Клеточная линия меланомы кожи человека mel ibr eemc, предназначенная для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы

Авторы патента:

 


Владельцы патента RU 2608959:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, и может быть использовано в медицине. Клеточную линию меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получают из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157. Изобретение позволяет получить клеточную линию меланомы кожи человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и характеризуется экспрессией антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса. 1 табл.

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, предназначенных для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы.

Иммунотерапия является одним из способов лечения онкологических заболеваний. Принцип данного способа основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для разработки иммунологических подходов в лечении опухолевых заболеваний.

Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково-тестикулярные антигены (MAGE и др.), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1 и др.), мутированные антигены. С иммунологической точки зрения мишенями для иммунотерапии опухолей могут быть раково-тестикулярные антигены, так как в нормальных тканях эта группа антигенов не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы. В отличие от раково-тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности иммунной системы к этим «своим» антигенам. Однако некоторые дифференцировочные антигены содержат эпитопы для узнавания цитотоксическими лимфоцитами и способны индуцировать генерацию меланомаспецифических цитотоксических лимфоцитов.

Задачей настоящего изобретения является получение новой клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr EEMC с определенным набором антигенов для разработки иммунологических подходов в лечении злокачественных опухолей.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий для разработки иммунологических подходов в лечении злокачественных опухолей.

Поставленная задача решается тем, что получена клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС из клеточной линии mel Ibr меланомы кожи человека (патент РФ №2287576).

Заявляемая клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157.

Родословная клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС получена из клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров - CD63, HMW, а также раково-тестикулярного маркера MAGE-3, наличием антигенов гистосовместимости I и II класса (патент РФ №2287576).

Получение клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Для получения клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС клетки родительской линии меланомы кожи человека mel Ibr культивировали в среде RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки в течение трех пассажей, затем рассеивали на чашки Петри диаметром 60 мм в количестве 200-400 клеток на чашку (в дубликатах) и культивировали в такой же ростовой среде с однократным добавлением 2% эмбрионального экстракта. Смену ростовой среды проводили 1 раз в 3 дня. Через 7-10 дней наблюдали образование единичных колоний из клеток веретенообразной формы. Спустя 14 дней колонии снимали раствором Версена и переносили в культуральный флакон 25 см3 с ростовой средой для дальнейшего культивирования и наращивания. Культуру, прошедшую 20 пассажей, помещали в среду Methocult-GI Н4434 в чашках Петри диаметром 230 мм. Клетки рассеивали в количестве 200 тыс. на чашку и оставляли на рост в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 10-14 дней. Далее клетки культивировали для наращивания в культуральных флаконах 25 см3 с ростовой средой. Культура клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС росла в виде колоний, состоящих из клеток веретенообразной формы.

Морфологические признаки клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Культура клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС мономорфная, представлена клетками разных форм: вытянутой, веретенообразной с двумя тонкими отростками разной длины. Цитоплазма клеток необильна, окрашена в базофильные тона различной степени интенсивности. Ядра опухолевых клеток крупных размеров, гиперхромные с 1-3 ядрышками. Клетки соединяются в монослой с образованием сфероидов на его поверхности. По морфологическим признакам клеточная линия низкодифференцированная.

Кариологическая характеристика клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Проанализировано 20 метафаз. Число хромосом колеблется от 77 до 84. Модальное число хромосом соответствует гипотетраплоидному набору (4n-). Обнаружены следующие структурные перестройки: дериватная хромосома 9, образованная транслокацией 1 и 9 хромосом; делеция короткого плеча хромосомы 6 (p21-pter), а также дериватная хромосома 6, образовавшаяся в результате терминальной делеции короткого плеча хромосомы 6 (p12-pter) и дупликацией части длинного плеча хромосомы 6.

Кариотип - 77~84<4n->,XXX,-X,del(6)(p21),?der(6)del(6)(pl2)dup(6)(q?q?),

der(9)t(1;9)(q12;p21),inc.

Постоянные маркеры от m1 до m9.

Культуральные свойства клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС культивируется в питательной среде RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамина, 5% ТЭС (телячья эмбриональная сыворотка HyClone, США), 1% HEPES, антибиотиков - пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab). Для выращивания культуры используют пластиковые культуральные флаконы (Costar). Во флаконы объемом 25 см3 в 5 мл среды засевают 1×106 клеток. Температура культивирования 37°C и 5% CO2. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. Пассаж 1 раз в 3-4 суток. Метод снятия: 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1.

Условия криоконсервации клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из 80% питательной среды RPMI-1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°C в минуту до минус 25°C, затем быстрое замораживание до минус 70°C. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°C. Размораживание быстрое, при температуре 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см3. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС

Полученная клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлуоресценции, иммуногистохимии, полимеразной цепной реакции (ПЦР) была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости).

Дифференцировочные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD133, CD105, CD44. Раково-тестикулярный маркет-MAGE-3, который может быть экспрессирован на опухолях различного гистогенеза, исследован с помощью ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлуоресценции.

Изобретение иллюстрируется таблицей.

В таблице представлена экспрессия антигенов на клеточной линии меланомы кожи человека mel Ibr ЕЕМС. Заявляемая клеточная линия характеризуется наличием антигенов гистосовместимости I класса (HLA-ABC - положит.) и отсутствием антигенов II класса (HLA-DR - отр.) и экспрессией дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44, указывающих на специфичность данной клеточной линии.

Клеточная линия меланомы кожи человека mel Ibr EEMC, предназначенная для разработки иммунологических подходов в лечении меланомы, имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, характеризуется наличием антигенов гистосовместимости I класса, дифференцировочных маркеров CD133, CD105, CD44 и отсутствием антигенов гистосовместимости II класса; хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Н-157.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к клеточной технологии. Описано применение полученных из жировой ткани стромальных стволовых клеток в производстве фармацевтической композиции для лечения свища у субъекта, где указанные полученные из жировой ткани стромальные стволовые клетки являются аллогенными по отношению к субъекту, которого предстоит лечить.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения экзосом из крови, в котором кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию с помощью центрифугирования при 600 g в течение 20 минут.

Настоящее изобретение относится к способам дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток. В частности, в настоящем изобретении предложены способы характеризации клеток, дифференцировавших в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, на основании анализа уникальных маркеров клеточной поверхности.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Предложены способы определения биологической активности монокомпонентов в ассоциированных комбинированных ди- и тривакцинах, содержащих вакцинные штаммы вируса кори (Л-16), эпидемического паротита (Л-3) и/или краснухи (Орлов).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области гигиенической безопасности объектов пищевого назначения. Предложен способ определения безопасности пищевых ингредиентов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ индукции, и/или восстановления, и/или поддержания фенотипа без признаков старения или его аспектов, в частности способности к пролиферации и/или плюрипотентности в клетке млекопитающего.

Изобретение касается вакцинной композиции. Охарактеризованная вакцинная композиция содержит эффективное иммунизирующее количество инактивированной Ehrlichia canis (Е.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения зрелых мегакариоцитарных клеток.
Настоящее изобретение относится к области андрологии, репродуктологии и клинической эмбриологии. Способ дифференцировки живых сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения предусматривает использование диагностической культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов с увеличенной концентрацией пентоксифиллина 3,6 мМ/л и кофеином в концентрации 5 мМ/л.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, предназначенных для разработки лечения таргетными препаратами, и может быть использовано в медицине. Клеточная линия crov Cel муцинозного рака яичников человека характеризуется наличием в 9 экзоне гена PIK3CA соматической миссенс-мутации Е542К (с.1624 G/A), приводящей к аминокислотной замене в 542 кодоне (p.Glu542Lys). Мутация зарегистрирована в международной базе данных (COSMIC, COSM760Id) и ассоциирована с повышенной чувствительностью к терапии ингибиторами mTOR. Полученная линия клеток хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером Н-160. Изобретение позволяет получить клеточную линию crov Cel муцинозного рака яичников человека, которая обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. 8 ил., 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, тканевой инженерии, конкретно к выделению мезенхимных стволовых клеток (МСК) из орбитальной жировой ткани (ОЖТ), и может быть использовано в медицине. Способ включает измельчение ОЖТ на фрагменты, расщепление фрагментов раствором коллагеназы, осаждение клеток путем центрифугирования в течение 5 минут, перенос их в пластиковый культуральный флакон. Расщепление фрагментов ОЖТ проводят раствором коллагеназы второго типа в сбалансированном растворе Хэнкса в соотношении 1 мг/мл на 0,1 г жировой ткани при температуре 37°С в шейкере в течение 60 минут. Полученную суспензию центрифугируют со скоростью 1300 оборотов в минуту, после чего жировую фракцию вместе с клетками, осажденными на дно, переносят в пластиковый культуральный флакон, который заполняют 5 мл питательной среды следующего состава: 45 мл среды DMEM/F12, 5 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоль L-глутамина, 100 мкл смеси антибиотиков, состоящей из 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина, и культивируют в CO2-инкубаторе при 37°С и 5% CO2 в атмосфере, на вторые сутки при замене питательной среды на свежую того же состава проводят удаление эритроцитов и других клеток стромально-сосудистой фракции, а также плавающих на поверхности фрагментов жировой ткани. Изобретение позволяет повысить однородность и качество получения популяции МСК с улучшением их чистоты, эффективно использовать исходный тканевой материал. 2 ил., 2 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описана популяция панкреатических эндокринных клеток, которые соэкспрессируют NKX6.1 и инсулин, и где менее 10% клеток в популяции экспрессируют глюкагон, где популяцию панкреатических эндокринных клеток получают дифференцировкой плюрипотентных стволовых клеток человека, полученных из устойчивых линий эмбриональных стволовых клеток человека, где указанная дифференцировка включает первую стадию культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей агонист рецептора TGF-β, выбранный из группы, состоящей из активина А, активина В, TGFβ-I, TGFβ-II, GDF-8 и GDF-11, в концентрации от около 2 нг/мл до 100 нг/мл, и дополнительную стадию культивирования клеток панкреатической эндодермы в среде, содержащей от 20 нМ до 500 нМ (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам. Также описаны способы формирования такой популяции. Изобретение расширяет арсенал панкреатических эндокринных клеток, полученных искусственным путём. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии, а именно к применению мезенхимальных стволовых клеток в способе лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний, а также для производства лекарственного средства для лечения симптомов указанных заболеваний. Мезенхимальные стволовые клетки применяются путем их введения в лимфатическую систему субъекта. Дополнительные аспекты изобретения относятся к набору и способу лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний. Изобретение обеспечивает улучшенную терапию стволовыми клетками. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 1 пр.
Наверх