Набор синтетических олигонуклеотидов для диагностики болезни крона и неспецифического язвенного колита путем выявления маркерных участков бактериальной днк методом полимеразной цепной реакции


 


Владельцы патента RU 2601132:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)" (МФТИ) (RU)

Изобретение относится к биохимии. Описан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления маркерных участков генов бактерий кишечника человека, ассоциированных с развитием воспалительных заболеваний кишечника (болезни Крона и неспецифического язвенного колита) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Данный набор включает специфичные олигонуклеотиды к фрагментам генов микроорганизма Escherichia coli, а именно праймеры:

1. 5′-TATGAGCAGTCGCTTACCCG-3′ и 5′-GTCGTCGGTATGTCCTGCTT-3′

2. 5′-CGTTAACCCGCTGTGGTAGT-3′ и 5′-CTACCGAGCCATCTTCCAGC-3′

3. 5′-GCGTTCAGAGCAAAACCCAG-3′ и 5′-TAAAAGACGGGAAGCAGCCA-3′

4. 5′-GGGCCGATATACAGGTGGTG-3′ и 5′-TCCTCAGGCATAAAGACGGC-3′

5. 5′-GTATCTCGTCTCCTGGCTGC-3′ и 5′-GCCAGCCATCCACCAGTAAT-3′

6. 5′-GTATAGATCCGTCAGGTGCAT-3′ и 5′-ACCTTCTGTTCCTGAAGCCC-3′

В качестве флуоресцентной метки используется интеркалирующий краситель SYBR GREEN I. Предлагаемое изобретение является достоверным способом обнаружения присутствия в микробиоте кишечника человека маркеров, ассоциированных с развитием болезни Крона и неспецифического язвенного колита.

 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине для диагностики воспалительных заболеваний кишечника.

Воспалительные заболевания кишечника представлены двумя основными формами - болезнь Крона и язвенный колит. Оба этих заболевания относятся к хроническим с аутоиммунным компонентом, манифестирующим в трудоспособном возрасте. Вследствие сложностей диагностики обеих форм на ранних стадиях пациенты с такой патологией попадают в поле зрения гастроэнтеролога обычно уже на поздних стадиях, имея явно выраженные симптомы и тяжелое протекание болезни вплоть до необходимости скорейшего оперативного вмешательства с невозможностью органосохраняющих операций. Диагностика на ранних стадиях обеспечивает высокую вероятность выхода в ремиссию и сохранение качества жизни наряду со снижением затрат на лечение как со стороны государства, так и со стороны граждан.

Согласно современным представлениям состав микробиоты кишечника человека при данных заболеваниях претерпевает существенные изменения. При этом состав микробиоты может измениться еще до наступления клинических признаков заболевания. Таким образом, определяя наличие определенных бактериальных маркеров в микробиоте кишечника, можно спрогнозировать начало развития патологии и ее течение. В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики воспалительных заболеваний кишечника, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида бактерий. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида микроорганизма. Благодаря высокой специфичности ПЦР происходит амплификация исключительно ДНК искомого микроорганизма - любая сопутствующая флора не может оказать влияние на эффективность диагностики.

Из уровня техники известны следующие аналоги данного изобретения.

В патенте РФ 2362808 (C1) [1] описан способ диагностики общего дисбаланса микробиоты при помощи ПЦР в реальном времени. На основе ПЦР подсчитывается общая численность бактерий, численность представителей непатогенных и условно-патогенных видов. Для того чтобы признать отсутствие дисбаланса микробиоты авторы предлагают использовать следующий критерий: численность непатогенных видов должна в 1000 раз превышать численность условно-патогенных видов. В случае, если представленность условно-патогенных микроорганизмов в 10 и более раз выше, чем представленность непатогенных видов, авторы предлагают диагностировать выраженную степень дисбаланса микробиоты. К недостаткам данного метода также можно отнести низкую чувствительность: он позволяет диагностировать стадии заболевания, когда микробитный состав уже значительно изменился, а именно значительно возросло число патогенных организмов.

В патенте РФ 2391667 (А) [2] описан способ ранней диагностики воспалительных заболеваний кишечника на основе детекции антител к дрожжам Saccharomyces cerevisiae и антител к бактерицидному белку, увеличивающему проницаемость клеток наряду с эндоскопическим, электрофизиологическим, морфологическим исследованием и исследованием слизистой оболочки толстой кишки. Авторы предлагают диагностировать раннюю стадию дивертикулярной болезни в случае, если наряду с морфологическими и электрофизиологическими показателям концентрация антител к бактерицидному белку, увеличивающему проницаемость клеток, находится в диапазоне от 4 до 18 ЕД/мл и антител к Saccharomyces cerevidiae от 7 до 22 ЕД/мл. К недостаткам подобного подхода, основанного на применении антител, относятся его высокая стоимость, трудоемкость и возможные погрешности при получении антител.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа заявляемого изобретения, является техническое решение по заявке на патент WO 2012080753 (A1) [3], в котором описан способ диагностики болезни Крона за счет селективной гибридизации олигонуклеотидов к последовательностям, встречающимся у представителей Proteobacteria и Flavobacteriaceae. Повышенное связывание праймеров, свидетельствующее о повышенной представленности бактерий из данных таксонов, является, по мнению авторов, индикатором заболевания. Предлагается брать образцы из желудочно-кишечного тракта людей. В патенте приведены последовательности четырех подобных праймеров. Недостатком описанного способа является его вероятная низкая специфичность и чувствительность вследствие наблюдения изменений на очень высоком таксономическом уровне (типов и семейств). Изменения состава микробиоты на таких высоких уровнях предполагает значительную выраженность заболевания. В сравнении с этим в заявляемом изобретении использовались праймеры на гены Е. coli, которые, как было показано, коррелируют с развитием заболевания, что позволит проводить диагностику на ранних этапах заболевания, когда изменения еще не затронули микробиотный состав в целом.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение присутствия бактериальных генов являющихся маркерами развития болезни Крона и неспецифического язвенного колита, а именно генов, кодирующих бета-лактамазу, фимбриальный белок, 3 гипотетических белка и ген LrgA. Данный результат достигается путем использования при постановке ПЦР-набора синтетических олигонуклеотидов для выявления маркерных участков ДНК микроорганизма Escherichia coli. Система детекции маркерных участков генов включает в себя праймеры:

1. 5′-TATGAGCAGTCGCTTACCCG-3′ и 5′-GTCGTCGGTATGTCCTGCTT-3′

2. 5′-CGTTAACCCGCTGTGGTAGT-3′ и 5′-CTACCGAGCCATCTTCCAGC-3′

3. 5′-GCGTTCAGAGCAAAACCCAG-3′ и 5′-TAAAAGACGGGAAGCAGCCA-3′

4. 5′-GGGCCGATATACAGGTGGTG-3′ и 5′-TCCTCAGGCATAAAGACGGC-3′

5. 5′-GTATCTCGTCTCCTGGCTGC-3′ и 5′-GCCAGCCATCCACCAGTAAT-3′

6. 5′-GTATAGATCCGTCAGGTGCAT-3′ и 5′-ACCTTCTGTTCCTGAAGCCC-3′ и интеркалирующий краситель SYBR GREEN I.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:

1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры с интеркалирующим красителем, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Nonidet Р40, 20 мМ MgCl2). В каждую пробирку при постановке реакции амплификации добавляется образец бактериальной ДНК, выделенной из образца кала человека. В случае наличия в ДНК специфических маркеров, комплементарных праймерам, происходит наработка ПЦР-продукта и возрастание уровня флуоресценции, что фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами. Интенсивность флуоресценции свидетельствует о количестве образующегося продукта.

2) Раствор фермента Taq-полимеразы.

3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированными фрагментами, последовательности которых комплементарны указанным праймерам, и позволяющие синтезировать продукт длинной 105-206 пар нуклеотидов при добавлении их в реакционную смесь

4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

Осуществление изобретения

1) Из биологического материала (кал человека) выделяется бактериальная ДНК с помощью набора реагентов, предназначенных для этих целей (набор реагентов для выделения ДНК из кала человека не является предметом данного патента).

2) На 1 определение генетических маркеров заболевания для 1 образца используется 6 пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и интеркалирующий краситель SYBR GREEN I.

3) Во все подготовленные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.

4) Во все подготовленные пробирки (кроме пробирок K- (отрицательный контрольный образец), К+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п. 1 ДНК.

5) В пробирку, маркированную K-, вносится 1 мкл чистой воды.

6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец.

7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

Источники информации

1. Патент RU 2362808. Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности.

2. Патент RU 2201636. Способ ранней диагностики дивертикулярной болезни ободочной кишки.

3. Заявка на патент WO 2012080753. Способ диагностики болезни Крона.

Набор синтетических олигонуклеотидов для диагностики болезни Крона и неспецифического язвенного колита путем выявления маркерных участков бактериальной ДНК методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:

1. 5′-TATGAGCAGTCGCTTACCCG-3′ и 5′-GTCGTCGGTATGTCCTGCTT-3′

2. 5′-CGTTAACCCGCTGTGGTAGT-3′ и 5′-CTACCGAGCCATCTTCCAGC-3′

3. 5′-GCGTTCAGAGCAAAACCCAG-3′ и 5′-TAAAAGACGGGAAGCAGCCA-3′

4. 5′-GGGCCGATATACAGGTGGTG-3′ и 5′-TCCTCAGGCATAAAGACGGC-3′

5. 5′- GTATCTCGTCTCCTGGCTGC-3′ и 5′-GCCAGCCATCCACCAGTAAT-3′

6. 5′-GTATAGATCCGTCAGGTGCAT-3′ и 5′-ACCTTCTGTTCCTGAAGCCC-3′
и интеркалирующий краситель SYBR GREEN I для детекции в режиме реального времени.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Описаны способы количественного определения специфического продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой и способ контроля в режиме реального времени реакции амплификации с внесением одноцепочечных разрывов и достройкой.

Изобретения относятся к области генетики, молекулярной биологии и медицины и касаются способа для анализа генетического полиморфизма в локусах ДНК ApoE, ApoJ и GAB2 и набора олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Изобретение относится к области биотехнологии. В изобретении описан способ идентификации пар фрагментов ДНК или РНК, исходно присутствующих в одних и тех же живых или фиксированных клетках, в частности, способ идентификации нативных пар генов легких и тяжелых цепей антител, а также нативных пар генов альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов (ТКР).
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики предрасположенности к посттравматическому остеоартрозу коленного сустава. У пациентов существляют генотипирование полиморфизма rs2276109 (A-82G) гена ММР-12.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития артериальной гипертензии. Осуществляют забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и определение инсерции/делеции (I- и D-аллели) Alu-фрагмента гена ангиотензинпревращающего фермента.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, вычисляют значение ΔCt, определяют коэффициент эффективности амплификации и рассчитывают степень гетероплазмии мутаций митохондриального генома по формуле.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и онкогинекологии, и предназначено для прогнозирования риска развития рака яичников.

Изобретение относится к биохимии. Предоставлена композиция для осуществления реакции замещения цепей нуклеиновых кислот, содержащая первый и второй комплексы нуклеиновых кислот, каждый из которых содержит первую, вторую, третью и четвертую цепи нуклеиновых кислот, где каждая из цепей содержит последовательно первый, второй и третий фрагменты.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны способ и система для определения того, существует ли аномалия генома.

Изобретение относится к биохимии. Описаны выделенные моноклональные антитела, которые специфически связываются с PD-1 с высокой аффинностью.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ для проведения пиросеквенирования нуклеиновых кислот. Способ включает этапы обеспечения вращающейся платформы, имеющей по меньшей мере одну открытую ячейку, предназначенную для содержания по меньшей мере одной несущей поверхности, причем указанная ячейка имеет такие форму или размеры, чтобы реагент, находящийся в ней, можно было удалить центрифугированием из указанной открытой ячейки и из указанной платформы при достаточном вращении указанной платформы; обеспечения по меньшей мере одной указанной несущей поверхности в форме магнитной частицы в каждой указанной открытой ячейке, где указанная несущая поверхность приспособлена для иммобилизации полинуклеотидной молекулы или на которой полинуклеотидная молекула была иммобилизирована; отжига олигонуклеотидного праймера с отдельной цепью указанной полинуклеотидной молекулы; количественного внесения в каждую указанную открытую ячейку из точки, расположенной за пределами платформы, серии реагентов для пиросеквенирования, при этом после внесения платформу вращают со скоростью, достаточной для того, чтобы любой остаточный или непрореагировавший указанный реагент был практически удален центрифугированием из каждой открытой ячейки и из платформы, при этом во время вращения каждую указанную магнитную частицу удерживают в указанной открытой ячейке за счет сил магнитного взаимодействия; анализа на присутствие пирофосфатной группы в каждой указанной ячейке; и повторения указанных этапов количественного внесения и анализа, таким образом секвенируя указанную полинуклеотидную молекулу. 22 з.п. ф-лы, 15 ил., 1 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих CVM и BLAD у крупного рогатого скота, включает выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси (тест-системы) с CVM/BLAD, содержащей 50 мМKСl, 50 mMTRIS-HCl, 250 нMdNTP, 2,5 мMMgCl2, праймеры - в концентрации 200 нМ, аллель-специфические зонды - в концентрации 100 Нм, имеющие следующие последовательности: CVM_up - gattctcaagagcttaattctaagga, CVM_low - aagtaaaccccagcaaagccac, CVM_Wt - (FAM) aggtctcatggcagttct-(BHQ1), CVM_m - (R6G) catggcatttctcacagcat-(BHQ2), BLAD_up - ttaggcagttgcgttc, BLAD_low - acgttgacgaggtcatccacca, BLAD_Wt - (ROX) accccatcgacctgtacta-(BHQ1), BLAD_m (Cy5) ccatcggcctgtactacct-(BHQ2), разбавитель, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, три положительных и один отрицательный контрольных образца. При подготовке к проведению реакции рассчитывают необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс 4, реактивы смешивают, затем в подготовленные для ПЦР пробирки вносят по 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси, в каждую ПЦР пробирку добавляют по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов, пробирки помещают в амплификатор, отжиг праймеров проходит на этапе циклирования при 64°С в течение 30 с при числе циклов амплификации равном 40. Анализ полученных данных проводят путем сравнения амплифицированных участков генов, результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Данные изобретения обеспечивают возможность диагностики одновременно двух мутантных аллелей, вызывающих CVM и BLAD у крупного рогатого скота, способствуют сокращению времени выполнения ПЦР-РВ. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и касается способа прогнозирования эффективности профилактики альбендазолом послеоперационного рецидива цистного эхинококкоза. Сущность способа заключается в том, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма *1F(163A/C) гена цитохрома Р450 CYP1A2 методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. При обнаружении генотипа CYP1A2F1*C/C прогнозируют высокую эффективность профилактики альбендазолом послеоперационного рецидива цистного эхинококкоза. Использование изобретения дает возможность прогнозировать эффективность профилактики альбендазолом рецидива цистного эхинококкоза с высокой точностью. 2 пр.
Наверх