Способ диагностики болезни паркинсона

Авторы патента:

Дубина Михаил Владимирович (RU)

Андоскин Павел Александрович (RU)

Якимовский Андрей Фёдорович (RU)

Милюхина Ирина Валентиновна (RU)

Сенкевич Константин Алексеевич (RU)

Емельянов Антон Константинович (RU)

Пчелина Софья Николаевна (RU)

Тимофеева Алла Аркадьевна (RU)

Николаев Михаил Андреевич (RU)

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Владельцы патента RU 2657763:

Сенкевич Константин Алексеевич (RU)
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики болезни Парксинсона. Для этого проводят забор периферической крови, выделяют однородную фракцию CD45+ клеток с лизированием выделенной клеточной фракции. В лизате CD45+ клеток измеряют концентрацию олигомерного альфа-синуклеина и при концентрации более 2,7 пг/мл диагностируют болезнь Паркинсона. Изобретение позволяет диагностировать болезнь Паркинсона, а также формировать группы риска среди лиц с отсутствием неврологических расстройств. 3 пр., 1 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики болезни Паркинсона (БП).

БП - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера. На сегодняшний день ключевым звеном в патогенезе БП считается накопление и агрегация пресинаптического белка альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах черной субстанции головного мозга, приводя к их гибели и развитию характерной симптоматики.

Было показано статистически значимое повышение олигомерного альфа-синуклеина плазмы крови пациентов с болезнью Паркинсона по сравнению с индивидуумами контрольной группы (p<0,002) (El-Agnaf ОМ, Salem SA, Paleologou KE, Curran MD, Gibson MJ, Court JA, Schlossmacher MG, Allsop D. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. // FASEB J. – 2006. - №20(3). - P. 419-25.). Однако позднее показано отсутствие различий в уровне олигомерного альфа-синуклеина плазмы крови при сравнении группы пациентов с БП и контроля (Foulds PG, Mitchell JD, Parker A, Turner R, Green G, Diggle P, Hasegawa M, Taylor M, Mann D, Allsop D. Phosphorylated α-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. // FASEB J. – 2011. - №25 (12). - P. 4127-37).

Противоречивость полученных результатов может быть обусловлена контаминацией олигомерным альфа-синуклеином целевых образцов плазмы крови в результате как внутреннего физиологического гемолиза эритроцитов, так и внешнего, связанного с процедурой забора материала. Это является существенным ограничением в применимости используемых в указанных исследованиях подходов, поскольку искажение конечных результатов может быть существенным в связи с тем, что содержание альфа-синуклеина в эритроцитах во много раз превышает его содержание в других фракциях клеток крови. Кроме того, используемые в указанных выше исследованиях методики по оценке олигомерного альфа-синуклеина не показали диагностической значимости по причине низкой чувствительности и специфичности.

Известно исследование (П.А. Андоскин, Емельянов, М.А. Николаев, К.А. Сенкевич, В.П. Шилин, А.А. Тимофеева, А.Ф. Якимовский, С.Н. Пчелина. Влияние дофамина плазмы на уровень альфа-синуклеина CD45+ клеток крови при болезни Паркинсона. // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Том XXII. №2. – 2015. - С. 14-17), в котором в качестве биомаркера БП рассматривался общий альфа-синуклеин гомогенной фракции клеток крови, полученной методом магнитного сортинга, а именно - CD45+ клеток, экспрессирующих основные белки дофаминергической нейротрансмиссии и, таким образом, отражающих процессы метаболизма альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах. При оценке уровня общего альфа-синуклеина в CD45+ в клетках крови был обнаружен более высокий уровень у пациентов с БП (n=14) по сравнению с пациентами контрольной группы (n=17) (p=0,04). Однако при расширении исследуемых групп различий в уровне общего альфа-синуклеина между группой пациентов с БП (n=43) и контрольной группой (n=39) не получено (p=0,28) (Емельянов А.К., Андоскин П.А., Милюхина И.В., Тимофеева А.А., Якимовский А.Ф., Сенкевич К.А., Николаев М.А., Пчелина С.Н. Ассоциация rs356219 и rs356165 с Болезнью Паркинсона и повышенной экспрессией гена альфа-синуклеина в CD45+ клетках. // Цитология, 2016. - N 2. - С. 99-104.).

Технический результат заявленного изобретения заключается в создании способа диагностики БП, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью.

Заявленный технический результат достигается тем, что в способе диагностики болезни Паркинсона, включающем забор периферической крови, выделение однородной фракции CD45+ клеток и лизирование выделенной клеточной фракции, в лизате CD45+ клеток измеряют концентрацию олигомерного альфа-синуклеина и при концентрации более 2,7 пг/мл диагностируют болезнь Паркинсона.

Способ разработан на основе проведенного исследования уровня олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках в группе пациентов с вновь диагностированной БП, не получавших лечения Л-ДОФА-содержащими препаратами (N=29, 12 муж., 17 жен., сред. возр. 61,11±7,20), по сравнению с соответствующей по возрасту и полу контрольной группой лиц, не имеющих неврологических расстройств (N=25, 11 муж., 14 жен., сред. возр. 59,56±8,01).

При анализе концентрации олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках периферической крови (медиана (мин-макс), пг/мл), в группе пациентов с БП (3,29 (1,38-8,27), пг/мл) по сравнению с контрольной группой (2,014 (1,48-3,39), пг/мл) было установлено статистически значимое повышение уровня олигомерного альфа-синуклеина (p<0,0001).

Для оценки возможности использования уровня олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках в клинической практике, а именно для подтверждения диагноза БП, а также формирования групп риска среди лиц с отсутствием неврологических расстройств с повышенным уровнем олигомерного альфа-синуклеина в клетках, был проведен ROC-анализ с целью установления порога концентрации вышеуказанной формы белка. Точка отсечения концентрации олигомерного альфа-синуклеина составила 2,7 пг/мл. Чувствительность метода составила 69,0% (95% доверительный интервал 50,77-82,72%), специфичность метода - 91,7% (95% доверительный интервал 74,15-97,68%), индекс точности метода составил: 79,63%, площадь под ROC-кривой составила 0,84. Полученные данные позволили установить критерий диагностики БП.

На фигуре графически представлен уровень олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках периферической крови в группе пациентов с БП и контрольной группе.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Забор крови у пациентов проводят из вены в пробирку объемом 9 мл с ЭДТА. Выделение лимфоцитарной фракции периферической крови производят путем центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare). С целью получения фракции CD45+ клеток осуществляют магнитную сепарацию лимфоцитарной фракции путем смешивания с магнитными микрочастицами (CD45+ MicroBeads, human, Miltenyi Biotec, США), с дальнейшим использованием магнитного ручного сепаратора MACS (Miltenyi Biotec, США) и колонок для сортинга miniMACS типа MS (Miltenyi Biotec, США). В результате получают однородную фракцию CD45+ клеток крови, которую далее замораживают и хранят при температуре -80°C до выполнения иммуноферментного анализа (ИФА).

Перед выполнением ИФА осуществляют лизис CD45+ клеток крови с использованием набора Total Protein Extraction Kit (Chemicon (Millipore), США) согласно прилагаемой инструкции. Измерение уровня общего белка в клеточных лизатах проводят с использованием набора Pierce ВСА Protein Assay kit (Thermo Scientific, США) согласно прилагаемой инструкции. Для проведения ИФА могут быть использованы образцы клеточных лизатов с концентрацией общего белка 30-60 мкг. Определение концентрации олигомерного альфа-синуклеина в исследуемых образцах проводят на основе метода ИФА с использованием набора Human alpha-synuclein РАТНО ELISA (ajRoboscreen, Германия). В данном наборе используются моноклональные антитела 5G4, которые специфично связываются с олигомерным альфа-синуклеином, имеющим конформацию бета-складчатого листа. С целью построения стандартной кривой используют соответствующие разведения входящих в набор стандартов олигомеров альфа-синуклеина согласно инструкции. Аналитическая чувствительность вышеуказанного набора составляет 250-0,05 пг/мл. Концентрацию олигомерного альфа-синуклеина определяют путем детекции хемилюминесценции на планшетном спектрофлюориметре. При концентрации более 2,7 пг/мл диагностируют болезнь Паркинсона.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

1. Пациент 65 лет, со слов - отмечал смешанный тремор (покоя и постурально-кинетический) в левой руке более 10 лет, без нарастания характера, принимал пропанолол без выраженного эффекта, в течение последнего года появился тремор покоя с элементами постурально-кинетического в правой руке. Пациент также указал на изменение почерка, появление некоторой скованности, неловкости, замедленности движений в правой руке.

У пациента был осуществлен забор периферической крови, методом магнитного сортинга выделена однородная фракция CD45+ клеток, в лизате CD45+ клеток измерена концентрация олигомерного альфа-синуклеина.

Концентрация белка составила 4,2 пг/мл, что свидетельствует о диагнозе БП. На основании полученных данных врачом-неврологом назначена дофаминергическая терапия, при повторном осмотре через 1 месяц отмечается положительная динамика, уменьшение интенсивности тремора, снижение скованности.

2. Пациент 43 лет, со слов пациента - отмечает скованность и легкий тремор покоя в правой руке в течение последних двух лет, также появились болевые ощущения в шейной области справа, элементы выраженного поворота головы вправо. С учетом выявленных клинических признаков необходимо было провести дифференциальный диагноз между дистонией и БП.

Концентрация белка составила 1,2 пг/мл, что является нормой. На основании полученных данных врачом-неврологом проведена инъекция ботулотоксина в шейную область, симптоматика полностью купировалась.

3. Пациентка 54 лет, с отягощенным анамнезом, мать больна БП, у тети тремор, к врачу не обращалась. В течение последних 5 лет отмечает появление запоров, незначительное снижение обоняния за последние несколько месяцев. Пациентке проведена генетическая диагностика, выявлена мутация G2019S в гене LRRK2. С учетом выявленного отягощенного анамнеза и известных данных о неполной пенетрантности в гене LRRK2 нельзя исключить премоторную стадию БП.

У пациентки был осуществлен забор периферической крови, методом магнитного сортинга выделена однородная фракция CD45+ клеток, в лизате CD45+ клеток измерена концентрация олигомерного альфа-синуклеина.

Концентрация белка составила 5,5 пг/мл, что свидетельствует о диагнозе БП. На основании полученных данных врачом-неврологом поставлена премоторная стадия БП, пациентке даны рекомендации по модификации образа жизни, рекомендован амбулаторный осмотр врачом неврологом 1 раз в 12 месяцев.

Заявленный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью, что позволяет устанавливать диагноз БП, а также формировать группы риска среди лиц с отсутствием неврологических расстройств.

Способ диагностики болезни Паркинсона, включающий забор периферической крови, выделение однородной фракции CD45+ клеток и лизирование выделенной клеточной фракции, отличающийся тем, что в лизате CD45+ клеток измеряют концентрацию олигомерного альфа-синуклеина и при концентрации более 2,7 пг/мл диагностируют болезнь Паркинсона.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии в педиатрии, детской гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики Ig Е-независимой пищевой аллергии.

Способ и набор для иммунологической детекции комплекса mycobacterium tuberculosis // 2657581

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включает иммунологический анализ специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, где внеклеточную секрецию указанного белка осуществляют посредством термической обработки биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, при 45-50°C в течение от 15 до 60 минут.

Способ обследования детей с дистрофической формой врожденного буллезного эпидермолиза // 2657542

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано при обследовании и ведении детей с дистрофической формой буллезного эпидермолиза для своевременной диагностики пищевой аллергии.

Анализ адромедуллина и способы определения зрелого адромедуллина // 2657517

Изобретение касается способа in vitro контроля терапии у пациентов, у которых подозревают наличие сепсиса. Сущность способа: концентрацию зрелого адромедуллина (ADM) 1-52 амида и/или зрелого ADM 1-52-Gly в образце биологической жидкости указанного пациента с сепсисом определяют, используя иммунологический анализ с применением комбинации двух связующих, которые выбраны из группы, состоящей из антитела к ADM и/или фрагмента антитела к ADM, и которые связывают две различные области в пределах области зрелого ADM 1-52 амида и/или ADM 1-52-Gly, которая представляет собой аминокислотный 21-52-амид (SEQ ID No.

Способ диагностики вирусной инфекции при эндометрите // 2657436

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, патологической анатомии, и может быть использовано врачами-акушерами-гинекологами, патологоанатомами для диагностики этиологического фактора хронического эндометрита и стадии воспалительного процесса.

Способ прогнозирования задержки формирования плаценты и развития эмбриона при обострении цитомегаловирусной инфекции, подавляющей активность сосудисто-эндотелиального фактора и развития эмбриона // 2657429

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве способа прогнозирования задержки формирования плаценты и развития эмбриона при обострении цитомегаловирусной инфекции, подавляющей активность сосудисто-эндотелиального фактора и развитие эмбриона.

Способ диагностики хронического необструктивного бронхита // 2657426

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, иммунологии, профпатологии, и может быть использовано для диагностики хронического необструктивного бронхита (ХНБ).

Способ прогнозирования риска озлокачествления узловых образований у больных с эндокринологическими заболеваниями // 2657417

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска озлокачествления узловых образований у больных с эндокринологическими заболеваниями.

Способ прогнозирования уровня сердечно-лодыжечного сосудистого индекса у больных сахарным диабетом 2 типа в сочетании с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца // 2656535

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования уровня сердечно-лодыжечного сосудистого индекса у больных диабетом 2 типа в сочетании с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца.

Антитела, специфичные к альфа-энолазе, и способы применения в противоопухолевой терапии // 2656153

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело против альфа-энолазы (ENO1), а также его scFv- и Fab-фрагмент.

Способ определения индекса фрагментации днк сперматозоидов у животных-производителей // 2657609

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей. Осуществляют подготовку мазка спермопробы к окрашиванию и приготовление красителя смешиванием раствора лимонной кислоты, гидрофосфата натрия и 1%-го акридин оранжевого.

Способ и набор для иммунологической детекции комплекса mycobacterium tuberculosis // 2657581

Способ предотвращения заболевания шахтера антракосиликозом // 2657560

Изобретение относится к медицине, а именно к профболезням, и может быть использовано для предотвращения заболевания шахтера антракосиликозом. Для этого в забое проводят отбор углепородных проб по сечению забоя бороздами, измеряют запыленность рудничного воздуха во время работы горной машины по разрушению углепородного массива, дополнительно отбирают пробы воздуха в рабочей зоне машины и устанавливают в нем дисперсный состав кремниевой пыли, при этом опасность заболевания шахтера антракосиликозом устанавливают по стажу работы в запыленном кремниевыми частицами воздухе и количеству поглощенной его легкими опасной для здоровья тонкодисперсной кремниевой пыли.

Способ прогнозирования результата дентальной имплантации // 2657442

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для прогнозирования осложнений дентальной имплантации. Для этого при подготовке пациента к дентальной имплантации в его слюне определяют содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов и при их значении более 0,015 прогнозируют неблагоприятный результат дентальной имплантации.

Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием // 2657433

Изобретение относится к области медицины, а именно к репродуктивной медицине, и может быть использовано для оценки риска невынашивания беременности. Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием, отличающийся тем, что у пациентки определяют цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови в секреторной фазе менструального цикла в отношении клеток трофобласта линии Jeg-3 по формуле: ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ, где ЦЭпац - цитотоксическая активность NK-клеток у пациентки, %; СЦЭпац - средняя цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта; СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте; оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта, где: СБГэксп={(Хн/Xобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+(Хн/Хобщ)n}×100%/n, где Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; n - количество повторов; СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}×100%/n, где Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке; Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови; n - количество повторов.

Способ прижизненной диагностики микобактериозов крупного рогатого скота // 2657430

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии и иммунологии. Способ прижизненной диагностики микобактериозов крупного рогатого скота включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции в сыворотке от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, при этом в качестве основного индуктора хемилюминесценции используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий.

Способ диагностики и/или прогноза острого повреждения почек // 2657422

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ диагностики и/или определения у субъекта предрасположенности к развитию острого повреждения почек, включающий определение уровня экспрессии по меньшей мере miR-26b и сравнение указанного уровня экспрессии с контрольным значением, где снижение экспрессии является показателем острого повреждения почек или предрасположенности к развитию острого повреждения почек.

Коэффициент диффузии площади контакта для количественного определения содержания жиров в жидкости // 2657304

Изобретение относится к области измерительной техники и может быть использовано для измерения содержания жиров в жидкости. В настоящем изобретении предлагается способ определения присутствия жиров в телесной жидкости путем фотографирования капли телесной жидкости и расчета изменения площади контакта капли телесной жидкости и коэффициента диффузии площади контакта.

Способ ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов и средство для ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов // 2656216

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов, а также представляющее собой биосовместимую двойную эмульсию вода-масло-вода средство для ультравысокопроизводительного скрининга клеток или микроорганизмов.

Способ проведения бактериологического исследования при хирургическом лечении послеоперационного эндофтальмита с учетом этиологии заболевания // 2655801

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для проведения бактериологического исследования интраокулярного содержимого. Для проведения бактериологического исследования при хирургическом лечении послеоперационного эндофтальмита с учетом этиологии заболевания проводят раннюю витрэктомию с забором интраокулярного содержимого.

Способ прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках в программе экстракорпорального оплодотворения // 2657769

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). На основании анализа уровня экспрессии мРНК гена PFKP в кумулюсных клетках определяют вероятность наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества по формуле. При значениях р выше 0,5 прогнозируют наличие хромосомных аномалий в данной группе эмбрионов. Изобретение обеспечивает создание модели предсказания наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании анализа транскрипционной активности в кумулюсных клетках у пациенток при лечении бесплодия в программе ЭКО. 1 табл., 3 пр.