Тест-система для определения рнк интерферона λ, интерлейкина il23 и противовирусного белка mxa

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-система для мультиплексного количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 на основе обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени, включающая специфические праймеры и соответствующие им флуоресцентные гидролизуемые зонды, а также отрицательный и положительные контрольные образцы. Изобретение позволяет проводить детекцию, идентификацию и количественные оценки уровней транскрипции РНК указанных генов с высокой чувствительностью, специфичностью и возможностью мультиплексного анализа, позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика и ускорить процедуру, а также может успешно применяться при контроле лечения и прогнозирования течения инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека. 2 табл., 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для определения и количественных оценок РНК интерферона λ, интерлейкина 23 и противовирусного белка МхА.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих в регуляции нормальных физиологических реакций и защитных реакций организма от патогенов или при нарушении целостности тканей. Цитокины могут быть выделены в самостоятельную систему регуляции и поддержания гомеостаза наряду с нервной и эндокринной системами, причем все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы. В настоящее время известно более 200 индивидуальных веществ, относящихся к семейству цитокинов (Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность. Клиническая лабораторная диагностика, 1998, 1, с. 21-32; Awasthi and Kuchroo, 2011). К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы (КСФ), хемокины, трансформирующие ростовые факторы; фактор некроза опухолей; интерлейкины со сложившимися исторически порядковыми номерами и некоторые другие эндогенные медиаторы. Интерлейкины, имеющие порядковые номера, начиная с 1, не относятся к одной подгруппе цитокинов, связанных общностью функций. Они могут быть разделены на провоспалительные и противовоспалительные цитокины, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, отдельные регуляторные цитокины.

Интерфероны (EFN) были первыми из известных цитокинов. IFN видоспецифичны и обладают антивирусными, антипролиферативными, иммунорегуляторными и гормоноподобными свойствами посредством регуляции экспрессии клеточных генов (Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. М., Медицина, 1996; Vilcek J. а. Sen G.C. Interferons and other cytokines. In "Fundamental Virology", p. 341-345, New-York, 1996). К IFN-зависимым относятся гены 2-5'-олигоаденилатсинтетазы (2-5-OAС), рибонуклеазы L (РНК-аза L) и двухспиральной РНК протеинкиназы (дсПК) (Sen G.C. а. Lengyel P., The interferonsystem. A birds eye view of its biochemistry. J. Biol. Chem., V. 267, p. 5017-5020, 1992; Lengyel P. Tumor-suppressor genes; News about the interferon connections. Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 90, p. 5893-5895, 1993).

Три основных типа IFN I, II и III определяются специфическими рецепторами. У интерферонов типа I один общий рецептор IFN-alpha (IFNAR), состоящий из альфа-субъединиц (IFNAR1, IFNAR2). У млекопитающих к этому типу относятся следующие основные виды интерферонов: альфа, бета, омега, эпсилон, каппа и тау. Для интерферонов типа II характерен рецептор IFNGR1, IFNGR2. Интерфероны типа III - интерфероны лямбда, соответствующий рецептор - IFNLR1, IL10R2.

Интерфероны (IFN) λ были открыты в 2003 г. Первоначально они были отнесены к интерлейкинам и определены как ИЛ-29 (теперь IFN-λ1), ИЛ-28А (теперь EFN-λ2) и EL-28В (теперь IFN-λ3). Позднее была открыта четвертая форма - EFN-λ4, которая экспрессируется в небольшом количестве и определена как результат сдвига рамки считывания в гене IFN λ3. В силу особенностей структуры и наличия собственного рецептора IFN-λ, выделены в самостоятельный, третий (III) тип интерферонов. Несмотря на то, что IFN-α и λ связываются с различными рецепторами, они запускают один и тот же каскад реакций фосфорилирования Jak-STAT и модулируют активность одной и той же группы IFN-стимулируемых генов (ISGs), что приводит к сходному ответу клеток. Класс IFN λ в организме не является «избыточным» по отношению к IFN α, поскольку они имеют и разную тканеспецифичность, и разное отношение к различным видам вирусов. IFN III класса обеспечивают защиту кожи, легких и желудочно-кишечного тракта от действия вирусов. После связывания IFN с клеточным рецептором происходит активация реакций фосфорилирования с участием протеинкиназ. Каскад фосфорилирования приводит к активации множества белковых факторов, в частности факторов транскрипции STAT. Активированные факторы транскрипции перемещаются в ядро, где регулируют транскрипцию генов, связанных с синтезом белков. Помимо этого IFN активируют сотни ISG генов. При активации белка р53 происходит индукция апоптоза инфицированных клеток. Вторым направлением действия интерферонов является стимуляция клеток иммунной системы. В частности, интерфероны повышают синтез молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I и II классов и активируют иммунопротеасому, которая осуществляет процессинг вирусных пептидов. Высокий уровень молекул ГКГС II класса обеспечивает презентацию вирусных антигенов Т-хелперам, которые выделяют цитокины, координирующие активность других клеток иммунной системы. Некоторые виды интерферонов способны и непосредственно стимулировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Индукция разнонаправленных биохимических реакций под действием IFN повышает риск непредсказуемых побочных эффектов со стороны центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, желудочно-кишечного тракта, органов кроветворения и органов чувств. В частности, со стороны органов чувств могут развиваться ишемическая ретинопатия, паралич нервов, значительное нарушение зрения. Со стороны кожи возможны крапивница, зуд, жжение, сухость, фурункулез, а также различные сыпи кожного покрова. Отмечены случаи неврологических и психопатологических нарушений, в том числе IFN-индуцированные депрессии. Поэтому необходим количественный анализ IFN III типа при индивидуальном подходе к лечению инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Одним из ISG, индуцируемым только IFN I типа, является ген МХ1, который кодирует противовирусный белок Myxovirus resistance protein (МхА) массой 76 кДа суперсемейства гуанозинтрифосфатаз (GTPase). МхА узнает и захватывает нуклеокапсид-подобные структуры вирусов после их проникновения в клетки хозяина, ингибируя репликацию вирусных геномов (Trinchieri, 2010). Белок МхА обеспечивает противовирусную защиту от разнообразных вирусов, включая вирусы гриппа, парагриппа, кори, вируса Коксаки и вируса гепатита В. Вирусы ингибируются белком МхА на ранней стадии жизненного цикла после проникновения в клетку организма-хозяина и перед амплификацией вирусного генома. МхА обнаруживает вирусы, опознавая и захватывая нуклеокапсидподобные структуры. Анализ экспрессии гена МХ1 может служить маркером дифференциации вирусных от бактериальных инфекций и свидетельством биодоступности интерферонов I типа. Исследование системы IFN и индуцируемых ими генов необходимо для персонализированной профилактики и терапии.

Интерлейкин 23 был выявлен при сканировании генома с целью поиска цитокинов семейства IL-6/IL-12. Белок DL-23 представляет собой гетеродимер, содержащий ту же субъединицу р40, что и IL-12, но в отличие от IL-12 содержащий субъединицу р19, специфичную только для IL-23. IL-23 использует многие компоненты сигнальной трансдукции IL-12: он связывается с рецептором IL-12Rβ1, но не с IL-12Rβ2. IL-23 играет роль в поляризации по первому типу Т-клеток иммунного ответа. Хотя IL-12 сильно активирует наивные Т-клетки, в первоначальном описании IL-23 говорилось о предпочтительном действии на Т-клетки памяти для усиления продукции IFNγ и пролиферации, подтверждая важную роль IL-23 в контроле бактериальных инфекций. Кроме того было показано, что IL-23 является ключевым цитокином контроля процесса воспаления в периферических тканях. Гиперэкспрессия р19 коррелирует с воспалением во многих органах и эпителиальных тканях, включая кожу. Показано, что IL-23 участвует в воспалительных процессах в нервной системе и при аутоиммунных заболеваниях. Известны коммерческие наборы, основанные на иммуноферментном анализе, в частности: для определения IL23 с набором "eBioscience" (Германия) (кат. номер BMS2023); IFN-λ1 (TL29) («BenderMedSystems», Австрия) и белка МхА (BioVendor, Чехия-Германия-Австрия-Словакия (https://www.biovendor.com), кат. номер RD194349200R). Однако эти наборы имеют ограниченную чувствительность (не более 10 пг/мл) и специфичность из-за возможных перекрестных реакций. Необходима разработка тест-системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, для детекции и количественных оценок РНК IFNλ, IL23 и МхА.

Как известно, наиболее чувствительным и специфичным методом детекции специфических РНК является ОТ-ПЦР с флуоресцентными зондами в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). В отличие от используемых ранее иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализа с возможными перекрестными серологическими реакциями и пределом чувствительности 10 пг целевого продукта или аналита, соответствующим 10⁵-10⁶ молекул в зависимости от молекулярного веса, и ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов реакции, позволяющей применять праймеры с несколькими нуклеотидными заменами по сравнению с матричными нуклеиновыми кислотами и порогом чувствительности, не превышающим десятки геном-эквивалентов в реакционной смеси, ОТ-ПЦР-РВ позволяет выявлять единичные копии в реакционных смесях с высокой специфичностью, определяемой зондом. Для определения РНК разных цитокинов применяют качественные и количественные варианты ОТ-ПЦР (Oka М., Hirose К., Ilzuka N. et. al. Cytokine mRNA expression patterns in human esophageal cancer cell lines. J. Interferon and Cytokine Res., V. 15, p. 1005-1009, 1995; Platzer C., Blankenstein T. Polymerase chain reaction to quantitate cytokine mRNA. In: Cytokines. A practical approch. Ed. F.R. Barkwill. IRL Press, Ox-ford, N-Y, Tokyo, 1995). Известны изобретения, описывающие несколько вариантов ОТ-ПЦР для определения РНК в разных видах клеток и тканей (Klotman Р.Е. et. al., патент США 5543509, 6 авг. 1996; Pardee et. al., патент США 5665547, 9 сент. 1997; Banker et. al., патент США 5643730, 1 июля 1997; Sutcliffe et. al., патент США 5807680, 15 сент. 1998).

В настоящее время не известны тест-системы, основанные на детекции специфических РНК с помощью ОТ-ПЦР-РВ с флуоресцентными зондами для выявления и количественных оценок РНК интерферона λ, интерлейкина IL23 и противовирусного белка МхА. Таким образом, актуальность новой тест-системы по определению РНК интерферона лямбда, интерлейкина 23 и противовирусного белка МхА обусловлена их вышеперечисленными свойствами и отсутствием аналогичных коммерческих тест-систем.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сущность настоящего изобретения заключается в создании тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ для мультиплексного анализа и количественных оценок экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 с одновременной детекцией флуоресценции гидролизуемых зондов по разным каналам.

Предлагаемая тест-система для определения РНК IFNλ, IL23 и МхА включает специфические праймеры и флуоресцентные зонды, соответствующие экзонам соответствующих генов, для определения только мРНК в присутствии следовых количеств геномной ДНК человека в составе выделяемых суммарных нуклеиновых кислот, а также отрицательный и положительные контрольные образцы. Положительные контрольные образцы представляют очищенные гель-фильтрацией на сефадексе G-50 продукты ПЦР с 3 парами праймеров, структуры которых приведены в таблице 1, с известной концентрацией, определенной спектрофотометрически при длине волны 260 нм.

Для настоящего изобретения были разработаны специфические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные гидролизуемые зонды с 5'-концевыми флуорофорами на основе родамина и цианина и внутренними тушителями флуоресценции (black hole quencher (BHQ)), выбранными на основании множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей соответствующих мРНК из базы GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) с использованием программного обеспечения VectorNTI, DNAStar и анализа выбранных праймеров с применением комплекса программ www.idtdna.com. Выбор специфических праймеров, соответствующих экзонам генов, для определения только РНК в присутствии следовых количеств геномной ДНК человека в составе выделяемых суммарных нуклеиновых кислот необходим для корректного определения РНК IFNλ, IL23 и противовирусного белка МхА в норме и при патологии, в мониторинге терапии для подтверждения эффективности проводимого лечения.

Ниже приведены предлагаемые нуклеотидные последовательности праймеров (Таблица 1) и флуоресцентных зондов (Таблица 2), соответствующие мРНК интерферона λ, противовирусного белка МхА, цитокина IL23.

Также оптимизированы условия выделения РНК из клеток и сывороток крови, из индуцированных мокрот больных бронхиальной астмой и смывов больных респираторными инфекциями. Сравнение различных методов выделения РНК показало преимущества лизиса в концентрированных растворах гуанидинизотицианата с последующим спиртовым осаждением по скорости процесса, выходу и стабильности РНК.

Разработаны оптимальные условия обратной транскрипции с использованием суммарных РНК из различных клинических образцов. Для повышения предела чувствительности тест-системы необходима обратная транскрипция в следующем режиме: 37°С 30 мин, 40°С 15 мин, 42°С 15 мин с необходимой последующей инактивацией фермента при 95°С в течение 3 мин.

Оптимизированы условия ПНР, такие как состав буфера, концентрация солей Mg²⁺ (рабочий диапазон от 4 до 5 мМ), температура отжига праймеров и зондов (60-62°С), временной режим амплификации (94°С - 10 сек, 60-62°С - 20 сек, 72°С - 30 сек, 55 циклов).

В качестве отрицательного контроля применяли деионизованную воду. В качестве положительных контрольных образцов использовали продукты ОТ-ПЦР, предварительно очищенные гель-фильтрацией на сефадексе G-50, концентрации которых определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 с (Thermo Scientific, США) при длине волны 260 нм.

После оптимизации всех этапов анализа тест-система апробирована на клинических образцах, взятых у 18 больных рассеянным склерозом, 28 больных бронхиальной астмой в сочетании с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), 17 пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями, 23 практически здоровых человека.

После выделения нуклеиновых кислот, например, из лимфоцитов, мокроты и других биологических жидкостей, РНК противовирусного белка МхА, РНК интерферона TFNX и РНК интерлейкина 23 детектировали методом обратной транскрипции с ревертазой ретровирусов грызунов (MMLV) и случайными олигодезоксирибонуклеотидами длиной 7 нуклеотидных остатков производства «АмплиСенс» (Россия) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) со специфическими праймерами и флуоресцентными зондами, выбранными на основании множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей соответствующих мРНК и синтезированными в «Синтол» (Россия).

Техническим результатом настоящего изобретения является создание мультиплексной тест-системы для определения РНК интерферона λ, интерлейкина IL23 и противовирусного белка МхА, которая позволяет проводить детекцию, идентификацию и количественные оценки уровней транскрипции их РНК с высокой чувствительностью (десятки копий РНК в реакционной смеси), специфичностью и возможностью мультиплексного анализа. Предлагаемая мультиплексная ПЦР в реальном времени позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика, а также ускорить процедуру.

Примеры применения тест-системы

Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не исчерпывают все возможные области применения тест-системы для определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в различных клинических образцах, включая клетки и плазму крови, мокроту, носоглоточные смывы и др. биологические жидкости при инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваниях.

Пример 1. Определение РНК IFNλ, IL23 и МхА в образцах индуцированной мокроты больных бронхиальной астмой (БА)

Проведено обследование 28 пациентов с фенотипом БА-ХОБЛ вне обострения, средней возрастной группы (57,22±10,5 лет) с длительностью заболевания более 10 лет. На основании клинической картины заболевания, показателей функции внешнего дыхания и объема терапии определяли тяжесть течения заболевания по GINA (пересмотр 2006 г.) и GOLD (пересмотр 2008 г.). Независимо от тяжести БА больным с фенотипом БА-ХОБЛ в качестве базисной терапии назначали комбинацию ингаляционных глюкокортйкостероидов и длительно действующих β2-агонистов. Из 50,0 мкл индуцированной мокроты выделены нуклеиновые кислоты с применением набора «Проба-НК» (производства «ДНК-технология», Москва). После выделения нуклеиновых кислот из 50,0 мкл образцов мокроты РНК IFNλ, и МхА детектировали посредством обратной транскрипции с использованием набора "Reverta-L" ("АмплиСенс", Москва) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с праймерами и флуоресцентными зондами, соответствующими этим генам человека и TaqF ДНК-полимеразой ("АмплиСенс", Москва):

IFNλ

IFN λ-F

5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

IFN λ-R

5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

IFN λ-Z

5'-ROX-GAGGCTGAGCTGGCCCTGACGC-3'

IL 23

IL23-F

5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

IL23-R

5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

IL23-Z

5'-Cy5-TATCCGATCCTAGCAGCTTCTCATA-3'

MxA

MxA-F

5'-GATGCTACTGTGGCCCAG-3'

MXA-R

5'-GAGTCAATGAGGTCGATG-3'

MXA-Z

5'-R6G-GCA CCT TCT CCT CAT ACT GGC TGC -3'

В следующих условиях:

94°С - 10 сек

60°С - 20 сек

72°С - 30 сек

55 циклов

Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием отрицательного и положительных контрольных образцов.

К 5'-концам зондов присоединены флуорофоры R6G, Rox и Су5, при гидролизе фосфодиэфирной связи освобождающиеся в раствор с разгоранием флуоресценции в зависимости от количеств исходных РНК и кДНК и регистрируемые по разным каналам с максимумами испускания (эмиссии) при 550, 602 и 670 нм соответственно.

РНК IFNλ выявлена в 42,9% образцах мокроты в количествах 10⁶-10⁹ молекул РНК в 1 мл мокроты. IL23 у больных БА-ХОБЛ не определяли, т.к. при легочных патологиях БА и ХОБЛ важно выявление экспрессии генов BFNX и противовирусного белка МхА. РНК противовирусного белка МхА детектировали в 28,6±8,7% образцов (10¹-10² копий РНК в 1 мл мокроты), что могло определять устойчивость к вирусу гриппа и некоторым вирусам с одноцепочечной геномной РНК отрицательной полярности, включая респираторно-синцитиальный вирус.

Вывод: разработанная тест-система для количественного определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в мокротах больных с диагнозом БА-ХОБЛ необходима для определения их иммунного статуса, поскольку симптомы БА могут усиливаться под влиянием вирусных инфекций, аллергенов, курения, физических нагрузок и стресса.

Пример 2. Анализ экспрессии генов IFN λ, IL23 и МхА в лимфоцитах крови больных аутоиммунным заболеванием - рассеянным склерозом (PC)

Образцы крови получены от 18 человек с диагнозом PC согласно обновленным диагностическим критериям MacDonald et al. в модификации 2010 г., в основном с ремиттирующим типом течения (14 пациентов) и вторично-прогрессирующим течением (4 пациента). Пациенты среднего возраста (35,72±9,46 лет), 16 женщин и 2 мужчин, с длительностью болезни (7,22±4,10 лет). Результаты объективного неврологического обследования оценивались по общепринятой шкале клинической оценки функционального состояния проводящих систем при этом заболевании, предложенной J. Kurtzke и шкале инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale). Показатель EDSS перед исследованием составил 2,69±1,22 балла.

Из 3 мл венозной крови с К₃EDTA выделяли лимфоциты с использованием фиколл-верографина. Из лимфоцитов выделены нуклеиновые кислоты с применением набора «Проба-НК» (производства «ДНК-технология», Москва). После выделения нуклеиновых кислот экспрессию генов IFNλ, IL23 и МхА детектировали посредством обратной транскрипции с использованием набора "Reverta-L" ("АмплиСенс", Москва) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с праймерами и флуоресцентными зондами, соответствующими этим генам человека и TaqF ДНК-полимеразой:

IFNλ

TFN λ-F

5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

IFN λ-R

5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

IFN λ-Z

5'-ROX-GAGGCTGAGCTGGCCCTGACGC-3'

IL 23

IL23-F

5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

IL23-R

5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

IL23-Z

5'-Cy5-TATCCGATCCTAGCAGCTTCTCATA-3'

MxA

MxA-F

5'-GATGCTACTGTGGCCCAG -3'

MXA-R

5'-GAGTCAATGAGGTCGATG -3'

MXA-Z

5'-R6G-GCACCTTCTCCTCATACTGGCTGC-3'

В следующих условиях:

94°С - 10 сек

60°С - 20 сек

72°С - 30 сек

55 циклов

Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием отрицательного и положительных контрольных образцов.

К 5'-концам зондов присоединены флуорофоры R6G, ROX и Су5, при гидролизе фосфодиэфирных связей освобождающиеся в раствор с разгоранием флуоресценции в зависимости от количеств исходных РНК и кДНК и регистрируемые по разным каналам с максимумами эмиссии при 550, 602 и 670 нм соответственно.

Анализ мРНК в лимфоцитах крови больных PC показал достоверно повышенные количества для EFN λ и EL23 по сравнению с контрольной группой доноров. В результате лечения пациентов препаратом «IFNβ 1а» более 6 месяцев содержание мРНК IL23 уменьшалось, что коррелировало со стабилизацией неврологического состояния. Для TFNX снижения не обнаружено. Для экспрессии гена МхА были характерны разнонаправленные флуктуации, что может свидетельствовать о независимости транскрипции этого гена от экзогенного рекомбинантного IFNβ.

Вывод: разработанная тест-система определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в лимфоцитах больных позволяет оценить неспецифическую резистентность и прогнозировать течение аутоиммунных заболеваний.

Пример 3. Детекция и количественные оценки РНК IFNλ, IL23 и МхА в носоглоточных смывах больных респираторными инфекциями

Смывы из носоглотки 17 пациентов с подтвержденными диагнозами в ОТ-ПЦР-РВ (10 больных 18-33 лет с диагнозом грипп) и ОРВИ (7 больных 18-44 лет). Группу сравнения составили 15 практически здоровых человек в возрасте 25-60 лет. Для определения диагноза ОРВИ проводили ОТ-ПЦР-РВ с использованием набора «ОРВИ-АмплиСенс» ("АмплиСенс", Москва). Из 50,0 мкл смывов выделены нуклеиновые кислоты с применением набора «Проба-НК» (производства «ДНК-технология», Москва). После выделения нуклеиновых кислот из 50,0 мкл образцов смывов РНК IFNλ, IL23 и МхА детектировали посредством обратной транскрипции с использованием набора "Reverta-L" ("АмплиСенс", Москва) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с праймерами и флуоресцентными зондами, соответствующими этим генам человека и TaqF ДНК-полимеразой:

IFNλ

IFN λ-F

5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

IFN λ-R

5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

IFN λ-Z

5'-ROX-GAGGCTGAGCTGGCCCTGACGC-3'

IL23

IL23-F

5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

IL23-R

5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

IL23-Z

5'-Cy5-TATCCGATCCTAGCAGCTTCTCATA-3'

MxA

MxA-F

5'-GATGCTACTGTGGCCCAG-3'

MXA-R

5'-GAGTCAATGAGGTCGATG-3'

MXA-Z

5'-R6G-GCACCTTCTCCTCATACTGGCTGC-3'

В следующих условиях:

94°С - 10 сек

60°С - 20 сек

72°С - 30 сек

55 циклов

Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием отрицательного и положительных контрольных образцов.

К 5'-концам зондов присоединены флуорофоры R6G, ROX и Су5, при гидролизе фосфодиэфирной связи освобождающиеся в раствор с разгоранием флуоресценции в зависимости от количеств исходных РНК и кДНК и регистрируемые по разным каналам с максимумами испускания (эмиссии) при 550, 602 и 670 нм соответственно.

Высокие частоты (80-100%) и уровни экспрессии генов IFNλ, IL23 и МхА у больных ОРВИ и здоровых не отличались. Высокие уровни РНК МХА в клетках слизистой свидетельствовали о биодосгупности IFN I типа в этих клетках, о преимущественно вирусных инфекциях без ассоциаций с бактериями и не обеспечивали полного ингибирования репликации респираторных вирусов на ранней стадии инфекции.

Вывод: выявлены РНК IFN λ, IL23 и МхА в смывах со слизистой носоглотки. Предложенная тест-система определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в смывах носоглотки больных позволяет выявлять врожденную доиммунную резистентность и последующее развитие специфического иммунитета.

Таким образом, разработана и апробирована тест-система определения мРНК IFNλ, IL23 и противовирусного белка МхА, которая характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Настоящее изобретение может быть использовано для мультиплексного анализа. Предлагаемая тест-система для определения РНК IFNλ, IL23 и МхА путем обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени основана на применении специфических праймеров и флуоресцентных зондов, выбранных на основании множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей соответствующих мРНК. Заявляемая тест-система позволяет не только качественно определять наличие мРНК интерферона λ, IL23 и МхА, но и проводить количественные оценки, необходимые для определения иммунологического статуса пациентов в норме и при патологии, контроля лечения и прогнозирования инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний. Возможно применение этой тест-системы в диагностике инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека.

Особенно актуальна в следующих направлениях:

1. Детекция РНК интерферона λ, интерлейкина IL23 и противовирусного белка МхА в лимфоцитах и сыворотках крови людей с первичными или вторичными иммунодефицитами.

2. Количественные оценки уровней экспрессии генов интерферонов, интерлейкинов и противовирусных белков при инфекционных заболеваниях человека.

3. Контроль за процессом лечения инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний человека.

Заявленное изобретение позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика, а также ускорить процедуру.

Список литературы

1. Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность. Клиническая лабораторная диагностика, 1, 1998, с. 21-32.

2. Awasthi A. and Kuchroo V.K. "From ТН1/ТН2 Paradigm to TH17 Cells: Le Roi Est Mort, Vive Le Roi"In: Th17 Cells in Health and Disease. Springer New York - Dordrecht - Heidelberg - London, 2011.

3. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. М., Медицина, 1996.

4. Vilcek J. a. Sen G.C. Interferons and other cytokines. In "Fundamental Virology", p. 341-345, New-York, 1996.

5. Sen G.C. a. Lengyel P. The interferonsystem. A birds eye view of its biochemistry. J. Biol. Chem. V. 267, p. 5017-5020, 1992.

6. Lengyel P. Tumor-suppressor genes; News about the interferon connections. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.90, p. 5893-5895, 1993.

7. de Weerd, et al. (2007) J Biol Chem. 2007; 282 (28), 20053-20057

8. Taira et al. (2005) J. Vet. Med. Sci. 67 (10), 1059-1062.

9. Trinchieri, G. Type I interferon: friend or foe? / G. Trinchieri // J. Exp. Med. - 2010. - 207. - P. 2053-2063.

Тест-система для мультиплексного количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 на основе обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени, включающая специфические праймеры и флуоресцентные гидролизуемые зонды

для определения РНК интерферона λ:

прямой праймер (F-IFNλ) (длиной 18 н.о.) 5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

обратный праймер (R-IFNλ) (длиной 18 н.о.) 5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

зонд (Z-IFNλ) (длиной 22 н.о.) 5'-ROX-GAGGCTGAGCT(BHQ2)GGCCCTGACGC-3',

для определения РНК противовирусного белка МхА:

прямой праймер F-МхА (длиной 18 н.о.) 5'-GATGCTACTGTGGCCCAG-3'

обратный праймер R-МхА (длиной 18 н.о.) 5'-GAGTCAATGAGGTCGATG-3'

зонд Z-MxA (длиной 24 н.о.) 5'-R6G-GCACCTTCT(BHQ1)CCTCATACTGGCTGC-3',

для определения РНК интерлейкина 23:

прямой праймер F-IL23 (длиной 18 н.о.) 5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

обратный праймер R-IL23 (длиной 17 н.о.) 5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

зонд Z-IL23 (длиной 25 н.о.) 5'-Sy5-TATCCGATCCT(BHQ2)AGCAGCTTCTCATA-3',

в качестве отрицательного контроля - деионизованную воду,

в качестве положительных контрольных образцов - очищенные с помощью гель-хроматографии продукты ОТ-ПЦР определенных концентраций.