Способ выявления нервных структур в тканях
Владельцы патента RU 2595849:
Гоман Максим Викторович (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ставропольский государственный медицинский университет" Министерства Здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СтГМУ Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выявления нервных структур в тканях. Сущность изобретения состоит в том, что исследуемый материал первоначально перфузируют через сосуды 5% раствором глюкозы с помещением на 10-15 мин в 1-2% раствор диметилсульфоксида на дистиллированной воде с дальнейшей промывкой сосудистого русла 5% раствором глюкозы, введением в сосуды 2% раствора Co(NO3)2 на 15-20 мин и промывкой 1-2 мин 5% раствором глюкозы, далее помещением для пропитывания в смесь из 10% Na2S и 70% этилового спирта на 1-8 ч, в зависимости от структуры и массы материала, с последующей промывкой в дистиллированной воде до исчезновения запаха сероводорода, фиксацией 3-е суток в 10% нейтральном формалине и доокрашиванием полученных гистологических срезов в 0,15% галлоцианине, причем исследуемые на микропрепарате нервные волокна, особенно безмякотные, - интенсивно черные на светлом фоне, а ядра клеток и их цитоплазма - слегка синие. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность выявления нервных структур в тканях.1 пр.
Изобретение относится к области медицины, в частности стоматологии, и может быть использовано для выявления нервных структур в зубочелюстной системе на нейрохимическом уровне.
В распоряжении нейроморфологов имеется широкий выбор методик для выявления нервных структур в тканях. Использование рекомендуемых прописей и условий на практике часто не позволяет получить желаемого результата.
Наиболее часто в нейрогистологической практике применяется методика Е.И. Рассказовой [Рассказова Е.И. Методы импрегнации нейроплазмы разных периферических нервных волокон и окончаний / Е.И. Рассказова // Вопросы психиатрии. В кн. Научные работы института психиатрии. М., Медицина, - 1956. - С. 349-353].
Сущность проведения нейрогистологической реакции по Расказовой Е.И. заключается в следующем:
A) объект исследования фиксируют на 7-10 суток в 12% растворе нейтрального формалина;
Б) режут на замораживающем микротоме;
B) промывают в проточной воде 2 ч;
Г) промывают срезы в дистиллированной воде 2 ч;
Д) помещают срезы на 30 мин в 60° спирт, после чего промывают в двух порциях дистиллированной воды;
Е) помещают срезы на 1 ч в 20% раствор AgNO3 в термостате при t=37°. Затем промывают в течение 3-5 мин в дистиллированной воде;
Ж) проводят срезы в 1% растворе кислого формалина, приготовленного на водопроводной воде, затем просушивают срезы на фильтровальной бумаге;
З) помещают срезы на 2-3 мин в аммиачное серебро с последующей проводкой в 0,5% кислого формалина на водопроводной воде при комнатной температуре;
И) помещают срезы в аммиачную воду (1:1) на 3-5 мин;
К) проводят через спирты, заключают в бальзам классическим способом.
Способом Е.И. Рассказовой нервные элементы выявляются не всегда и это частично объясняется биохимической индивидуальностью органов и тканей в различные периоды онтогенетического развития.
По выявлению нервных структур в тканевых образованиях различных органов является способ Ю.Н. Майбороды [Способ выявления нервных волокон и сосудов микроциркуляторного русла / Майборода Ю.Н. авт. свид. №1171690 от 08.04.1985].
Способ осуществляется следующим образом:
A) кусочки органа размером 1,0-1,5 см3 фиксируют в течение 14 дней в 12% растворе нейтрального формалина (Ph=7,2-7,4), который сменяют 2-3 раза за весь период фиксации;
Б) после фиксации материал промывают сначала в проточной, а затем в дистиллированной воде - 2-3 ч соответственно;
B) приготавливают на замораживающем микротоме гистологические срезы в количестве 8-10, помещают на 10-15 мин в 1-5% раствор диметилсульфоксида на дистиллированной воде;
Г) из среды диметилсульфоксида, предварительно осушенные фильтровальной бумагой, переносят на 15-30 мин в 5% раствор AgNO3;
Д) срезы проводят через ряд ванночек с 0,5-1% раствором кислого формалина (Ph=6,0-6,3) на смеси отстоявшейся водопроводной и кипяченой воды в соотношении 1:2;
Е) переносят срезы на 1-2 мин в раствор аммиачного серебра, в котором аммиака должно быть на 1-2 капли больше с целью подавления окрашивания элементов стромы;
Ж) из аммиачного серебра срезы помещают в 0,25-0,5% раствора нейтрального формалина на водопроводной воде комнатной температуры до приобретения ими соломенного оттенка;
З) фиксацию окрашенных срезов осуществляют в аммиачной воде из расчета 1 часть 25% аммиачного спирта и 4 части дистиллированной воды в течение 1 ч. Затем срезы промывают в дистиллированной воде 12 ч со сменой воды 2-3 раза;
И) обезвоживание в спиртах, карбоксилоле, ксилоле, заключение в бальзам производится общеизвестным способом.
Этот способ весьма трудоемкий, не дает полной информации о топографии нервного аппарата - нервных окончаний и, особенно, нейронов ганглиев парасимпатического отдела вегетативной нервной системы, их связей и требует проведения дополнительной окраски стромы. Кроме того, применяя методики импрегнации на основе AgNO3, невозможно судить о биохимических процессах в изучаемых объектах.
Наиболее близким из способов выявления нервных элементов является метод с азотнокислым кобальтом по Де Фано [Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. М. 1962; Лойд З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М., «Мир», - 1982].
Суть метода заключается в следующем:
а) кусочки толщиной 3-4 мм фиксируют в смеси следующего состава: Со(NO3)2 - 1 г, дистиллированной воды 100 см3, кислого формалина 15 см3. Продолжительность фиксации 6-8 ч для молодых и 12-24 ч для взрослых тканей. Комнатная температура;
б) фиксированный материал быстро ополаскивают и помещают в 1,5% раствор азотнокислого серебра (AgNO3), в темноте, при комнатной температуре на 24-48 ч, в зависимости от величины кусочков;
в) далее, после быстрого ополаскивания в дистиллированной воде кусочки материала переносят на 8-24 ч для восстановления в смесь: гидрохинона 1-2 г, нейтрального формалина 15 см3, воды 100 см3, сульфида натрия (безводный!) 0,1-0,5 г (количество сульфида натрия достаточное, чтобы в ванне сразу появилась желтоватая окраска). Раствор готовят перед самым употреблением;
г) далее исследуемый материал быстро ополаскивают водой, заливают в парафин или целлоидин.
Однако проведение метода Де Фано является малоинформативным, так как неспецифичность окраски нервных структур и окружающих их соединительно-тканных и клеточных образований, приводит к наслаиванию ионов Ag+ на основные компоненты ткани.
Задачей изобретения является повышение эффективности выявления нервных элементов, информативности биохимических процессов и экономичности.
Поставленная задача достигается первоначальной перфузией исследуемого материала в 5% растворе глюкозы, выдержкой в растворе диметилсульфоксида на дистиллированной воде, промывкой в 5% растворе глюкозы сосудистого русла и заполнение его раствором 2% Со(NO3)2, последующей промывкой 5% раствором глюкозы и дальнейшим погружением исследуемого материала в смесь 10% Na2S с 70% этиловым спиртом от 1 до 8 ч, промывкой до исчезновения запаха сероводорода, фиксацией трое суток в 10% нейтральном формалине с последующим докрашиванием гистологических срезов в 0,15% галлоцианине до 24 ч.
Способ осуществляют следующим образом:
A) сначала перфузируют кусочки исследуемого материала через сосуды 5% раствором глюкозы, чтобы смыть кровь;
Б) на 10-15 мин исследуемый материал помещают в 1-2% раствор диметилсульфоксида на дистиллированной воде с последующей промывкой сосудистого русла 5% раствором глюкозы шприцом;
B) далее шприцом вводят в сосуды 2% раствор Со(NO3)2 на 15-20 мин;
Г) промывают 5% раствором глюкозы в течение 1-2 мин;
Д) помещают объект исследования в смесь следующего состава: 10% Na2S и 70% этиловый спирт от 1 до 8 ч (время определяют эмперическим путем в зависимости от структуры и массы органа);
Е) промывают в дистиллированной воде до исчезновения запаха сероводорода;
Ж) фиксируют в 10% нейтральном формалине 3 суток;
З) приготавливают на замораживающем микротоме гистологические срезы и докрашивают в 0,15% галлоцианина. Время окрашивания варьирует от 16 до 24 ч;
И) проводят традиционную проводку через реактивы, заключение в бальзам по стандартной методике.
Результат: нервные волокна (особенно безмякотные) - интенсивно черные на светлом фоне. Ядра клеток и их цитоплазма слегка синие.
Количество выявляемых нервных структур на единицу площади среза составляет 11,1±0,09, по сравнению с методом Де Фано - 4,9±0,07 (p<0,05).
Использование предлагаемого технического решения позволяет более полно выявить интраорганные компоненты нервных структур в различных по своей морфохимической природе органах и тканях. Присутствие отрицательного заряда на биологических субстратах способствует удержанию возле них положительно заряженного иона Со++ в нейроплазме нервных волокон за счет электростатической связи между Со++ и диметилсульфоксидом. Благодаря диметилсульфоксиду концентрация Со++ в нервных проводниках становится более высокой, что способствует повышению чувствительности (катионизации) соединений кобальта в предлагаемом способе.
Способ более экономичен - не требует использования AgNO3, время проведения анализа сокращается на сутки.
Способ выявления нервных структур в тканях, включающий фиксацию в формалине, приготовление гистологических срезов, отличающийся тем, что исследуемый материал первоначально перфузируют через сосуды 5% раствором глюкозы с помещением на 10-15 мин в 1-2% раствор диметилсульфоксида на дистиллированной воде с дальнейшей промывкой сосудистого русла 5% раствором глюкозы, введением в сосуды 2% раствора Co(NO3)2 на 15-20 мин и промывкой 1-2 мин 5% раствором глюкозы, далее помещением для пропитывания в смесь из 10% Na2S и 70% этилового спирта на 1-8 ч, в зависимости от структуры и массы материала, с последующей промывкой в дистиллированной воде до исчезновения запаха сероводорода, фиксацией трое суток в 10% нейтральном формалине и доокрашиванием полученных гистологических срезов в 0,15% галлоцианине, причем исследуемые на микропрепарате нервные волокна, особенно безмякотные, - интенсивно черные на светлом фоне, а ядра клеток и их цитоплазма - слегка синие.
