Способ получения имитаторов патогенных биологических агентов

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см3 двукратно по 5 минут. Инактивированные бактерии стабилизировали защитной средой и высушивали в сублимационной камерной установке до остаточной влажности 2-5%. Целевой продукт состоит из сухой культуры инактивированных бактерий (91,5%), талька (8%) и аэросила (0,5%). Способ обеспечивает получение безопасного при использовании и длительно сохраняющего свои индикационные свойства имитатора патогенного биологического агента. 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к способам получения имитаторов патогенных биологических агентов (ПБА), содержащих инактивированные бактерии возбудителей опасных инфекционных заболеваний, в частности к способам приготовления имитационных средств, предназначенных для учебных, тренировочных, научно-исследовательских целей (обучение методам специфической индикации ПБА, подготовка проб, индикация и идентификация возбудителей опасных инфекционных заболеваний), и может быть использовано специалистами учреждений Роспотребнадзора и Министерства обороны России.

В качестве имитаторов ПБА возможно использование: вакцин на основе живых и убитых бактерий, диагностикумов, содержащих клеточные антигены, а также микроорганизмов, не имеющих патогенных свойств, но относящихся к тому же виду, что и возбудители опасных инфекционных заболеваний [МУ 4.2.1103-02. Приготовление проб с имитаторами патогенных биологических агентов: Методические указания. Утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, 27.01.2002 г.].

Известен способ получения имитатора возбудителя холеры (Vibrio cholerae), в качестве которого используется убитая корпускулярная (цельно клеточная) вакцина, состоящий в приготовлении взвеси холерных вибрионов в физиологическом растворе, убитых при 58°С, с последующим добавлением 0,5% фенола и 0,5% формалина [Е.И. Коробкова. Микробиология и эпидемиология холеры. - М.: Медгиз, 1959]. Общим с заявленным способом является температурное инактивирующее воздействие на клетки. К недостаткам этого способа относится снижение чувствительности методов специфической индикации возбудителя из-за наличия в составе имитатора свободного формальдегида.

Также известен способ получения имитатора возбудителя сибирской язвы в виде сибиреязвенной вакцины [Способ получения сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины, патент РФ 2181294], состоящий в приготовлении жидкого полуфабриката из равных объемов двух компонентов. Первый компонент - разведенная физиологическим раствором споровая суспензия Bacillus anthracis штамма СТИ-1 до концентрации от 0,8 до 1,2 спор/см3, смешанная со стерильным 40% раствором сахарозы в объемных соотношениях 1:1. Второй компонент - разведенный физиологическим раствором до содержания 400 среднеэффективных иммунизационных доз в см3 концентрат сорбированного протективного антигена, полученного из микробной культуры В. anthracis штамма 55/5. Последующее лиофильное высушивание жидкого полуфабриката в камерных сушильных установках в режиме: температура полуфабриката при замораживании от минус 35 до минус 40°С; время замораживания от 3 до 4 часов; разрежение в сублиматоре от 20 до 25 Па; температура полуфабриката при досушивании от 30 до 32°С; время досушивания от 10 до 12 часов.

Общим с заявленным способом является использование защитной среды, а также высушивание жидкого полуфабриката для получения сухой формы препарата. Недостатками данного способа получения имитатора являются многостадийность и длительность приготовления; обязательный контроль качества сырья, вспомогательных материалов, а также конечного и промежуточных продуктов; невозможность получения имитаторов других возбудителей опасных инфекционных заболеваний.

В качестве прототипа выбран способ приготовления имитатора возбудителя сапа (Burkholderia mallei) [МУ 4.2.1103-02], заключающийся в обеззараживании формалином, в конечной концентрации 1%, смешанной взвеси бактерий В. mallei штаммов 10230, Р-1 и 712, выращенных при 37°С в течение 1-2 суток на мясопептонном агаре с 5% глицерина. К недостаткам данного способа следует отнести помимо снижения чувствительности специфической индикации из-за с наличия в пробах формалина ограниченный срок годности препарата, связанный с лизисом клеток в жидкой среде имитатора, и отсутствие контроля полноты инактивации и безвредности имитатора.

Задачей изобретения является разработка способа получения сухих имитаторов ПБА, обладающих индикационными характеристиками, присущими бактериальным возбудителям опасных инфекционных заболеваний, длительно сохраняющих свои свойства в условиях хранения.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе приготовления имитаторов ПБА, включающем получение бактериальной суспензии с последующим ее обеззараживанием, предусмотрены следующие отличия: тепловая инактивация (стерилизация) бактерий с помощью СВЧ-излучения; использование защитной (стабилизирующей) среды высушивания; сублимационное обезвоживание и получение имитатора путем смешения с наполнителем и дезагрегантом.

Способ осуществляется следующим образом.

Суспензию, содержащую бактерии возбудителя, помещают в емкость из термостойкого стекла. Инактивацию микробной суспензии проводят в микроволновой печи с частотой СВЧ-излучения 2450 кГц. Режим инактивации:

- удельная мощность СВЧ-излучения - 6 Вт/см3;

- продолжительность - 5 минут, двукратно с промежуточным охлаждением до 20°С.

Стерильность инактивированной суспензии контролируют культуральным способом [Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. Пущино, 1990] путем посева на плотную питательную среду для культивирования бактерий и инкубирования посевов в условиях, определяемых видом возбудителя. Взвеси признают стерильными при отсутствии на поверхности плотной питательной среды как характерных, так и нехарактерных колоний.

Инактивированную суспензию бактерий в объемном соотношении 2:1 стабилизируют защитной средой следующего состава, процент (по массе):

- лактоза - 3;

- тиомочевина - 3;

- аскорбиновая кислота - 3;

- дистиллированная вода - 91.

Использование среды указанного состава позволяет предохранить белково-липидные и нуклеиновые структуры бактерий от повреждений при обезвоживании и последующем хранении.

Высушивание жидкого полуфабриката проводят на сублимационной камерной установке согласно инструкции по эксплуатации в режиме, обеспечивающем получение сухой инактивированной культуры с остаточной влажностью от 2 до 5%.

Имитатор получают после смешения сухой инактивированной культуры (91,5%) с наполнителем - тальком (8,0%) и дезагрегантом - гидрофобизированным аэросилом (0,5%). Использование указанных веществ снижает силы адгезии и препятствует слеживаемости частиц в препарате. Агрегатно-устойчивая структура имитатора позволяет хранить его при температуре от 0 до 4°С в течение 2 лет.

Безвредность имитатора контролируют постановкой биологических проб на токсичность с использованием лабораторных животных [МУК 4.1/4.2.588-96. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания. - М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998]. Имитатор считают безвредным, если все животные остались живы, не имели признаков заболевания, не уменьшили массу тела.

Индикационные характеристики имитаторов оценивают по результатам специфической индикации методами экспресс-анализа ИФА, РИГА, ПЦР [Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. Г.Г. Онищенко. - М.: МП «Гигиена», 2006].

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существующих признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.

Изобретение позволяет получать безвредные для человека и животных имитаторы на основе инактивированных бактерий, обладающие индикационными характеристиками соответствующих ПБА, сохраняющимися в течение 2 лет. Единый подход к созданию сухой формы препарата позволяет получить имитаторы на основе возбудителей чумы, холеры, сапа, туляремии, сибирской язвы, мелиоидоза, бруцеллеза и т.п. и использовать их для конструирования проб.

Возможность осуществления заявленного изобретения показана следующими примерами.

Пример 1

Приготовление имитатора возбудителя сибирской язвы

Получали культуру В. anthracis штамма СТИ-1, культивируя в матрацах со скошенным агаром Хоттингера, содержащим (0,5±0,1) г/дм аминного азота при температуре от 33 до 35°С в течение 48 часов [Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. Г.Г. Онищенко. - М.: МП «Гигиена», 2006]. Типичный рост на поверхности представляет собой толстую шероховатую пленку серого цвета. В стерильных условиях смывали культуру с поверхности агара физиологическим раствором. Смытую с матрацев культуру разводили физиологическим раствором до концентрации 50 млрд кл./см3 по стандарту мутности. 100 см3 микробной суспензии помещали в емкость из термостойкого стекла и обрабатывали в микроволновой печи при мощности облучении 600 Вт двукратно по 5 минут с охлаждением между нагревами до 20°С. Полноту инактивации оценивали культуральным способом после высева цельного разведения суспензии на плотную питательную среду, инкубации при температуре от 33 до 35°С в течение 48 часов. Отсутствие роста на поверхности среды свидетельствовало о полной инактивации клеток.

Взвесь инактивированных бактерий в соотношении 2 части к 1 стабилизировали защитной средой, состоящей из 3% лактозы, 3% тиомочевины, 3% аскорбиновой кислоты и 91% дистиллированной воды.

Высушивание полученного жидкого полуфабриката проводили в установке МАСС-5-02 при температуре инактивированной суспензии от минус 36°С до минус 26°С, температуре конденсатора-вымораживателя от минус 60°С до минус 48°С и общей продолжительностью 38 часов. Получили сухую культуру инактивированных спор с остаточной влажностью 3,5%.

Готовили имитатор возбудителя сибирской язвы, смешивая 91,5% сухой культуры инактивированных клеток В.anthracis, 8% талька и 0,5% аэросила. Безвредность имитатора оценивали после постановки биопробы на белых мышах обоего пола, массой 18-20 г и морских свинках обоего пола, массой 250-350 г. Имитатор посчитали безвредным по отсутствию у лабораторных животных клинических симптомов интоксикации и характерных признаков местно-раздражительного действия.

Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя сибирской язвы представлены в таблице 2.

Пример 2

Приготовление имитатора возбудителя сапа

Получали культуру В. mallei штамма Ц-5, культивируя на мясопептонном агаре с 5% глицерина при температуре 37°С в течение 48 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя сапа представлены в таблице 2.

Пример 3

Приготовление имитатора возбудителя холеры

Получали культуру V. cholerae штамма МО-45, культивируя на питательной среде для выделения и культивирования холерного вибриона при температуре от 35 до 37°С в течение 18 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя холеры представлены в таблице 2.

Пример 4

Приготовление имитатора возбудителя туляремии

Получали культуру Francisella tularensis штамма 15 НИИЭГ, культивируя на питательной среде для культивирования и выделения туляремийного микроба (FT) при температуре от 36 до 38°С в течение 48 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя туляремии представлены в таблице 2.

Пример 5

Приготовление имитатора возбудителя чумы

Получали культуру Yersinia pestis штамма 926 (Otten), культивируя на агаре Хоттингера с 0,025% сульфацила натрия при температуре от 28 до 30°С в течение 48 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя чумы представлены в таблице 2.

Способ получения имитаторов патогенных биологических агентов, включающий обработку суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания инактивирующим воздействием, отличающийся тем, что суспензию клеток подвергают СВЧ-облучению с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см3, двукратно по 5 минут, смешивают в соотношении 2:1 с защитной средой, состоящей из дистиллированной воды (91%), лактозы (3%), тиомочевины (3%), аскорбиновой кислоты (3%), высушивают в сублимационной камерной установке с получением целевого продукта, состоящего из сухой культуры инактивированных бактерий (91,5%), талька (8%) и аэросила (0,5%) с остаточной влажностью 2-5%.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов. При осуществлении предлагаемого способа получения сыворотки для диагностики алеутской болезни норок (АБН) получают высокоочищенный вирусный антиген путем гомогенизации органов инфицированных АБН норок с последующим трехкратным замораживанием/размораживанием гомогената, дезинтеграции клеточного гомогената трехкратной ультразвуковой обработкой, осаждением неразрушенных клеток двукратным низкоскоростным центрифугированием, последующим осаждением иммунных комплексов, уплотнением осадка низкоскоростным центрифугированием, экстрагированием иммунных комплексов (ИК) минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратной экстракции на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, осаждением ИК высокоскоростным центрифугированием из объединенных экстрактов при 30000 об/мин в течение 2,5 часов, извлечением ИК из осадка минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратного экстрагирования на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, диссоциацией иммунных комплексов в кислой среде в течение 1 часа на холоду, отделением вируса АБН-Ф от антител высокоскоростным ультрацентрифугированием, растворением осадка в минимальном количестве карбонатного буфера, отделением ферритина от вирусных частиц на колонке с сефарозой 6B в системе карбонатного буфера.
Изобретение относится к медицине, а именно к малоинвазивным методам в хирургической эндокринологии, и касается дифференциальной диагностики образований шеи. Способ включает ультразвук-контролируемую тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию, которую выполняют однократно одной иглой через один прокол.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе.
Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин.

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум.
Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой Штамм микроорганизмов Achromobacter spanius 10-50-TS2, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за №В-12405, в качестве средства повышения устойчивости растений в условиях хлоридного засоления почв.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению (R)-фенилметилсульфоксида. Способ предусматривает окисление фенилметилсульфида с применением биокатализатора - иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток Gordonia terrae ИЭГМ 136.
Заявленная группа изобретений относится к биотехнологии. Способ получения сухой бактериальной закваски для производства кисломолочных продуктов предусматривает раздельное культивирование штаммов Streptococcus thermophilus КД7 41 №2 ВКПМ В-10403 и Streptococcus thermophilus ЗЛ-047 ВКПМ В-10707.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae.

Предложены штамм Lactobacillus mucosae для получения ферментированных пищевых продуктов и пищевой продукт, содержащий указанный штамм. Штамм Lactobacillus mucosae депонирован в CNCM под номером I-4429.

Изобретение относится к медицине, а именно к применению препарата «Винфар» в качестве средства для стимуляции репаративного остеогенеза при лечении открытых переломов костей конечностей с помощью интрамедуллярного остеосинтеза.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения капсульного полисахарида с пневмококковым серотипом.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для создания функциональных продуктов питания. Способ получения бактериального препарата с пробиотической активностью на основе представителей нормальной кишечной микрофлоры человека, включающий выделение бифидобактерий и лактобактерий из фекалий человека, культивирование их на жидкой питательной среде в анаэробных условиях при температуре 37°C с последующим центрифугированием и выделением бактериального препарата.

Изобретения относятся к биотехнологии и могут быть использованы для производства масляной кислоты. Штамм анаэробных бактерий Clostridium tyrobutyricum, синтезирующий масляную кислоту с высокой селективностью (до 100%) и устойчивый к ее концентрации до 2,0 об.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и может быть использовано для производства спорового материала из бактерий штамма Bacillus sp. 1839.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus paracasei MCC1849, обладающий высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью. Штамм используют в качестве ингредиента лекарственного средства для иммуностимуляции, средства против вируса гриппа, продукта питания, напитка, корма и средства, стимулирующего продуцирование IL-12. 7 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Втсм3 двукратно по 5 минут. Инактивированные бактерии стабилизировали защитной средой и высушивали в сублимационной камерной установке до остаточной влажности 2-5. Целевой продукт состоит из сухой культуры инактивированных бактерий, талька и аэросила. Способ обеспечивает получение безопасного при использовании и длительно сохраняющего свои индикационные свойства имитатора патогенного биологического агента. 2 табл., 5 пр.

Наверх