Тест-система для определения рнк интерферона λ, интерлейкина il23 и противовирусного белка mxa

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-система для мультиплексного количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 на основе обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени, включающая специфические праймеры и соответствующие им флуоресцентные гидролизуемые зонды, а также отрицательный и положительные контрольные образцы. Изобретение позволяет проводить детекцию, идентификацию и количественные оценки уровней транскрипции РНК указанных генов с высокой чувствительностью, специфичностью и возможностью мультиплексного анализа, позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика и ускорить процедуру, а также может успешно применяться при контроле лечения и прогнозирования течения инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека. 2 табл., 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для определения и количественных оценок РНК интерферона λ, интерлейкина 23 и противовирусного белка МхА.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих в регуляции нормальных физиологических реакций и защитных реакций организма от патогенов или при нарушении целостности тканей. Цитокины могут быть выделены в самостоятельную систему регуляции и поддержания гомеостаза наряду с нервной и эндокринной системами, причем все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы. В настоящее время известно более 200 индивидуальных веществ, относящихся к семейству цитокинов (Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность. Клиническая лабораторная диагностика, 1998, 1, с. 21-32; Awasthi and Kuchroo, 2011). К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы (КСФ), хемокины, трансформирующие ростовые факторы; фактор некроза опухолей; интерлейкины со сложившимися исторически порядковыми номерами и некоторые другие эндогенные медиаторы. Интерлейкины, имеющие порядковые номера, начиная с 1, не относятся к одной подгруппе цитокинов, связанных общностью функций. Они могут быть разделены на провоспалительные и противовоспалительные цитокины, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, отдельные регуляторные цитокины.

Интерфероны (EFN) были первыми из известных цитокинов. IFN видоспецифичны и обладают антивирусными, антипролиферативными, иммунорегуляторными и гормоноподобными свойствами посредством регуляции экспрессии клеточных генов (Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. М., Медицина, 1996; Vilcek J. а. Sen G.C. Interferons and other cytokines. In "Fundamental Virology", p. 341-345, New-York, 1996). К IFN-зависимым относятся гены 2-5'-олигоаденилатсинтетазы (2-5-OAС), рибонуклеазы L (РНК-аза L) и двухспиральной РНК протеинкиназы (дсПК) (Sen G.C. а. Lengyel P., The interferonsystem. A birds eye view of its biochemistry. J. Biol. Chem., V. 267, p. 5017-5020, 1992; Lengyel P. Tumor-suppressor genes; News about the interferon connections. Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 90, p. 5893-5895, 1993).

Три основных типа IFN I, II и III определяются специфическими рецепторами. У интерферонов типа I один общий рецептор IFN-alpha (IFNAR), состоящий из альфа-субъединиц (IFNAR1, IFNAR2). У млекопитающих к этому типу относятся следующие основные виды интерферонов: альфа, бета, омега, эпсилон, каппа и тау. Для интерферонов типа II характерен рецептор IFNGR1, IFNGR2. Интерфероны типа III - интерфероны лямбда, соответствующий рецептор - IFNLR1, IL10R2.

Интерфероны (IFN) λ были открыты в 2003 г. Первоначально они были отнесены к интерлейкинам и определены как ИЛ-29 (теперь IFN-λ1), ИЛ-28А (теперь EFN-λ2) и EL-28В (теперь IFN-λ3). Позднее была открыта четвертая форма - EFN-λ4, которая экспрессируется в небольшом количестве и определена как результат сдвига рамки считывания в гене IFN λ3. В силу особенностей структуры и наличия собственного рецептора IFN-λ, выделены в самостоятельный, третий (III) тип интерферонов. Несмотря на то, что IFN-α и λ связываются с различными рецепторами, они запускают один и тот же каскад реакций фосфорилирования Jak-STAT и модулируют активность одной и той же группы IFN-стимулируемых генов (ISGs), что приводит к сходному ответу клеток. Класс IFN λ в организме не является «избыточным» по отношению к IFN α, поскольку они имеют и разную тканеспецифичность, и разное отношение к различным видам вирусов. IFN III класса обеспечивают защиту кожи, легких и желудочно-кишечного тракта от действия вирусов. После связывания IFN с клеточным рецептором происходит активация реакций фосфорилирования с участием протеинкиназ. Каскад фосфорилирования приводит к активации множества белковых факторов, в частности факторов транскрипции STAT. Активированные факторы транскрипции перемещаются в ядро, где регулируют транскрипцию генов, связанных с синтезом белков. Помимо этого IFN активируют сотни ISG генов. При активации белка р53 происходит индукция апоптоза инфицированных клеток. Вторым направлением действия интерферонов является стимуляция клеток иммунной системы. В частности, интерфероны повышают синтез молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I и II классов и активируют иммунопротеасому, которая осуществляет процессинг вирусных пептидов. Высокий уровень молекул ГКГС II класса обеспечивает презентацию вирусных антигенов Т-хелперам, которые выделяют цитокины, координирующие активность других клеток иммунной системы. Некоторые виды интерферонов способны и непосредственно стимулировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Индукция разнонаправленных биохимических реакций под действием IFN повышает риск непредсказуемых побочных эффектов со стороны центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, желудочно-кишечного тракта, органов кроветворения и органов чувств. В частности, со стороны органов чувств могут развиваться ишемическая ретинопатия, паралич нервов, значительное нарушение зрения. Со стороны кожи возможны крапивница, зуд, жжение, сухость, фурункулез, а также различные сыпи кожного покрова. Отмечены случаи неврологических и психопатологических нарушений, в том числе IFN-индуцированные депрессии. Поэтому необходим количественный анализ IFN III типа при индивидуальном подходе к лечению инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Одним из ISG, индуцируемым только IFN I типа, является ген МХ1, который кодирует противовирусный белок Myxovirus resistance protein (МхА) массой 76 кДа суперсемейства гуанозинтрифосфатаз (GTPase). МхА узнает и захватывает нуклеокапсид-подобные структуры вирусов после их проникновения в клетки хозяина, ингибируя репликацию вирусных геномов (Trinchieri, 2010). Белок МхА обеспечивает противовирусную защиту от разнообразных вирусов, включая вирусы гриппа, парагриппа, кори, вируса Коксаки и вируса гепатита В. Вирусы ингибируются белком МхА на ранней стадии жизненного цикла после проникновения в клетку организма-хозяина и перед амплификацией вирусного генома. МхА обнаруживает вирусы, опознавая и захватывая нуклеокапсидподобные структуры. Анализ экспрессии гена МХ1 может служить маркером дифференциации вирусных от бактериальных инфекций и свидетельством биодоступности интерферонов I типа. Исследование системы IFN и индуцируемых ими генов необходимо для персонализированной профилактики и терапии.

Интерлейкин 23 был выявлен при сканировании генома с целью поиска цитокинов семейства IL-6/IL-12. Белок DL-23 представляет собой гетеродимер, содержащий ту же субъединицу р40, что и IL-12, но в отличие от IL-12 содержащий субъединицу р19, специфичную только для IL-23. IL-23 использует многие компоненты сигнальной трансдукции IL-12: он связывается с рецептором IL-12Rβ1, но не с IL-12Rβ2. IL-23 играет роль в поляризации по первому типу Т-клеток иммунного ответа. Хотя IL-12 сильно активирует наивные Т-клетки, в первоначальном описании IL-23 говорилось о предпочтительном действии на Т-клетки памяти для усиления продукции IFNγ и пролиферации, подтверждая важную роль IL-23 в контроле бактериальных инфекций. Кроме того было показано, что IL-23 является ключевым цитокином контроля процесса воспаления в периферических тканях. Гиперэкспрессия р19 коррелирует с воспалением во многих органах и эпителиальных тканях, включая кожу. Показано, что IL-23 участвует в воспалительных процессах в нервной системе и при аутоиммунных заболеваниях. Известны коммерческие наборы, основанные на иммуноферментном анализе, в частности: для определения IL23 с набором "eBioscience" (Германия) (кат. номер BMS2023); IFN-λ1 (TL29) («BenderMedSystems», Австрия) и белка МхА (BioVendor, Чехия-Германия-Австрия-Словакия (https://www.biovendor.com), кат. номер RD194349200R). Однако эти наборы имеют ограниченную чувствительность (не более 10 пг/мл) и специфичность из-за возможных перекрестных реакций. Необходима разработка тест-системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, для детекции и количественных оценок РНК IFNλ, IL23 и МхА.

Как известно, наиболее чувствительным и специфичным методом детекции специфических РНК является ОТ-ПЦР с флуоресцентными зондами в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). В отличие от используемых ранее иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализа с возможными перекрестными серологическими реакциями и пределом чувствительности 10 пг целевого продукта или аналита, соответствующим 105-106 молекул в зависимости от молекулярного веса, и ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов реакции, позволяющей применять праймеры с несколькими нуклеотидными заменами по сравнению с матричными нуклеиновыми кислотами и порогом чувствительности, не превышающим десятки геном-эквивалентов в реакционной смеси, ОТ-ПЦР-РВ позволяет выявлять единичные копии в реакционных смесях с высокой специфичностью, определяемой зондом. Для определения РНК разных цитокинов применяют качественные и количественные варианты ОТ-ПЦР (Oka М., Hirose К., Ilzuka N. et. al. Cytokine mRNA expression patterns in human esophageal cancer cell lines. J. Interferon and Cytokine Res., V. 15, p. 1005-1009, 1995; Platzer C., Blankenstein T. Polymerase chain reaction to quantitate cytokine mRNA. In: Cytokines. A practical approch. Ed. F.R. Barkwill. IRL Press, Ox-ford, N-Y, Tokyo, 1995). Известны изобретения, описывающие несколько вариантов ОТ-ПЦР для определения РНК в разных видах клеток и тканей (Klotman Р.Е. et. al., патент США 5543509, 6 авг. 1996; Pardee et. al., патент США 5665547, 9 сент. 1997; Banker et. al., патент США 5643730, 1 июля 1997; Sutcliffe et. al., патент США 5807680, 15 сент. 1998).

В настоящее время не известны тест-системы, основанные на детекции специфических РНК с помощью ОТ-ПЦР-РВ с флуоресцентными зондами для выявления и количественных оценок РНК интерферона λ, интерлейкина IL23 и противовирусного белка МхА. Таким образом, актуальность новой тест-системы по определению РНК интерферона лямбда, интерлейкина 23 и противовирусного белка МхА обусловлена их вышеперечисленными свойствами и отсутствием аналогичных коммерческих тест-систем.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сущность настоящего изобретения заключается в создании тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ для мультиплексного анализа и количественных оценок экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 с одновременной детекцией флуоресценции гидролизуемых зондов по разным каналам.

Предлагаемая тест-система для определения РНК IFNλ, IL23 и МхА включает специфические праймеры и флуоресцентные зонды, соответствующие экзонам соответствующих генов, для определения только мРНК в присутствии следовых количеств геномной ДНК человека в составе выделяемых суммарных нуклеиновых кислот, а также отрицательный и положительные контрольные образцы. Положительные контрольные образцы представляют очищенные гель-фильтрацией на сефадексе G-50 продукты ПЦР с 3 парами праймеров, структуры которых приведены в таблице 1, с известной концентрацией, определенной спектрофотометрически при длине волны 260 нм.

Для настоящего изобретения были разработаны специфические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные гидролизуемые зонды с 5'-концевыми флуорофорами на основе родамина и цианина и внутренними тушителями флуоресценции (black hole quencher (BHQ)), выбранными на основании множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей соответствующих мРНК из базы GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) с использованием программного обеспечения VectorNTI, DNAStar и анализа выбранных праймеров с применением комплекса программ www.idtdna.com. Выбор специфических праймеров, соответствующих экзонам генов, для определения только РНК в присутствии следовых количеств геномной ДНК человека в составе выделяемых суммарных нуклеиновых кислот необходим для корректного определения РНК IFNλ, IL23 и противовирусного белка МхА в норме и при патологии, в мониторинге терапии для подтверждения эффективности проводимого лечения.

Ниже приведены предлагаемые нуклеотидные последовательности праймеров (Таблица 1) и флуоресцентных зондов (Таблица 2), соответствующие мРНК интерферона λ, противовирусного белка МхА, цитокина IL23.

Также оптимизированы условия выделения РНК из клеток и сывороток крови, из индуцированных мокрот больных бронхиальной астмой и смывов больных респираторными инфекциями. Сравнение различных методов выделения РНК показало преимущества лизиса в концентрированных растворах гуанидинизотицианата с последующим спиртовым осаждением по скорости процесса, выходу и стабильности РНК.

Разработаны оптимальные условия обратной транскрипции с использованием суммарных РНК из различных клинических образцов. Для повышения предела чувствительности тест-системы необходима обратная транскрипция в следующем режиме: 37°С 30 мин, 40°С 15 мин, 42°С 15 мин с необходимой последующей инактивацией фермента при 95°С в течение 3 мин.

Оптимизированы условия ПНР, такие как состав буфера, концентрация солей Mg2+ (рабочий диапазон от 4 до 5 мМ), температура отжига праймеров и зондов (60-62°С), временной режим амплификации (94°С - 10 сек, 60-62°С - 20 сек, 72°С - 30 сек, 55 циклов).

В качестве отрицательного контроля применяли деионизованную воду. В качестве положительных контрольных образцов использовали продукты ОТ-ПЦР, предварительно очищенные гель-фильтрацией на сефадексе G-50, концентрации которых определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 с (Thermo Scientific, США) при длине волны 260 нм.

После оптимизации всех этапов анализа тест-система апробирована на клинических образцах, взятых у 18 больных рассеянным склерозом, 28 больных бронхиальной астмой в сочетании с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), 17 пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями, 23 практически здоровых человека.

После выделения нуклеиновых кислот, например, из лимфоцитов, мокроты и других биологических жидкостей, РНК противовирусного белка МхА, РНК интерферона TFNX и РНК интерлейкина 23 детектировали методом обратной транскрипции с ревертазой ретровирусов грызунов (MMLV) и случайными олигодезоксирибонуклеотидами длиной 7 нуклеотидных остатков производства «АмплиСенс» (Россия) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) со специфическими праймерами и флуоресцентными зондами, выбранными на основании множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей соответствующих мРНК и синтезированными в «Синтол» (Россия).

Техническим результатом настоящего изобретения является создание мультиплексной тест-системы для определения РНК интерферона λ, интерлейкина IL23 и противовирусного белка МхА, которая позволяет проводить детекцию, идентификацию и количественные оценки уровней транскрипции их РНК с высокой чувствительностью (десятки копий РНК в реакционной смеси), специфичностью и возможностью мультиплексного анализа. Предлагаемая мультиплексная ПЦР в реальном времени позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика, а также ускорить процедуру.

Примеры применения тест-системы

Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не исчерпывают все возможные области применения тест-системы для определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в различных клинических образцах, включая клетки и плазму крови, мокроту, носоглоточные смывы и др. биологические жидкости при инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваниях.

Пример 1. Определение РНК IFNλ, IL23 и МхА в образцах индуцированной мокроты больных бронхиальной астмой (БА)

Проведено обследование 28 пациентов с фенотипом БА-ХОБЛ вне обострения, средней возрастной группы (57,22±10,5 лет) с длительностью заболевания более 10 лет. На основании клинической картины заболевания, показателей функции внешнего дыхания и объема терапии определяли тяжесть течения заболевания по GINA (пересмотр 2006 г.) и GOLD (пересмотр 2008 г.). Независимо от тяжести БА больным с фенотипом БА-ХОБЛ в качестве базисной терапии назначали комбинацию ингаляционных глюкокортйкостероидов и длительно действующих β2-агонистов. Из 50,0 мкл индуцированной мокроты выделены нуклеиновые кислоты с применением набора «Проба-НК» (производства «ДНК-технология», Москва). После выделения нуклеиновых кислот из 50,0 мкл образцов мокроты РНК IFNλ, и МхА детектировали посредством обратной транскрипции с использованием набора "Reverta-L" ("АмплиСенс", Москва) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с праймерами и флуоресцентными зондами, соответствующими этим генам человека и TaqF ДНК-полимеразой ("АмплиСенс", Москва):

IFNλ

IFN λ-F

5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

IFN λ-R

5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

IFN λ-Z

5'-ROX-GAGGCTGAGCTGGCCCTGACGC-3'

IL 23

IL23-F

5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

IL23-R

5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

IL23-Z

5'-Cy5-TATCCGATCCTAGCAGCTTCTCATA-3'

MxA

MxA-F

5'-GATGCTACTGTGGCCCAG-3'

MXA-R

5'-GAGTCAATGAGGTCGATG-3'

MXA-Z

5'-R6G-GCA CCT TCT CCT CAT ACT GGC TGC -3'

В следующих условиях:

94°С - 10 сек

60°С - 20 сек

72°С - 30 сек

55 циклов

Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием отрицательного и положительных контрольных образцов.

К 5'-концам зондов присоединены флуорофоры R6G, Rox и Су5, при гидролизе фосфодиэфирной связи освобождающиеся в раствор с разгоранием флуоресценции в зависимости от количеств исходных РНК и кДНК и регистрируемые по разным каналам с максимумами испускания (эмиссии) при 550, 602 и 670 нм соответственно.

РНК IFNλ выявлена в 42,9% образцах мокроты в количествах 106-109 молекул РНК в 1 мл мокроты. IL23 у больных БА-ХОБЛ не определяли, т.к. при легочных патологиях БА и ХОБЛ важно выявление экспрессии генов BFNX и противовирусного белка МхА. РНК противовирусного белка МхА детектировали в 28,6±8,7% образцов (101-102 копий РНК в 1 мл мокроты), что могло определять устойчивость к вирусу гриппа и некоторым вирусам с одноцепочечной геномной РНК отрицательной полярности, включая респираторно-синцитиальный вирус.

Вывод: разработанная тест-система для количественного определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в мокротах больных с диагнозом БА-ХОБЛ необходима для определения их иммунного статуса, поскольку симптомы БА могут усиливаться под влиянием вирусных инфекций, аллергенов, курения, физических нагрузок и стресса.

Пример 2. Анализ экспрессии генов IFN λ, IL23 и МхА в лимфоцитах крови больных аутоиммунным заболеванием - рассеянным склерозом (PC)

Образцы крови получены от 18 человек с диагнозом PC согласно обновленным диагностическим критериям MacDonald et al. в модификации 2010 г., в основном с ремиттирующим типом течения (14 пациентов) и вторично-прогрессирующим течением (4 пациента). Пациенты среднего возраста (35,72±9,46 лет), 16 женщин и 2 мужчин, с длительностью болезни (7,22±4,10 лет). Результаты объективного неврологического обследования оценивались по общепринятой шкале клинической оценки функционального состояния проводящих систем при этом заболевании, предложенной J. Kurtzke и шкале инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale). Показатель EDSS перед исследованием составил 2,69±1,22 балла.

Из 3 мл венозной крови с К3EDTA выделяли лимфоциты с использованием фиколл-верографина. Из лимфоцитов выделены нуклеиновые кислоты с применением набора «Проба-НК» (производства «ДНК-технология», Москва). После выделения нуклеиновых кислот экспрессию генов IFNλ, IL23 и МхА детектировали посредством обратной транскрипции с использованием набора "Reverta-L" ("АмплиСенс", Москва) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с праймерами и флуоресцентными зондами, соответствующими этим генам человека и TaqF ДНК-полимеразой:

IFNλ

TFN λ-F

5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

IFN λ-R

5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

IFN λ-Z

5'-ROX-GAGGCTGAGCTGGCCCTGACGC-3'

IL 23

IL23-F

5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

IL23-R

5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

IL23-Z

5'-Cy5-TATCCGATCCTAGCAGCTTCTCATA-3'

MxA

MxA-F

5'-GATGCTACTGTGGCCCAG -3'

MXA-R

5'-GAGTCAATGAGGTCGATG -3'

MXA-Z

5'-R6G-GCACCTTCTCCTCATACTGGCTGC-3'

В следующих условиях:

94°С - 10 сек

60°С - 20 сек

72°С - 30 сек

55 циклов

Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием отрицательного и положительных контрольных образцов.

К 5'-концам зондов присоединены флуорофоры R6G, ROX и Су5, при гидролизе фосфодиэфирных связей освобождающиеся в раствор с разгоранием флуоресценции в зависимости от количеств исходных РНК и кДНК и регистрируемые по разным каналам с максимумами эмиссии при 550, 602 и 670 нм соответственно.

Анализ мРНК в лимфоцитах крови больных PC показал достоверно повышенные количества для EFN λ и EL23 по сравнению с контрольной группой доноров. В результате лечения пациентов препаратом «IFNβ 1а» более 6 месяцев содержание мРНК IL23 уменьшалось, что коррелировало со стабилизацией неврологического состояния. Для TFNX снижения не обнаружено. Для экспрессии гена МхА были характерны разнонаправленные флуктуации, что может свидетельствовать о независимости транскрипции этого гена от экзогенного рекомбинантного IFNβ.

Вывод: разработанная тест-система определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в лимфоцитах больных позволяет оценить неспецифическую резистентность и прогнозировать течение аутоиммунных заболеваний.

Пример 3. Детекция и количественные оценки РНК IFNλ, IL23 и МхА в носоглоточных смывах больных респираторными инфекциями

Смывы из носоглотки 17 пациентов с подтвержденными диагнозами в ОТ-ПЦР-РВ (10 больных 18-33 лет с диагнозом грипп) и ОРВИ (7 больных 18-44 лет). Группу сравнения составили 15 практически здоровых человек в возрасте 25-60 лет. Для определения диагноза ОРВИ проводили ОТ-ПЦР-РВ с использованием набора «ОРВИ-АмплиСенс» ("АмплиСенс", Москва). Из 50,0 мкл смывов выделены нуклеиновые кислоты с применением набора «Проба-НК» (производства «ДНК-технология», Москва). После выделения нуклеиновых кислот из 50,0 мкл образцов смывов РНК IFNλ, IL23 и МхА детектировали посредством обратной транскрипции с использованием набора "Reverta-L" ("АмплиСенс", Москва) с последующей ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с праймерами и флуоресцентными зондами, соответствующими этим генам человека и TaqF ДНК-полимеразой:

IFNλ

IFN λ-F

5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

IFN λ-R

5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

IFN λ-Z

5'-ROX-GAGGCTGAGCTGGCCCTGACGC-3'

IL23

IL23-F

5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

IL23-R

5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

IL23-Z

5'-Cy5-TATCCGATCCTAGCAGCTTCTCATA-3'

MxA

MxA-F

5'-GATGCTACTGTGGCCCAG-3'

MXA-R

5'-GAGTCAATGAGGTCGATG-3'

MXA-Z

5'-R6G-GCACCTTCTCCTCATACTGGCTGC-3'

В следующих условиях:

94°С - 10 сек

60°С - 20 сек

72°С - 30 сек

55 циклов

Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием отрицательного и положительных контрольных образцов.

К 5'-концам зондов присоединены флуорофоры R6G, ROX и Су5, при гидролизе фосфодиэфирной связи освобождающиеся в раствор с разгоранием флуоресценции в зависимости от количеств исходных РНК и кДНК и регистрируемые по разным каналам с максимумами испускания (эмиссии) при 550, 602 и 670 нм соответственно.

Высокие частоты (80-100%) и уровни экспрессии генов IFNλ, IL23 и МхА у больных ОРВИ и здоровых не отличались. Высокие уровни РНК МХА в клетках слизистой свидетельствовали о биодосгупности IFN I типа в этих клетках, о преимущественно вирусных инфекциях без ассоциаций с бактериями и не обеспечивали полного ингибирования репликации респираторных вирусов на ранней стадии инфекции.

Вывод: выявлены РНК IFN λ, IL23 и МхА в смывах со слизистой носоглотки. Предложенная тест-система определения РНК IFN λ, IL23 и МхА в смывах носоглотки больных позволяет выявлять врожденную доиммунную резистентность и последующее развитие специфического иммунитета.

Таким образом, разработана и апробирована тест-система определения мРНК IFNλ, IL23 и противовирусного белка МхА, которая характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Настоящее изобретение может быть использовано для мультиплексного анализа. Предлагаемая тест-система для определения РНК IFNλ, IL23 и МхА путем обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени основана на применении специфических праймеров и флуоресцентных зондов, выбранных на основании множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей соответствующих мРНК. Заявляемая тест-система позволяет не только качественно определять наличие мРНК интерферона λ, IL23 и МхА, но и проводить количественные оценки, необходимые для определения иммунологического статуса пациентов в норме и при патологии, контроля лечения и прогнозирования инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний. Возможно применение этой тест-системы в диагностике инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека.

Особенно актуальна в следующих направлениях:

1. Детекция РНК интерферона λ, интерлейкина IL23 и противовирусного белка МхА в лимфоцитах и сыворотках крови людей с первичными или вторичными иммунодефицитами.

2. Количественные оценки уровней экспрессии генов интерферонов, интерлейкинов и противовирусных белков при инфекционных заболеваниях человека.

3. Контроль за процессом лечения инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний человека.

Заявленное изобретение позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика, а также ускорить процедуру.

Список литературы

1. Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность. Клиническая лабораторная диагностика, 1, 1998, с. 21-32.

2. Awasthi A. and Kuchroo V.K. "From ТН1/ТН2 Paradigm to TH17 Cells: Le Roi Est Mort, Vive Le Roi"In: Th17 Cells in Health and Disease. Springer New York - Dordrecht - Heidelberg - London, 2011.

3. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. М., Медицина, 1996.

4. Vilcek J. a. Sen G.C. Interferons and other cytokines. In "Fundamental Virology", p. 341-345, New-York, 1996.

5. Sen G.C. a. Lengyel P. The interferonsystem. A birds eye view of its biochemistry. J. Biol. Chem. V. 267, p. 5017-5020, 1992.

6. Lengyel P. Tumor-suppressor genes; News about the interferon connections. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.90, p. 5893-5895, 1993.

7. de Weerd, et al. (2007) J Biol Chem. 2007; 282 (28), 20053-20057

8. Taira et al. (2005) J. Vet. Med. Sci. 67 (10), 1059-1062.

9. Trinchieri, G. Type I interferon: friend or foe? / G. Trinchieri // J. Exp. Med. - 2010. - 207. - P. 2053-2063.

Тест-система для мультиплексного количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 на основе обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени, включающая специфические праймеры и флуоресцентные гидролизуемые зонды

для определения РНК интерферона λ:

прямой праймер (F-IFNλ) (длиной 18 н.о.) 5'-CTGCAGGTGAGGGAGCGC-3'

обратный праймер (R-IFNλ) (длиной 18 н.о.) 5'-CAGGGTGTGAAGGGGCTG-3'

зонд (Z-IFNλ) (длиной 22 н.о.) 5'-ROX-GAGGCTGAGCT(BHQ2)GGCCCTGACGC-3',

для определения РНК противовирусного белка МхА:

прямой праймер F-МхА (длиной 18 н.о.) 5'-GATGCTACTGTGGCCCAG-3'

обратный праймер R-МхА (длиной 18 н.о.) 5'-GAGTCAATGAGGTCGATG-3'

зонд Z-MxA (длиной 24 н.о.) 5'-R6G-GCACCTTCT(BHQ1)CCTCATACTGGCTGC-3',

для определения РНК интерлейкина 23:

прямой праймер F-IL23 (длиной 18 н.о.) 5'-ACAGTCAGTTCTGCTTGC-3'

обратный праймер R-IL23 (длиной 17 н.о.) 5'-CAGGGCTATCAGGGAGC-3'

зонд Z-IL23 (длиной 25 н.о.) 5'-Sy5-TATCCGATCCT(BHQ2)AGCAGCTTCTCATA-3',

в качестве отрицательного контроля - деионизованную воду,

в качестве положительных контрольных образцов - очищенные с помощью гель-хроматографии продукты ОТ-ПЦР определенных концентраций.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Изобретение обеспечивает способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения биологической активности дефибротида. Приводят в контакт дефибротид, эуглобулин млекопитающего и субстрат, специфичный для плазмина, который в результате реакции с плазмином дает измеряемый продукт.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями, включающий детекцию точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа и наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, соответственно.

Изобретение относится к области медицины, в частности к эндокринологии, и предназначено для прогнозирования эффективности терапии сахарного диабета 2 типа. Осуществляют забор периферической венозной крови и выделение ДНК.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и предназначено для определения риска возникновения рецидива онкологических заболеваний молочной железы.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способы обнаружения патологии системы органов или органа у субъекта, способ идентификации соединения, пригодного для замедления прогрессирования или лечения патологии системы органов, и способ определения токсичности соединения или фактора окружающей среды для системы органов у субъекта.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, микробиологии и медицины. Описан способ одновременной таргетной амплификации фрагментов геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека, включающих Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Atopobium vaginae, Enterococcus faecalis, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Mobiluncus mulieris, Streptococcus anginosus, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, Treponema pallidum, с целью одновременной идентификации возбудителей.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения кардио-генеративного потенциала клеток млекопитающих, включающий сбор измеренных уровней экспрессии в клетках млекопитающих генов Nkx2.5, Tbx5, MEF2C, GATA4, GATA6, Mesp1, FOG1 и определение коэффициента кардиального генеративного потенциала (CARPI) как среднего значения измеренных уровней экспрессии указанных генов указанных клеток.

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфизмов генов.

Изобретения относятся к способам обнаружения рака поджелудочной железы с применением новых маркеров опухоли. Представленные способы обнаружения рака поджелудочной железы включают измерение наличия или количества полипептида, обладающего реактивностью в форме специфического связывания с антителом против белка CAPRIN-1 через взаимодействие антиген-антитело, или наличия или количества нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид, в образце, взятом от индивидуума, где полипептид, подлежащий измерению, представляет собой белок CAPRIN-1, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-30 с четным номером, и где наличие или количество нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определяют путем определения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащийся в образце.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для диагностики наличия мутации L576P гена c-KIT в тканях меланомы. Оценку наличия мутации проводят по соотношениям значений пороговых циклов Ct в трех реакциях ПЦР в реальном времени с аллель-специфичными праймерами. По результатам трех дублей реакции рассчитывают долю мутантной ДНК в образце. Изобретение обеспечивает оптимизацию аллель-специфичной ПЦР в реальном времени для диагностики мутации рецептора тирозинкиназы c-KIT L576P в тканях меланомы. 6 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы. Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови обследуемого с последующим определением генотипа полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186). Прогноз повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы осуществляется с помощью геномного типирования полиморфизма A1166С гена AGTRl (rs 5186). При наличии носительства аллеля С и генотипа АС полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186) прогнозируют повышенный риск развития аСАК. Использование способа повышает точность прогнозирования риска развития аневризмы сосудов головного мозга и ее разрыва, приводящего к субарахноидальному кровоизлиянию у лиц азиатской расы. 7 табл., 3 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий выделение внеклеточной ДНК (вкДНК) из образца крови, полученной у беременной женщины, выбор регионов генома для проведения амплификации, приготовление геномных библиотек, картирование полученных последовательностей на референсный геном или части генома человека с определением их координат, определение значения покрытия для каждого региона генома, характеризующегося открытостью хроматина между плацентой и клетками крови матери, отличающейся не менее чем на 20%, и получение регионов генома с указанной открытостью хроматина, после чего делается вывод о наличии анеуплоидий плода. Предложен способ получения регионов генома для осуществления вышеуказанной неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода. Предложенная группа изобретений обеспечивает простой и экономичный способ пренатальной диагностики анеуплоидий плода на ранних этапах беременности. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ выявления РНК и ДНК из сухих биологических образцов и набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов. Вышеуказанный способ включает в себя освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот. Осаждение ДНК и РНК осуществляется раствором, содержащим изопропанол и C6H10O5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в отношении 40:0,5 соответственно. Изобретение расширяет арсенал средств выделения нуклеиновых кислот. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл, 3 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ профилактики африканской чумы свиней, включающий выявление животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных. Остальных животных в очаге инфекционного заболевания африканской чумой свиней обследуют в течение суток методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Животных-носителей вируса и здоровых животных переводят в отдельные помещения и в их присутствии осуществляют санацию помещений озоно-воздушной смесью: в помещении с животными-носителями вируса - в течение месяца не менее 3-4 раз в неделю с концентрацией озона 4-6 г/м3 в течение 20-30 минут, в помещении со здоровыми животными - в течение не более двух недель 2-3 раза в неделю с концентрацией озона 3-4 г/м3 в течение 15-20 минут. Изобретение обеспечивает расширение функциональных возможностей способа профилактики африканской чумы свиней. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа. Способ включает анализ образца, взятого у пациента, и определение уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-126, miR-210 и miR-101, и сравнение упомянутого уровня экспрессии со значением контроля, где: (а) снижение уровня экспрессии сывороточной miR-127 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (б) повышение уровня экспрессии miR-127 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (в) снижение уровня экспрессии сывороточной miR-126 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (г) повышение уровня экспрессии сывороточной miR-210 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; (д) снижение уровня экспрессии miR-210 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек; или (е) повышение уровня экспрессии сывороточной miR-101 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Изобретение обеспечивает набор праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами. 4 ил., 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН). Выявляют патологию шейки матки. Определяют уровень экспрессии маркеров-предикторов с помощью вестерн-блот анализа с детекцией хемилюминисценции и ПЦР в реальном времени. При значениях уровней экспрессии HIF1alpha 0,029, GLUT1 782,9±156,5, IGFBP-3 0,038±0,0076, HK2 36,4, VDAC1 70 диагностируют ЦИН1 (LSIL). При значениях уровней экспрессии HIF1alpha 0,03, GLUT1 1154,2±88,7, IGFBP-3 0,02±0,005, HK2 44,9, VDAC1 87 диагностируют ЦИН2-3 (HSIL). Изобретение обеспечивает эффективную диагностику ЦИН на более ранних этапах. 5 ил., 1 табл., 3 пр.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, и набору для его осуществления. Для осуществления указанного способа получают образец плазмы крови у человека, затем проводят изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот плазмы крови. Далее осуществляют очистку нуклеиновых кислот из реакционной смеси и проводят количественный анализ нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Определяют коэффициент К в пробах. Далее сравнивают коэффициент К с референсным значением и диагностируют заболевание, сопровождающееся повышенной гибелью клеток, при значении коэффициента К менее референсного значения. Настоящее изобретение позволяет проводить малоинвазивную диагностику заболеваний, сопровождающихся повышенной гибелью клеток, с высокой чувствительностью, на любых стадиях заболевания, в том числе на ранних стадиях, при которых клинические симптомы отсутствуют. 2 н. и 50 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метелирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР и способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР. Указанный способ включает формирование панели генов-онкомаркеров колоректального рака: ADHFE1, ALX4, CNRIP1, EID3, ELMO1, ESR1, FBN1, HLTF, LAMA1, NEUROG1, NGFR, RARB, RXRG, RYR2, SDC2, SEPT9, SFRP2, SOCS3, SOX17, THBD, TMEFF2, UCHL1 и VIM. Изобретение расширяет арсенал олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных праймеров. 2 н.п. ф-лы., 3 ил., 4 табл., 3 пр., 1 прил.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-система для мультиплексного количественного анализа экспрессии генов интерферона лямбда, противовирусного белка МхА и интерлейкина 23 на основе обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией в реальном времени, включающая специфические праймеры и соответствующие им флуоресцентные гидролизуемые зонды, а также отрицательный и положительные контрольные образцы. Изобретение позволяет проводить детекцию, идентификацию и количественные оценки уровней транскрипции РНК указанных генов с высокой чувствительностью, специфичностью и возможностью мультиплексного анализа, позволяет снизить стоимость анализа за счет уменьшения трудозатрат, расхода реактивов и пластика и ускорить процедуру, а также может успешно применяться при контроле лечения и прогнозирования течения инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека. 2 табл., 3 пр.

Наверх