Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, и может быть использовано в медицине. Клеточную линию меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получают из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157. Изобретение позволяет получить клеточную линию меланомы кожи человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и характеризуется экспрессией антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса. 1 табл.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы.

Иммунотерапия является одним из способов лечения онкологических заболеваний. Принцип данного способа основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для разработки иммунологических подходов в лечении опухолевых заболеваний.

Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково-тестикулярные антигены (MAGE и др.), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1 и др.), мутированные антигены. С иммунологической точки зрения мишенями для иммунотерапии опухолей могут быть раково-тестикулярные антигены, так как в нормальных тканях эта группа антигенов не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы. В отличие от раково-тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности иммунной системы к этим «своим» антигенам. Однако некоторые дифференцировочные антигены содержат эпитопы для узнавания цитотоксическими лимфоцитами и способны индуцировать генерацию меланомаспецифических цитотоксических лимфоцитов.

Задачей настоящего изобретения является получение новой клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr EEMC с определенным набором антигенов для разработки иммунологических подходов в лечении злокачественных опухолей.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий для разработки иммунологических подходов в лечении злокачественных опухолей.

Поставленная задача решается тем, что получена клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС из клеточной линии mel Ibr меланомы кожи человека (патент РФ №2287576).

Заявляемая клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157.

Родословная клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получена из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров - CD63, HMW, а также раково-тестикулярного маркера MAGE-3, наличием антигенов гистосовместимости I и II класса (патент РФ №2287576).

Получение клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Для получения клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС клетки родительской линии меланомы кожи человека mel Ibr культивировали в среде RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки в течение трех пассажей, затем рассеивали на чашки Петри диаметром 60 мм в количестве 200-400 клеток на чашку (в дубликатах) и культивировали в такой же ростовой среде с однократным добавлением 2% эмбрионального экстракта. Смену ростовой среды проводили 1 раз в 3 дня. Через 7-10 дней наблюдали образование единичных колоний из клеток веретенообразной формы. Спустя 14 дней колонии снимали раствором Версена и переносили в культуральный флакон 25 см³ с ростовой средой для дальнейшего культивирования и наращивания. Культуру, прошедшую 20 пассажей, помещали в среду Methocult-GI Н4434 в чашках Петри диаметром 230 мм. Клетки рассеивали в количестве 200 тыс. на чашку и оставляли на рост в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 10-14 дней. Далее клетки культивировали для наращивания в культуральных флаконах 25 см³ с ростовой средой. Культура клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС росла в виде колоний, состоящих из клеток веретенообразной формы.

Морфологические признаки клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Культура клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС мономорфная, представлена клетками разных форм: вытянутой, веретенообразной с двумя тонкими отростками разной длины. Цитоплазма клеток необильна, окрашена в базофильные тона различной степени интенсивности. Ядра опухолевых клеток крупных размеров, гиперхромные с 1-3 ядрышками. Клетки соединяются в монослой с образованием сфероидов на его поверхности. По морфологическим признакам клеточная линия низкодифференцированная.

Кариологическая характеристика клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Проанализировано 20 метафаз. Число хромосом колеблется от 77 до 84. Модальное число хромосом соответствует гипотетраплоидному набору (4n-). Обнаружены следующие структурные перестройки: дериватная хромосома 9, образованная транслокацией 1 и 9 хромосом; делеция короткого плеча хромосомы 6 (p21-pter), а также дериватная хромосома 6, образовавшаяся в результате терминальной делеции короткого плеча хромосомы 6 (p12-pter) и дупликацией части длинного плеча хромосомы 6.

Кариотип - 77~84<4n->,XXX,-X,del(6)(p21),?der(6)del(6)(pl2)dup(6)(q?q?),

der(9)t(1;9)(q12;p21),inc.

Постоянные маркеры от m1 до m9.

Культуральные свойства клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС культивируется в питательной среде RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамина, 5% ТЭС (телячья эмбриональная сыворотка HyClone, США), 1% HEPES, антибиотиков - пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab). Для выращивания культуры используют пластиковые культуральные флаконы (Costar). Во флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°C и 5% CO₂. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. Пассаж 1 раз в 3-4 суток. Метод снятия: 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1.

Условия криоконсервации клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из 80% питательной среды RPMI-1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°C в минуту до минус 25°C, затем быстрое замораживание до минус 70°C. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°C. Размораживание быстрое, при температуре 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см³. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Полученная клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлуоресценции, иммуногистохимии, полимеразной цепной реакции (ПЦР) была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости).

Дифференцировочные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD133, CD105, CD44. Раково-тестикулярный маркет-MAGE-3, который может быть экспрессирован на опухолях различного гистогенеза, исследован с помощью ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлуоресценции.

Изобретение иллюстрируется таблицей.

В таблице представлена экспрессия антигенов на клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС. Заявляемая клеточная линия характеризуется наличием антигенов гистосовместимости I класса (HLA-ABC - положит.) и отсутствием антигенов II класса (HLA-DR - отр.) и экспрессией дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44, указывающих на специфичность данной клеточной линии.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr EEMC, предназначенная для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, характеризуется наличием антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса; хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157.

Изобретение относится к клеточной технологии. Описано применение полученных из жировой ткани стромальных стволовых клеток в производстве фармацевтической композиции для лечения свища у субъекта, где указанные полученные из жировой ткани стромальные стволовые клетки являются аллогенными по отношению к субъекту, которого предстоит лечить.

Способ получения экзосом из крови // 2608509

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения экзосом из крови, в котором кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию с помощью центрифугирования при 600 g в течение 20 минут.

Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток // 2607380

Настоящее изобретение относится к способам дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток. В частности, в настоящем изобретении предложены способы характеризации клеток, дифференцировавших в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, на основании анализа уникальных маркеров клеточной поверхности.

Способ определения биологической активности вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи при производстве ассоциированных препаратов (варианты) // 2606848

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Предложены способы определения биологической активности монокомпонентов в ассоциированных комбинированных ди- и тривакцинах, содержащих вакцинные штаммы вируса кори (Л-16), эпидемического паротита (Л-3) и/или краснухи (Орлов).

Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем // 2604804

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем // 2604802

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области гигиенической безопасности объектов пищевого назначения. Предложен способ определения безопасности пищевых ингредиентов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Понижающая регуляция трансктипции sine/alu ретротранспозонов для индукции или восстановления способности к пролиферации и/или плюрипотентности стволовой клетки // 2603731

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ индукции, и/или восстановления, и/или поддержания фенотипа без признаков старения или его аспектов, в частности способности к пролиферации и/или плюрипотентности в клетке млекопитающего.

Вакцина против ehrlichia canis // 2603274

Изобретение касается вакцинной композиции. Охарактеризованная вакцинная композиция содержит эффективное иммунизирующее количество инактивированной Ehrlichia canis (Е.

Новый способ получения дифференцированных клеток // 2603094

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения зрелых мегакариоцитарных клеток.

Способ дифференцировки живых сперматозоидов с помощью диагностической культуральной среды при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения // 2603084

Настоящее изобретение относится к области андрологии, репродуктологии и клинической эмбриологии. Способ дифференцировки живых сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения предусматривает использование диагностической культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов с увеличенной концентрацией пентоксифиллина 3,6 мМ/л и кофеином в концентрации 5 мМ/л.

Клеточная линия crov cel муцинозного рака яичников человека, предназначенная для разработки лечения таргетными препаратами // 2608960

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки лечения таргетными препаратами, и может быть использовано в медицине. Клеточная линия crov Cel муцинозного рака яичников человека характеризуется наличием в 9 экзоне гена PIK3CA соматической миссенс-мутации Е542К (с.1624 G/A), приводящей к аминокислотной замене в 542 кодоне (p.Glu542Lys). Мутация зарегистрирована в международной базе данных (COSMIC, COSM760Id) и ассоциирована с повышенной чувствительностью к терапии ингибиторами mTOR. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером Н-160. Изобретение позволяет получить клеточную линию crov Cel муцинозного рака яичников человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. 8 ил., 3 табл.

Способ выделения мезенхимных стволовых клеток из орбитальной жировой ткани // 2609657

Изобретение относится к области биотехнологии, тканевой инженерии, конкретно к выделению мезенхимных стволовых клеток (МСК) из орбитальной жировой ткани (ОЖТ), и может быть использовано в медицине. Способ включает измельчение ОЖТ на фрагменты, расщепление фрагментов раствором коллагеназы, осаждение клеток путем центрифугирования в течение 5 минут, перенос их в пластиковый культуральный флакон. Расщепление фрагментов ОЖТ проводят раствором коллагеназы второго типа в сбалансированном растворе Хэнкса в соотношении 1 мг/мл на 0,1 г жировой ткани при температуре 37°С в шейкере в течение 60 минут. Полученную суспензию центрифугируют со скоростью 1300 оборотов в минуту, после чего жировую фракцию вместе с клетками, осажденными на дно, переносят в пластиковый культуральный флакон, который заполняют 5 мл питательной среды следующего состава: 45 мл среды DMEM/F12, 5 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоль L-глутамина, 100 мкл смеси антибиотиков, состоящей из 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина, и культивируют в CO2-инкубаторе при 37°С и 5% CO2 в атмосфере, на вторые сутки при замене питательной среды на свежую того же состава проводят удаление эритроцитов и других клеток стромально-сосудистой фракции, а также плавающих на поверхности фрагментов жировой ткани. Изобретение позволяет повысить однородность и качество получения популяции МСК с улучшением их чистоты, эффективно использовать исходный тканевой материал. 2 ил., 2 пр.

Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток // 2610176

Изобретение относится к биохимии. Описана популяция панкреатических эндокринных клеток, которые соэкспрессируют NKX6.1 и инсулин, и где менее 10% клеток в популяции экспрессируют глюкагон, где популяцию панкреатических эндокринных клеток получают дифференцировкой плюрипотентных стволовых клеток человека, полученных из устойчивых линий эмбриональных стволовых клеток человека, где указанная дифференцировка включает первую стадию культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей агонист рецептора TGF-β, выбранный из группы, состоящей из активина А, активина В, TGFβ-I, TGFβ-II, GDF-8 и GDF-11, в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл, и дополнительную стадию культивирования клеток панкреатической эндодермы в среде, содержащей от 20 нМ до 500 нМ (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам. Также описаны способы формирования такой популяции. Изобретение расширяет арсенал панкреатических эндокринных клеток, полученных искусственным путём. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 6 пр.

Способы и композиции для применения в клеточной терапии // 2610427

Изобретение относится к области биохимии, а именно к применению мезенхимальных стволовых клеток в способе лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний, а также для производства лекарственного средства для лечения симптомов указанных заболеваний. Мезенхимальные стволовые клетки применяются путем их введения в лимфатическую систему субъекта. Дополнительные аспекты изобретения относятся к набору и способу лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний. Изобретение обеспечивает улучшенную терапию стволовыми клетками. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Высокобезопасный способ получения очищенных фракций стволовых клеток // 2611201

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения фракций стволовых клеток, имеющих происхождение из липидной ткани, включающий стадии: (a) сбора или получения образца липидной ткани, содержащей стволовые клетки; (b) промывания образца со стадии (а) подходящим водным буфером; (c) инкубирования образца со стадии (b) с ферментом, способным перерабатывать липидную ткань и извлекать из нее стволовые клетки; (d) инактивирования фермента, использованного на стадии (с), и извлечения водной фазы из продукта со стадии (с); (e) очистки водной фазы, полученной на стадии (d); (f) титрования водной фазы, полученной на стадии (е), и, если необходимо, ее разбавления, чтобы получить конечную фракцию стволовых клеток с желаемой концентрацией и объемом, в котором материал, содержащий стволовые клетки, обрабатывают в шприце на всем протяжении по меньшей мере стадий: (а), (b) и (с), указанный шприц, выполняет функции собирающего устройства, фазового разделителя и технологического реактора. Изобретение обеспечивает высокобезопасный способ получения очищенных фракций стволовых клеток липидного происхождения, в котором предусматривается использование индивидуального собирающего устройства; снижение количества переносов и манипуляций, которым подвергается материал, содержащий стволовые клетки, понижая до минимума риски загрязнения, потери материала и случайный обмен образцами, и дальнейшее упрощение взаимодействия и сотрудничества между персоналом, извлекающим сырьевой материал, и экспертом по выделению стволовых клеток. 11 з.п. ф-лы, 1 пр.

Способ получения препарата на основе стволовых клеток, выделенных из ткани селезенки свиней, для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных // 2611205

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и биофармакологии, конкретно к получению препарата на основе стволовых клеток, выделенных из ткани селезенки свиней, для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных. Изобретение может найти применение в ветеринарии для лечения и профилактики широкого круга заболеваний домашних и сельскохозяйственных животных. Способ включает введение в клеточно-культуральную среду, полученную из измельченной ткани селезенки свиней, обработанной 0,5%-ным раствором метронидазола и 0,05%-ным раствором хлоргексина с последующими дезагрегацией ее 0,25%-ным раствором трипсина и культивированием клеточного материала с концентрацией клеток 1,5⋅106-2,0⋅106 на 1 мл ростовой среды Игла-MEM с добавлением 10-15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в присутствии стимулятора роста клеточных культур Пинексида, препарата «Повин ВМ», в состав которого входят водный раствор полиэтиленгликоля, водный раствор поливинилпирролидона, коммерческий раствор Версена, раствор тетрациклина и коммерческий раствор трипсина. Изобретение позволяет расширить группу препаратов на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных с расширенным спектром его применения в лечении и восстановлении структуры утраченных органов животных. 7 ил., 28 пр.

Способ культивирования адгезионных клеток // 2612154

Изобретение относится к клеточной технологии. Описан способ получения адгезионных клеток в соответствии с которым: a. адгезионные клетки вносят в культуральный сосуд, который содержит микроносители в культуральной среде; b. клетки амплифицируют, проводя несколько последовательных пассажей клеток в том же самом культуральном сосуде, причем каждый пассаж клеток, следующий за первым пассажем клеток, проводят: i. используя всю или часть популяции клеток, которая была получена в течение предшествующего пассажа клеток, после проведения ферментативной обработки популяции клеток для открепления клеток от микроносителей; и ii. внося культуральную среду и увеличивая количество микроносителей; и c. популяцию адгезионных клеток, полученную в течение последнего пассажа клеток, собирают после необязательного проведения ферментативной обработки указанной популяции клеток для открепления клеток от микроносителей. Изобретение расширяет арсенал средств для получения адгезионных клеток. 3 н. и 37 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 7 пр.

Связывающие sdf-1 нуклеиновые кислоты и их применение // 2612388

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине для получения лекарственного средства для лечения рака. Получают молекулу L-нуклеиновой кислоты, связывающуюся с SDF-1, которая содержит в 5'→3' направлении первый участок нуклеотидов, коровую нуклеотидную последовательность и второй участок нуклеотидов или в 5'→3' направлении второй участок нуклеотидов, коровую нуклеотидную последовательность и первый участок нуклеотидов. При этом коровая нуклеотидная последовательность содержит 5'GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG3' (SEQ ID NO: 57), где указанный первый и второй участок нуклеотидов имеет достаточную степень обратной комплиментарности для гибридизации друг с другом, где при гибридизации формируется двухнитевая структура и где двухнитевая структура состоит из четырех-шести пар оснований. Указанная нуклеиновая кислота может быть модифицирована HES или PEG. Изобретение позволяет способствовать мобилизации клеток, экспрессирующих рецепторы SDF-1, в периферическую кровь пациента. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 43 ил., 3 табл., 14 пр.

Лечение амиотрофического бокового склероза с использованием полученных из пуповины клеток // 2612391

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам лечения амиотрофического бокового склероза, что может быть использовано в медицине. Пациенту вводят клетки, полученные из ткани пуповины, способные к самообновлению и размножению, обладающие потенциалом к дифференцированию в клетку нейронного фенотипа. Изобретение позволяет сохранить функцию двигательных нейронов у пациента с амиотрофическим боковым склерозом. 5 н. и 24 з.п. ф-лы, 19 ил., 25 табл., 25 пр.

Мыши, у которых вырабатываются связывающие белки, содержащие vl-домены // 2612903

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложена мышь для продукции цепи иммуноглобулина. Мышь способна продуцировать цепь иммуноглобулина, включающую вариабельный домен легкой цепи, слитый с константным доменом тяжелой цепи, и содержит в своих зародышевых клетках первый нереаранжированный Vκ-сегмент легкой цепи человека и нереаранжированный Jκ-сегмент человека, функционально связанный с эндогенной нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи мыши в эндогенном мышином локусе тяжелой цепи. При этом первый нереаранжированный Vκ генный сегмент легкой цепи человека и нереаранжированный Jκ генный сегмент человека заменяют все функциональные эндогенные VH генные сегменты тяжелой цепи мыши, все функциональные эндогенные DH генные сегменты мыши и все функциональные эндогенные JH генные сегменты тяжелой цепи мыши в эндогенном мышином локусе тяжелой цепи. Также описано применение такой мыши для продукции антитела. 8 н. и 14 з.п. ф-лы, 21 ил., 5 табл., 5 пр.