Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток. Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих содержит натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистин, пантотенат кальция, пиридоксаль НСl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, сыворотку крупного рогатого скота, амфотерицин, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет получить качественную и экономически выгодную питательную среду. 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Область биотехнологии, сфера питательных сред, суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21).

Уровень техники

Из литературных данных известны прописи питательных сред для суспензионного культивирования клеток:

- среда Купера (Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами / Под ред. А.А.Сомниной. - Ленинград. - 1975. - С.38-40),

- специальная среда для культивирования клеток ВНК-21 (Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976. С.19),

- среда Мак-Коя для суспензионного культивирования RPMI-1640 (Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. - М.: Компания Спутник, 2000. С.53-55).

В состав перечисленных питательных сред входят: неорганические соли, аминокислоты, витамины, углеводы. Из указанных аналогов наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является среда RPMI-1640 (табл.1).

Состав и количество ингредиентов основных питательных сред, используемых для суспензионного культивирования перевиваемой линии клеток почки сирийского хомячка в сравнении с патентуемой питательной средой

Табл.1
Ингредиенты гр/л Состав сред для суспензионного культивирования клеток
патентуемая среда среда Купера среда по Голубеву Д.Б. RPMI-1640
1 2 3 4 5
Соли
Натрий хлористый - (NaCl) 8,0 5,48 6,4 6,0
Калий хлористый - (КСl) 0,4 0,5 0,4 0,4
Магний сернокислый -(MgSO4⋅7H2O) 0,2 - 0,2 0,1
Магний хлористый
(MgCl2⋅6H2O) - 0,2 - -
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный -
(Na2HPO4⋅12H2O) 0,15 - 0,12 1,0
Калий фосфорнокислый
однозамещенный - (КН2РO4) 0,06 - - -
Кальций хлористый - (СаСl2) 0,14 0,2 0,2 -
Натрий двууглекислый -
(NаHCO3) 0,35 2,5 2,75 2,0
Нитрат железа
(Fe(NO3)3⋅7H2O) - - 0,0001 -
Хлорид аммония (NH4Cl) - 0,05 - -
Аминокислоты
1-аргинин НСl - 0,25 - -
1-аргинин 0,042 - 0,42 0,2
1-цистин 0,032 - 0,024 -
1-цистин 2НСl - - - 0,065
1-глютамин 0,584 0,1 0,292 0,3
глицин - - - 0,01
1-гистидин - - 0,016 -
1-изолейцин - - 0,052 0,05
1-лейцин - - 0,052 0,05
1-лизин НСl - - 0,074 0,04
1-метионин - 0,1 0,015 0,015
1-фенилаланин - - 0,033 0,015
1-серин - - - 0,03
1-треонин - - 0,048 0,02
1-тирозин 0,02 - 0,036 0,02
1-триптофан 0,015 - 0,008 0,005
1-валин - - 0,047 0,02
аспарагиновая кислота - - - 0,02
глютаминовая кислота - 063 - 0,02
1-гидроксипролин - - - 0,02
1-пролин - - 0,02
1-аспарагин Н2O - - - 0,0568
глютацин - - - 0,001
Витамины
холин-хлорид - 0,001 0,002 0,003
пантотенат кальция 3) 0,0034 0,001 0,002 0,00025
пиридоксаль⋅НСl 0,0034 - 0,002 -
пиридоксаль 5 фосфат - 0,001 -
тиамин (B1) 0,0034 0,001 0,002 0,001
мезо-инозит 0,0068 0,01 0,0036 0,035
никотинамид (B5) 0,0034 0,001 - 0,001
рибофлавин (B2) 0,00034 0,0001 0,0002 0,0002
фолиевая кислота 9) 0,0034 0,001 0,002 0,001
D-биотин - 0,001 - 0,0002
дрожжевой экстракт Дифко - 0,001 - -
Витамин В - - - 0,000005
Антибиотики
бензилпенициллина натриевая
соль (ед.) 1⋅105 - - -
канамицина сульфат (ед.) 1⋅105 - - -
амфотерицин (ед.) 2⋅103 - - -
глюкоза 3,6 6,0 4,5 2,2
гидролизат мышечных белков
ферментативный сухой
ТУ 46. 12.20-80 1,25 - - -
гидролизат лактальбумина
ферментативный
N L 0375 по кат.Sigma-
Aldridh Chemie CMBH 1,25 5,0 - -
сыворотка кр. рог. скота 70,0 100,0 - -
феноловый красный - 0,01 0,015 0,053
дистиллированная вода остальн. остальн. остальн. остальн.

В представленной таблице к существенным отличительным признакам патентуемой питательной среды относится то, что среда дополнительно содержит гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный и только пять аминокислот вместо 20 аминокислот в прототипе.

Раскрытие изобретения

(1) Сведения, раскрывающие сущность изобретения

(1.1) Сущность изобретения: подобран состав компонентов питательной среды, включающий: гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный; аминокислоты - аргинин, глутамин, тирозин, триптофан и цистин, обеспечивающий накопление клеток при суспензионном культивировании перевиваемой линии ВНК-21 до 3,5⋅106 кл./см3.

(1.2.) Техническим результатом заявляемого изобретения является создание экономически выгодной питательной среды для суспензионного культивирования клеток ВНК-21 в условиях массового биопроизводства при изготовлении культуральных вакцин.

Технический результат достигнут введением в состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов, представленных в таблице 2.

Состав и количество ингредиентов питательной среды для суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21) (патентуемая)

Табл.2
N п/п Наименование компонентов Количество (гр/л) Фирма, N серии
Соли
1 Натрий хлористый - (NaCl) 8,0 Россия 1
2 Калий хлористый - (КСl) 0,4 -“- 23
3 Магний сернокислый -
(MgSO4⋅7H2O)
0,2 -“- 9
4 Натрий фосфорнокислый
двузамещенный -
(Na2HPO4⋅12Н2О)
0,15 -“- 43
5 Калий фосфорнокислый
однозамещенный - (КН2РO4)
0,06 -“- 8
6 Кальций хлористый - (СаСl2) 0,14
7 Натрий двууглекислый -
(NaHCO3)
0,35 -“- 7
Аминокислоты
8 1-аргинин 0,042 Sigma 102K0070
9 1-глютамин 0,584 -“- 42K0889
10 1-тирозин 0,02 -“- 78H06822
11 1-триптофан 0,015 -“- 77H13631
12 1-цистин 0,032 -“- 39H1091
Витамины
13 пантотенат кальция (В3) 0,0034 -“- 57H11053
14 пиридоксаль⋅НСl 0,0034 -“- 22K16425
15 тиамин (B1) 0,0034 -“- 20K09406
16 мезо-инозит 0,0068 -“- 12K0110
17 никотинамид (B5) 0,0034 -“- 119H8057
18 рибофлавин (В2) 0,00034 -“- 97H0433
19 фолиевая кислота (В9) 0,0034 Индия
Антибиотики
20 Бензилпенициллина натриевая
соль (ед)
1⋅105 Россия 318
21 Канамицина сульфат (ед.) 1⋅105 -“- 01-02
22 Амфотерицин (ед.) 2⋅103 -“- 140601
23 глюкоза 3,6 Франция
24 гидролизат мышечных белков
ферментативный сухой
ТУ 46. 12.20-80
1,25 ФГУП ЩБК 2-02
25 гидролизат лактальбумина
ферментативный
1,25 Sigma 11K1259
26 сыворотка крупного рогатого
скота (мл)
70,0 ФГУП ЩБК 2-04
27 дистиллированная вода остальное

Осуществление изобретения

Изобретение относится к композиции, в которую входят ингредиенты в соотношениях количества граммов на 1 литр дистиллированной воды, указанных в таблице 2.

Способ получения композиции следующий: навески отдельных компонентов берут, соблюдая правила взвешивания для весов соответствующего класса. Учитывая объем приготавливаемой смеси, допускается взвешивание солей, гидролизатов, глюкозы на весах 3-го класса; навески отдельных аминокислот, витаминов и антибиотиков - на аналитических весах 2-го класса с соблюдением точности до второго знака после запятой.

Процесс приготовления питательной среды заключается в приготовлении солевой основы среды, которой является раствор Хенкса, и растворении в нем антибиотиков, солей, глюкозы, гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного по 1,25 г/л с конечной концентрацией суммы гидролизатов в питательной среде, равной 0,25%, пяти аминокислот, сыворотки, витаминов, бикарбоната натрия.

Растворение компонентов питательной среды ведут в дистиллированной воде, имеющей температуру 35-40°С, при непрерывном перемешивании. В начале растворяют антибиотики и навески солей поочередно NaCl, KCl, MgSO4 7H2O, Na2HPO4 12H2O (развести в горячей воде), KH2PO4 до полного растворения предыдущей навески, вносят навеску глюкозы 3,6 гр/л среды. Дополнительно к механическому перемешиванию осуществляют перемешивание сжатым воздухом, т.е. барботированием в течение 10 минут. После растворения навесок убирают барботирование. В глюкозо-солевой раствор осторожно тонкой струйкой при механическом перемешивании вносят хлористый кальций (CaCl2) в виде 40%-ного раствора и вновь барботируют. Из указанного в табл.2 количества гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного готовят 10%-ный раствор и вносят его в полученный глюкозо-солевой раствор и растворяют в течение 10 минут перемешиванием и барботированием.

Отдельно растворяют аминокислоты. Растворение навесок проводят последовательно согласно прописи питательной среды в таблице 2. L-цистин и l-тирозин растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании до кипения с добавлением по каплям концентрированной соляной кислоты (d=1,19) до полного просветления раствора. Сначала растворяют l-цистин, затем l-тирозин. Если при внесении l-тирозина раствор помутнел, необходимо вновь вносить по каплям концентрированную НСl, до полного растворения навески. Вместо l-цистина можно использовать l-цистин НСl и растворять l-цистин НСl просто в кипящей воде.

Все витамины, кроме рибофлавина и фолиевой кислоты, последовательно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры. При этом каждую последующую навеску растворяют только после полного растворения предыдущей. Рибофлавин и фолиевую кислоту растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры с добавлением по каплям 20%-ного раствора NaOH до полного растворения навесок. Сначала растворяют рибофлавин, затем фолиевую кислоту, при растворении которой необходимо вновь по каплям вносить 20%-ный р-р NaOH до полного просветления раствора.

В глюкозо-солевой раствор вносят растворы аминокислот, витаминов, сыворотку, натрий двууглекислый и перемешивают. После внесения в среду всех необходимых компонентов добавляют дистиллированную воду до необходимого объема, перемешивают, стерилизуют фильтрацией в реактор для культивирования клеток.

Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, содержащая натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистин, пантотенат кальция, пиридоксаль НСl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, сыворотку крупного рогатого скота, амфотерицин, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат и дистиллированную воду, при следующем содержании компонентов, г/л:

натрий хлористый 8,0
калий хлористый 0,4
магний сернокислый 0,2
натрий фосфорнокислый
двузамещенный 0,15
калий фосфорнокислый
однозамещенный 0,06
кальций хлористый 0,14
натрий двууглекислый 0,35
L-аргинин 0,042
L-глутамин 0,584
L-тирозин 0,02
L-триптофан 0,015
L-цистин 0,032
пантотенат кальция 0,0034
пиридоксаль НСl 0,0034
тиамин 0,0034
мезо-инозит 0,0068
никотинамид 0,0034
рибофлавин 0,00034
фолиевая кислота 0,0034
глюкоза 3,6
ферментативный гидролизат
мышечных белков 1,25
ферментативный
гидролизат лактальбумина 1,25
сыворотка крупного рогатого скота 70,0 мл
амфотерицин 2⋅103 ед.
бензилпеницилина
натриевая соль 1⋅105 ед.
канамицина сульфат 1⋅105 ед.
дистиллированная вода остальное



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ изготовления жидких стерильных питательных сред.

Изобретение относится к области эмбриологии. Способ получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток, которые представляют собой человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н9, H1, Н7 и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002, включает стадии: культивирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток; дифференцирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы; дифференцирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки; дифференцирования популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки и дифференцирования популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования популяции клеток задней части передней кишки в среде с добавлением ингибитора CYP26A без добавления ретиноевой кислоты.

Изобретение относится к полимерным гелям и способам их получения, а именно к макропористым носителям на основе желатина, которое может быть использовано в биотехнологии, клеточной технологии и тканевой инженерии.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ снижения накопления лактата от 5% до 40% при культивировании клеток млекопитающих и способ получения антитела.

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии, клеточной биологии и связано с применением экстракта лиофильно высушенной медицинской пиявки в качестве компонента питательной среды для культивирования клеток млекопитающих.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего, а также к применению клеток, полученных данным способом.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в регенеративной медицине. Выделяют взвесь неадгезирующих мононуклеаров клеток из ткани поджелудочной железы при сахарном диабете, в полученной взвеси оценивают количество мультипотентных прогениторных клеток, олигопотентных прогениторных клеток и инсулин-продуцирующих β-клеток.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ имплантации биологического материала в организм с использованием композиции, содержащей коллаген.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиции среды для омолаживания мезенхимальных стволовых клеток пожилого субъекта, содержащей FBS (фетальную сыворотку теленка), 0,5-1 нг/мл селена, 10-50 нг/мл EGF (эпидермальный фактор роста), 1-100 нг/мл bFGF (основной фактор роста фибробластов) и NAC (N-ацетил-L-цистеин).

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ получения постоянной линии клеток-амниоцитов человека, включающий трансфекцию зародышевых клеток-амниоцитов человека молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую продукты генов аденовирусов Е1А и Е1В, причем указанную последовательность нуклеиновой кислоты получают из серотипа 5 аденовируса человека, и последующую трансфекцию постоянной линии клеток-амниоцитов человека, полученной на первом этапе, молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую большой SV40 Т-антиген.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен микрофлюидный чип и способ для культивирования клеток или клеточной модели в данном микрофлюидном чипе. Микрофлюидный чип включает микрофлюидные каналы с клапанами для перекрытия каналов, ячейку для культивирования, рабочую камеру с мембраной и средство создания постоянного давления в замкнутом контуре циркуляции. Причём мембрана выполнена с возможностью изменения объема рабочей камеры. Рабочая камера, клапаны и входная часть ячейки соединены микрофлюидными каналами с образованием замкнутого контура циркуляции питательной среды. Рабочая камера с клапанами и микрофлюидными каналами представляет собой насос-маршрутизатор. Способ включает заполнение микрофлюидных каналов и ячейки питательной средой, размещение вставки с клетками или клеточной моделью в ячейке культивирования. При этом в контуре циркуляции создают постоянное давление и пульсирующее течение питательной среды. Изобретения обеспечивают возможность моделирования в микрофлюидном чипе гидродинамическую составляющую микроциркуляции in vivo, а также моделирования системного ответа организма. 2 н. и 37 з.п. ф-лы, 15 ил.

Группа изобретений относится к области биохимии, включает устройство и систему для культивирования клеток, а также способ культивирования клеток с использованием вышеуказанного устройства и системы (варианты). Устройство включает сферический трехмерный корпус с множеством двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части трехмерного корпуса. Система содержит контейнер и группу сферических трехмерных корпусов, помещенных в контейнер. При этом трехмерный корпус имеет максимальный пространственный размер в диапазоне от 1 мм до 50 мм или отношение площади поверхности к объему между 3 см2/см3 и 1000 см2/см3. Способ включает выбор группы эукариотических клеток и введение эукариотических клеток в контакт с трехмерным корпусом. Изобретения обеспечивают двухмерный рост эукариотических клеток. 4 н. и 32 з.п. ф-лы, 24 ил., 3 пр.
Наверх