Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных
Владельцы патента RU 2631795:
Гайнутдинова Елена Павловна (RU)
Харитонов Михаил Васильевич (RU)
Гайнутдинов Тимур Рафкатович (RU)
Гараев Айрат Рашитович (RU)
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных предусматривает получение фильтрата культур стафиококка путем выращивания культур стафилокока на мясопептонном агаре с последующим культивированием в термостате при 37оС в течение 8-10 дней. Проводят инактивацию культуры стафилококка на водяной бане при температуре 90-95оС в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 20 мин с последующим отделением надосадочной жидкости и дополнительной фильтрацией через фильтр Зейтца. Изобретение позволяет сократить сроки культивирования посевного материала и повысить чувствительность бактериологического исследования. 25 ил., 4 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к способам получения новых питательных сред для ускоренного выделения возбудителя некробактериоза - F. necrophorum при бактериологических исследованиях.
Среди инфекционных заболеваний, с поражением дистальных частей конечностей, в частности некробактериоз, остается одной из важнейших проблем в патологии крупного рогатого скота, который получил еще большее распространение в связи с завозом импортного поголовья, не приспособленного к местным условиям содержания и кормления. Особенно ощутимый экономический ущерб терпят от этой болезни хозяйства молочного направления.
При несоблюдении зооветеринарных параметров содержания и кормления животных, предрасполагающими факторами в возникновении болезни являются снижение естественной резистентности организма и мацерация кожного покрова дистальных частей конечностей.
После внедрения в организм через поврежденный кожный покров микробы F. necrophorum в местах первичной локализации обуславливают появления болезненного воспалительного отека подкожной клетчатки.
Исходным моментом в профилактике и лечении некробактериоза является постановка точного диагноза. Кроме эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, в диагностике некробактериоза чрезвычайно важно получить чистую культуру из пораженных органов, что, однако, удается с трудом.
В ветеринарной практике для бактериологического исследования используют различные питательные среды.
Известно применение печеночного бульона, мозговой среды, свернутой сыворотки крови, мясопептонного агара с кровью, полужидкого агара с добавлением 2%-го сахара (В.А. Балабанов. Некробактериоз животных. М., 1971; Лабораторные исследования в ветеринарии, под редакцией Б.И. Антонова М., 1986.). Недостатком указанных питательных сред является низкая чувствительность их в отношении F. necrophorum и длительный срок культивирования, который наступает только на 3-8 сутки.
Известна питательная среда для выделения возбудителя некробактериоза - Китта-Тароцци («Анаэробные организмы», материал из Википедии - свободной энциклопедии - ru.rn.wikipedia.org). Однако применение этой среды позволяет инкубировать посевы не ранее трех - пяти суток, просматривая их при этом ежедневно.
Известна также питательная среда для выявления возбудителя некробактериоза, содержащая питательную среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ный раствор глюкозы при следующем соотношении компонентов, мас. %: питательная среда 199-85,0, сыворотка крови 10,0, 40%-й раствор глюкозы 5,0 (Патент №2569456, МПК C12N 1/20, C12R 1/01, опубл. 27.11.2015 г., БН №33).
Хотя данная питательная среда и обладает высокой чувствительностью по сравнению с другими питательными средами (первичный рост возбудителя в анаэробных условиях происходит через 4 часа после посева, а в аэробных условиях через 2 часа), однако чувствительность ее недостаточна для выявления возбудителя некробактериоза у больных животных.
Технический результат, на достижения которого направлено заявляемое изобретение, состоит в повышении чувствительности бактериологического исследования и сокращении сроков культивирования посевного материала.
Для достижения этого технического результата в предлагаемом способе культивирование возбудителя некробактериоза осуществляют в фильтрате культур стафилококка, который получают путем высева в жидкую питательную среду суточных культур стафилококка, а в качестве питательной среды для выращивания культур стафилококка используют мясопептонный бульон, затем их культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней, инактивируют в водяной бане при температуре 90-95°С в течение 30 мин, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 мин, а полученную надосадочную жидкость дополнительно фильтруют через фильтр Зейтца и используют как питательную среду для выявления возбудителя некробактериоза.
Такое выращивание возбудителя некробактериоза в фильтрате культур стафилококка позволяет повысить чувствительность бактериологического исследования и сократить сроки культивирования посевного материала в 8 раз.
Питательная среда для выращивания стафилококков на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 35-40°С известна (allvet.ru>knowledge_base/microbiology/…). Известен и фильтрат культур стафилококков (http://lekmed.ru/info/arhivy/mikrobiologicheskih-issledovaniy-38.html), однако для выявления и культивирования возбудителя некробактериоза животных он никогда ранее не использовался, кроме того внесены значительные изменения в сам способ получения фильтрата культур стафилококка.
Пример 1. В качестве питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза использовали предварительно полученный следующим образом фильтрат культур стафилококка. В жидкую питательную среду высевали культуры стафилококка, культивировали в термостате при 37°С в течение 8-10 дней. Полученную в мясопептонном бульоне культуры стафилококка инактивировали в водяной бане при температуре 90-95°С в течение 30 мин, подвергали центрифугированию при 1000 об/мин в течение 20 мин. Затем полученную надосадочную жидкость отделяли и фильтровали через фильтр Зейтца (рис. 1-а, б, в) и использовали в дальнейшем как питательную среду для выявления возбудителя некробактериоза.
Полученный фильтрат прозрачный, соломенно-желтоватого цвета, стерильный, не дает осадка при хранении, рН 7,96-7,99.
Химический состав культуральной жидкости стафилококков включает ферменты, глюкозу, общий белок, мочевину, альбумины, щелочную фосфатазу, креатинин, железо, кальций, фосфор, сероактивный белок, гамма-глобулины.
Количественное соотношение указанных веществ в питательной среде:
| Аланинаминотрансфераза | 2,7 ммоль /л |
| Аспартатаминотрансфераза | 1,2 ммоль /л |
| Креатинин | 125,0 ммоль/л |
| Мочевина | 7,6 ммоль/л |
| Общий белок | 0,5 г/л |
| Глюкоза | 0,3 ммоль/л |
| Щелочная фосфатаза | 20,9 ммоль/л |
| Холестерин | 0,1 ммоль/л |
| Амилаза | 0,8 г/л |
| Общий билирубин | 0,5 ммоль/л |
| Альбумины | 0,5 г/л |
| Гамма-глобулины | 1,6 г/л |
| Кальций | 0,1 ммоль/л |
| Фосфор | 23,3 мг/л |
| Железо | 11,5 ммоль/л |
| Сероактивный белок | 1,0 мг/л |
Полученный фильтрат культур стафилококка был испытан как питательная среда в Республиканской лаборатории РТ с использованием для культивирования культур F. necrophorum, производственные штаммы, выделенные нами в ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района и ООО АФ «Южный» Нурлатского района РТ в 2014 г. (Патент №2569456), а также на посевах из патологического материала, полученного от больных коров с поражением дистальных частей конечностей.
Пример 2. Бактериальные суспензии F. necrophorum из производственных штаммов ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района и ООО АФ «Южный» Нурлатского района с содержанием 500000 микробных тел по стандарту мутности готовили на физиологическом растворе и высевали в 10 пробирок с содержанием предлагаемой питательной среды с наслоением вазелинового масла и в 10 пробирки без масла. Перед применением пробирки со средами регенерировали в водяной бане в течение 30 мин при температуре 55°С. После высева пробирки помещали в термостат при температуре 37°С с установлением визуального наблюдения через каждый час до 14 часов, а затем через 36, 56, 84 часов после высева культур. Результаты исследования представлены в таблице 1 и рисунках 2 - а, б, в, г, д, е; 3 - а, б, в, г, д, е; 4 - а, б, в, г, д, е; 5 - а, б, в, г, д, е.
,
Как видно из таблицы 1, первичный рост музейных штаммов F. necrophorum начинает появляться в первые же 15 минут после посева (рис. 2а, 4а) с последующим усилением роста в виде образования пузырьков газа и помутнения среды (рис. 2 - б, в, г, д, е; 4 - б, в, г, д, е).
В аэробных условиях рост возбудителя несколько усиливается, чем в анаэробных условиях (рис. 3 - а, б, в, г, д, е; 5 - а, б, в, г, д, е).
Рост вышеуказанных штаммов в условиях Республиканской лаборатории определяли по результатам оптической плотности с помощью прибора фотоэлектроколориметра (ФЭК - 56 М).
Пример 3. В четыре стерильные пробирки вносили по 10 мл испытуемой питательной среды и засевали возбудителем некробактериоза производственными штаммами, выделенными в ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района и в ООО АФ «Южный» Нурлатского районов РТ. В целях создания анаэробных условий в две из них наслаивали вазелиновое масло и помещали в термостат при температуре 37°С.
Результаты исследования по определению оптической плотности засеянных культур представлены в таблице 2 и рисунках 6 (а, б, в, г); 7 (а, б, в, г); 8 (а, б, в, г); 9 (а, б, в, г).
Как видно из таблицы 2, рост культуры некробактериоза начинается уже в первые минуты, культура некробактериоза лучше растет с добавлением вазелинового масла.
Однако в отличие от музейных штаммов, возбудитель, выделенный из патологического материала, полученного от больных животных, обладает свойством более медленного роста при посевах на питательные среды и обладает более высокой вирулентностью.
Пример 4. Крестьянское фермерское хозяйство (КФХ) «Козлов М.И.» Ново Шешминского района Республики Татарстан. Всего на ферме 1337 голов крупного рогатого скота черно-пестрой породы. Из всего поголовья 400 голов коров, 258 - нетели, 305 - телок, быки производители – 6, остальное - поголовье молодняка разного возраста. При клиническом осмотре было обнаружено 75 коров, 12 нетелей с различной степенью хроматы.
Патологический материал в количестве 12 проб получен от коров и нетелей с поражением дистальных частей конечностей.
Посевной материал после предпосевной обработки засевали в шесть пробирок с содержанием испытуемой питательной среды. В три пробирки в целях создания анаэробных условий наслаивали вазелиновое масло. Все шесть пробирок поместили в термостат при температуре 37°С и установили наблюдения в тех же параметрах, что описано в примерах 1 и 2.
Результаты исследования представлены в таблице 3, рисунках 10 - а, б и 11 - а, б.
Как видно из таблицы 3, сроки появления первичного роста возбудителя из патологического материала в аэробных и анаэробных условиях происходит через 1 час (рис. 10 а, б; 11 а, б).
Пример 5. ООО «Сот Иле» филиал «Новая Шешма» Ново Шешминского Республики Татарстан в трех отделениях: Азеево, Чертушкино, Тубылгытау общее поголовье 3599 голов крупного рогатого скота черно-пестрой породы.
В отделении ООО «Сот Иле» филиал «Новая Шешма» Азеево содержится всего 1268 голов крупного рогатого скота, из них 648 голов коровы, 43 - нетели, 5 - быки производители, остальное - поголовье молодняка разного возраста. При клиническом осмотре было обнаружено 116 коров и 5 нетелей с различной степенью хроматы, отобрали материал в количестве 5 проб.
В отделении ООО «Сот Иле» филиал «Новая Шешма» Чертушкино находится 656 голов крупного рогатого скота, в том числе 209 коров, 51 - нетель, 6 - быков производителей. При клиническом осмотре всего поголовья выявлены 63 коров и 9 нетелей с различной степенью хроматы, отобрано 2 пробы.
В отделении ООО «Сот Иле» филиал «Новая Шешма» Тубылгытау всего 1675 голов крупного рогатого скота, из всего поголовья 730 коров, 63 - нетели, 5 - быков производителей остальное - поголовье молодняка разного возраста. При клиническом осмотре всего поголовья выявлены 150 коров и 12 нетелей с различной степенью хроматы, патологический материал в количестве 15 проб получен от коров и нетелей.
Посевной материал, доставленный из хозяйства в транспортной питательной среде, после соответствующей предпосевной обработки засевали в шесть пробирок с содержанием испытуемой питательной среды. В целях создания анаэробных условий в три пробирки наслаивали вазелиновое масло и помещали в термостат при температуре 37°С.
Результаты исследования представлены в таблице 4, рисунках 12-а, б и 13-а, б. 
Как видно из таблицы 4, сроки появления первичного роста возбудителя из патологического материала в аэробных и анаэробных условиях происходит в первые минуты после посева, микроскопия - через 4 часа (рис. 12 а, б), а в аэробных условиях - через 3 часа (рис. 13 а, б).
Таким образом, предлагаемый способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза в восемь раз повышает чувствительность бактериологического исследования и сокращает в среднем более чем в пять раз сроки культивирования посевного материала. Предлагаемый способ может быть использован как экспресс-метод диагностики возбудителя некробактериоза.
Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных, заключающийся в том, что культивирование возбудителя некробактериоза животных осуществляют в фильтрате культур стафилококка, который получают путем высева в жидкую питательную среду суточных культур стафилококка, а в качестве питательной среды для выращивания культур стафилококка используют мясопептонный бульон, затем их культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней, инактивируют в водяной бане при температуре 90-95°С в течение 30 мин, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 мин, а полученную надосадочную жидкость отделяют, дополнительно фильтруют через фильтр Зейтца и используют как питательную среду для выявления возбудителя некробактериоза.
