Способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает отбор пробы навоза, гомогенизацию навоза с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Проводят центрифугирование с разделением фаз суспензии. Отцентрифугированную суспензию отстаивают и аликвоту надосадочной жидкости используют для выделения ДНК вируса африканской чумы. ДНК определяют с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентным детектором в режиме реального времени. При обнаружении хотя бы в одной из проб фрагмента генома вируса африканской чумы свиней проводят повторную дезинфекцию всего навоза, содержащегося в навозохранилище. Изобретение позволяет упросить процесс обнаружения вируса африканской чумы свиней. 1 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней.

Известен способ термохимической дезинфекции животноводческих помещений при ликвидации африканской чумы, в котором предварительную механическую очистку помещений и их герметизацию, подачу дезинфицирующего раствора с помощью мобильной газотурбинной установки «Аист-2М» путем распыления дезинфектанта, выдерживание экспозиции обеззараживания, при этом осуществляют герметизацию целлофановой пленкой всего дезинфицируемого корпуса, затем с помощью мобильной газотурбинной установки «Аист-2М» нагревают корпус внутри до температуры не менее 75°C и подают дезинфицирующий раствор 37%-ного раствора формальдегида с температурой не менее 70°C в течение 10-15 мин из расчета 10-15 мл/м³, выдерживают экспозицию обеззараживания в течение трех часов.

К недостаткам данного способа относится невозможность контроля качества дезинфекции животноводческих помещений от вируса африканской чумы свиней, использование в качестве дезинфектанта формалина, канцерогенность которого доказана на животных и человеке, а также применение газотурбинной установки «Аист-2М» с точки зрения ее транспортировки.

Известен способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней, в котором осуществляют выделение ДНК из биологического материала, анализ выделенного ДНК с помощью набора реагентов, обеспечивающих экстракцию нуклеиновых кислот, постановку полимеразной цепной реакции и учет результатов анализа (см. патент РФ 2360971, кл. A61BL 2/16, 2009 г. - прототип).

Недостатком известного способа является невозможность контроля качества дезинфекции животноводческих помещений от вируса африканской чумы, а также значительная трудоемкость процесса и время, затраченное на взятие проб крови или органов животных.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и упрощение процесса обнаружения вируса африканской чумы свиней.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы, включающем выделение ДНК из биологического материала, анализ выделенного ДНК с помощью набора реагентов, обеспечивающих экстракцию нуклеиновых кислот, постановку полимеразной цепной реакции и учет результатов анализа, согласно изобретению в качестве биологического материала используют предварительно продезинфицированный навоз, который произвольно отбирают не менее 10 проб в навозохранилище по краям, в середине и на разной глубине в количестве не более 50 г каждая проба, затем пробы навоза гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере, переносят в пробирки объемом 1,5 мл, центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1-2 мин, отстаивают и аликвоту надосадочной жидкости в дозе не более 0,1 мл используют для выделения ДНК, при этом проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и при обнаружении хотя бы в одной из проб фрагмента генома вируса африканской чумы свиней осуществляют повторную дезинфекцию всего навоза, находящегося в навозохранилище.

Новизна заявляемого способа состоит в идентификации вируса в свином навозе, используемом в качестве биологического материала, что значительно сокращает время забора проб и позволяет контролировать качество дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».

Заявляемый способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней осуществляют следующим образом.

Отбирают пробы предварительно дезинфицированного навоза с помощью пробоотборника в навозохранилище по краям, в середине и на разной глубине массой 50 г каждая, количество - не менее 10. Данная масса каждой пробы необходима для достоверного прохождении анализа, а количество проб зависит от размера и объема хранилища. Затем пробы навоза гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков для проведения наиболее качественной идентификации вируса. После чего для качественного прохождения анализа готовят 10%-ную суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере, специальными дозаторами переносят в пробирки объемом 1,5 мл, изготовленные специально для центрифуги. Далее пробы подвергают центрифугированию при 12 тыс. об/мин в течение 1-2 мин, так как при меньшем времени центрифугирования не произойдет необходимого разделения фаз суспензии, а большее время центрифугирования нецелесообразно. Затем аликвоту надосадочной жидкости отстаивают и используют в дозе, необходимой для качественного исследования - не более 0,1 мл, при анализе с помощью набора реагентов «ПЦР-АЧС-ФАКТОР» http://faktor.ru/catalog/veterinasriya/produktsiaya/ptsr_asf_faktor/.ru. Анализ проводят в три этапа: экстракция нуклеиновых кислот, проведение полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, учет результатов анализа.

Пример конкретного осуществления способа

Контроль качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней осуществляют в навозохранилище ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», в котором навозную жижу заранее дезинфицируют в соответствии с «Инструкцией о мероприятиях по предупреждению и ликвидации африканской чумы свиней» (№115-6а от 21.11.1980 г.): навозную жижу в жижесборнике смешивают с сухой хлорной известью (с содержанием активного хлора не менее 25%) из расчета 1,5 кг извести на каждые 10 л навозной жижи. Навоз в навозохранилище посыпают с поверхности сухой хлорной известью из расчета 0,5 кг/м², затем перемещают в траншею и закапывают на глубину 1,5 м. Далее с помощью пробоотборников в середине, по краям навозохранилища, и на разной глубине навозной массы, берут 10 проб по 50 г. После чего с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков навоз из проб гомогенизируют и готовят из него 10%-ную суспензию на стерильном физиологическом растворе, после чего полученную суспензию переносят в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1,5 мин. Отцентрифугированную суспензию отстаивают и аликвоту надосадочной жидкости используют в дозе 0,1 мл для выделения ДНК вируса африканской чумы свиней при проведении полимеразной цепной реакции с флуоресцентным детектором в режиме реального времени.

Устанавливают пробирки в реакционный модуль прибора «Rotor-Gene 3000/6000» (Q), в котором осуществляют полимеразную цепную реакцию с флуоресцентным детектором в режиме реального времени. В соответствии с протоколом анализа прибор программируют, устанавливают параметры температурно-временного режима амплификации, детекцию флуоресцентного сигнала назначают после стации отжига праймеров, после чего начинают процесс амплификации с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. В его основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов полимеразной цепной реакции непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

Учет результатов полимеразной цепной реакции проводят по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Образец считают положительным (вирус африканской чумы свиней присутствует), если наблюдают рост специфического сигнала, при этом значения контрольных образцов находятся в пределах нормы. Образец считают отрицательным (вирус африканской чумы свиней отсутствует), если не наблюдают рост специфического сигнала, при этом значения контрольных образцов находятся в пределах нормы.

При обнаружении хотя бы в одной из проб фрагмента генома вируса африканской чумы свиней проводят повторную дезинфекцию всего навоза, содержащегося в навозохранилище.

Таким образом, способ контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней, позволяющий идентифицировать вирус в пробах навоза, расширяет функциональные возможности и позволяет следить за качеством дезинфекции животноводческих помещений от вируса африканской чумы свиней.

Способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней, включающий выделение ДНК из биологического материала, анализ выделенного ДНК с помощью набора реагентов, обеспечивающих экстракцию нуклеиновых кислот, постановку полимеразной цепной реакции и учет результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют предварительно продезинфицированный навоз, который произвольно отбирают не менее 10 проб в навозохранилище по краям, в середине и на разной глубине в количестве не более 50 г каждая проба, затем пробы навоза гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере, переносят в пробирки объемом 1,5 мл, центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1-2 мин, отстаивают и аликвоту надосадочной жидкости в дозе не более 0,1 мл используют для выделения ДНК, при этом проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и при обнаружении хотя бы в одной из проб фрагмента генома вируса африканской чумы свиней осуществляют повторную дезинфекцию всего навоза, находящегося в навозохранилище.