, с использованием реагентов соответствующим образом. Периодическое культивирование выполняли в течение 23 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 17, за исключением того, что использовали отличную среду для культивирования, для продукции этанола (таблица 32).

Таблица 31
Содержащая сахарный сироп среда для этилового брожения
Глюкоза 30 г
Ксилоза 15 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Триптон 5 г
NaCl 5 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 22: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Escherichia coli с использованием полученного из биомассы сахарного сиропа (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием среды для культивирования, описанной в таблице 31, в качестве содержащей сахарный сироп среды для этилового брожения, аналогично сравнительному примеру 21, выполняли непрерывное культивирование в течение 285 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 18, для продукции этанола (таблица 32).

Пример 10: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Escherichia coli с использованием полученного из биомассы сахарного сиропа (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны.

С использованием содержащей сахарный сироп среды для этилового брожения, описанной в таблице 27, выполняли непрерывное культивирование в течение 295 часов с использованием разделительной мембраны в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в примере 8, для продукции этанола.

Таблица 32
Сравнительный пример 21 Сравнительный пример 22 Пример 10
Период времени ферментации (ч) 23 285 295
Общее количество поданной глюкозы (г) 30 713 738
Общее количество поданной ксилозы (г) 15 356 369
Общая продукция этанола 12 193 431
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 230 30
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 10 1
Выход (г/г) 0,27 0,23 0,4

Сравнительный пример 23: Продукция этанола посредством периодического культивирования Candida tropicalis с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала 2 для ферментации.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 5 для этилового брожения, представленной в таблице 33, выполняли периодическое культивирование в течение 45 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 4, для продукции этанола (таблица 34).

Таблица 33
Содержащая смешанный сахар среда 5 для этилового брожения
Глюкоза 10 г
Ксилоза 90 г
Дрожжевой экстракт 10 г
Триптон 20 г
Единица (1/литр)

Сравнительный пример 24: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Candida tropicalis с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 5 для этилового брожения, представленной в таблице 33, выполняли непрерывное культивирование в течение 350 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в сравнительном примере 6, для продукции этанола (таблица 34).

Пример 11: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Candida tropicalis с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием разделительной мембраны 2.

С использованием содержащей смешанный сахар среды 5 для этилового брожения, представленной в таблице 33, выполняли непрерывное культивирование в течение 360 часов в условиях, одинаковых с теми, которые описаны в примере 4, для продукции этанола.

Пример 12: Продукция этанола посредством непрерывного культивирования Candida tropicalis с использованием смешанного сахара в качестве исходного материала для ферментации, с использованием керамической разделительной мембраны 3.

С использованием штамма NBRC0199 Candida tropicalis осуществляли непрерывную ферментацию с использованием керамической разделительной мембраны. В качестве среды для ферментации использовали среду для культивирования, представленную в таблице 33. Штамм NBRC0199 Candida tropicalis культивировали в 2 мл среды YPD в пробирке при 30°С в течение ночи с перемешиванием (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл среды YPD в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера, и культивирование осуществляли в течение ночи с перемешиванием (культура до предварительной культуры). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в 1,5 л среды YPDX, помещенной в устройство для непрерывной ферментации разделительного с помощью мембраны типа (устройство, представленное на фиг.12 WO2012/086763), и культивирование выполняли в течение 36 часов с перемешиванием со скорость 800 об./мин с помощью мешалки, присоединенной к сосуду для культивирования, при контролировании скорости аэрации и температуры в сосуде для культивирования (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали непрерывное культивирование. При контролировании перепада давлений между сторонами мембраны во время фильтрации на уровне, не превышающем 500 кПа, выполняли непрерывное культивирование в течение 400 часов для продукции этанола (таблица 34).

Объем сосуда для культивирования: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: мембрана для микрофильтрации из целфита Monolith φ4-19 (NGK Insulators, Ltd.)

Длина элемента с разделительной мембраной: 500 мм

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 мкм

Установка температуры: 30°С

Аэрация в реакционном сосуде для ферментации: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде для ферментации: 800 (об./мин)

Доведение рН: нет

Таблица 34
Сравнительный пример 23 Сравнительный пример 24 Пример 11 Пример 12
Период времени ферментации (ч) 45 350 360 400
Общее количество поданной глюкозы (г) 16 146 150 100
Общее количество поданной ксилозы (г) 136 1313 1350 900
Общая продукция этанола (г) 8 67 175 125
Неиспользованная глюкоза (г) 0 0 0 0
Неиспользованная ксилоза (г) 0 125 45 40
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0 0 3 4,0
Выход (г/г) 0,05 0,05 0,12 0,13

Пример 13: Продукция 2,3-бутандиола посредством непрерывного культивирования Paenibacillus polymyxa с использованием смешанного сахара (глюкозы, ксилозы) в качестве исходного материала для ферментации, с использованием керамической разделительной мембраны 2.

С использованием штамма ATCC12321 Paenibacillus polymyxa осуществляли непрерывную ферментацию с использованием керамической разделительной мембраны. Штамм ATCC12321 Paenibacillus polymyxa культивировали в 2 мл среды для предварительного культивирования (5 г/л глюкозы; 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) в пробирке при 30°С в течение ночи (культура до предварительной культуры). Полученную культуральную жидкость засевали в 50 мл среды для предварительного культивирования в 500-мл разделенной перегородками колбе Эрленмейера, и культивирование осуществляли в течение ночи (культура до предварительной культуры). Суспензионную культуру до предварительной культуры засевали в содержащую смешанный сахар среду для 2,3-бутандиолового брожения, имеющую состав, представленный в таблице 16, помещенную в устройство для непрерывного культивирования (устройство, представленное на фиг.2 WO2007/097260), и периодическую ферментацию осуществляли в течение 30 часов в рабочих условиях, изложенных ниже, при контролировании температуры и рН (предварительная культура). Сразу же после завершения предварительного культивирования начинали непрерывное культивирование с использованием содержащей смешанный сахар среды для 2,3-бутандиолового брожения, имеющей состав, представленный в таблице 16, для продукции для 2,3-бутандиола. При контролировании перепада давлений между сторонами мембраны во время фильтрации на уровне, не превышающем 500 кПа, выполняли непрерывное культивирование в течение 300 часов для продукции 2,3-бутандиола (таблица 35).

Объем ферментера 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: мембрана для микрофильтрации из целфита Monolith φ4-19 (NGK Insulators, Ltd.)

Длина элемента с разделительной мембраной: 500 мм

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 мкм

Установка температуры: 30(°С)

Аэрация в реакционном сосуде для ферментации: 100 (мл/мин)

Скорость перемешивания в реакционном сосуде для ферментации: 800 (об./мин)

Доведение рН: с доведением до рН 6,5 с использованием 5н Ca(OH)2

Таблица 35
Пример 13
Период времени ферментации (ч) 310
Общее количество поданной глюкозы (г) 129
Общее количество поданной ксилозы (г) 258
Общая продукция 2,3-бутандиола (г) 111
Неиспользованная глюкоза (г) 0
Неиспользованная ксилоза (г) 5
Неиспользованная ксилоза/общее количество фильтрата (г/л) 0,8
Выход (г/г) 0,29

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

С помощью настоящего изобретения можно значительно увеличить эффективности ферментативной продукции различных химических продуктов с использованием исходного материала для ферментации, содержащего пентозу и гексозу.

1. Способ получения химического продукта посредством непрерывной ферментации (культивирования), включающий фильтрование суспензионной культуры микроорганизма(ов) (культуральной жидкости) через разделительную мембрану; сохранение не подвергнутой фильтрованию жидкости или возвращение не подвергнутой фильтрованию жидкости в культуральной(ую) жидкости(ь); добавление в культуральную жидкость исходного материала для ферментации и выделение химического продукта, продуцированного микроорганизмом(ами) в фильтрате, причем указанный микроорганизм(ы) является микроорганизмом(ами), который подвергается подавлению катаболитами, а указанный исходный материал для ферментации включает гексозу и пентозу.

2. Способ получения химического продукта по п. 1, в котором концентрация указанной пентозы в общем количестве указанного фильтрата составляет не более чем 5 г/л.

3. Способ получения химического продукта по п. 1 или 2, в котором весовое соотношение между гексозой и пентозой, содержащимися в указанном исходном материале для ферментации, составляет от 1:9 до 9:1.

4. Способ получения химического продукта по п. 1 или 2, в котором указанный исходный материал для ферментации включает сахарный сироп, получаемый из содержащей целлюлозу биомассы.

5. Способ получения химического продукта по п. 1 или 2, в котором указанной пентозой является ксилоза.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом (микроорганизмами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ превращения лигноцеллюлозы в органическую кислоту.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения молочной кислоты, получения лактида и получения полимолочной кислоты.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен полипептид D-лактатдегидрогеназы, который содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее 80% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, раскрытые в описании, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041, являющийся продуцентом молочной кислоты.

Изобретение относится к биотехнологии пищевых продуктов и может быть использовано при переработке растворов брожения с получением молочной кислоты. Способ извлечения молочной кислоты из растворов брожения включает экстракцию молочной кислоты солью четвертичного аммониевого основания в разбавителе и реэкстракцию кислоты, причем экстракцию ведут солью четвертичного аммониевого основания в сульфатной форме [(R4N)2SO4], где R представляет собой алкильный или арильный радикал, в присутствии п-третичных алкилфенолов при молярном соотношении (R4N)2SO4 : п-третичные алкилфенолы, равном соответственно 1:2, при значении рН раствора 5,0-7,0, реэкстракцию кислоты проводят растворами гидроксида натрия, а регенерацию экстрагента осуществляют его обработкой стехиометрическим количеством серной кислоты.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения высококонцентрированных очищенных лактатсодержащих растворов, в частности высококонцентрированных очищенных растворов молочной кислоты и ее солей, на основе культуральной жидкости, полученной в результате культивирования клеток микроорганизмов.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности для получения L(+)-лактата посредством микробиологического синтеза. .

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом (микроорганизмами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способ получения С2-С6спиртов из метансодержащего сырья, оборудование для получения С2-С6спиртов и способ получения топлива для моторизованного транспорта.

Настоящее изобретение относится к способу получения бутанола, который имеет важное промышленное значение как исходное сырье для получения химических и фармацевтических продуктов, а также в качестве растворителя и топлива.
Изобретение относится к гидролизной промышленности, в частности к способам очистки гидролизатов лигноцеллюлозного сырья от ингибиторов ацетонобутилового брожения, и может быть использовано при подготовке питательных сред для получения биоэтанола, биобутанола, ацетона.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения спиртов и/или ацетона из целлюлозного или лигноцеллюлозного субстрата.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол, из возобновляемого растительного целлюлозосодержащего сырья включает измельчение до размера частиц 20-80 мкм.
Способ предусматривает получение н-бутилового спирта путем анаэробного сбраживания ацетонобутиловыми бактериями сусла, полученного из измельченных клубней топинамбура.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа биологического получения н-бутанола и микроорганизма Clostridia acetobutylicum, используемого в таком способе.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма - продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленно ценных органических соединений.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма-продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленноценных органических соединений.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена композиция для получения продукта, выбранного из группы, состоящей из спиртов, органических кислот, сахаров, углеводородов и их смесей.
Наверх