Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных



Владельцы патента RU 2662080:

Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" (RU)

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных, заключающийся в связывании генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1%-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов. Изобретение обеспечивает возможность повышения эффективности оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных, путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой. 1 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для отбора зрелых генетически полноценных сперматозоидов и удалении из эякулята неполноценных форм.

Существует множество способов отбора полноценных сперматозоидов, основанных, в частности, на их подвижности: метод swim-up (всплытия), основанный на способности сперматозоидов всплывать в более верхние слои питательной среды, метод центрифугирования в градиенте плотности, основанный на способности живых сперматозоидов проходить сквозь градиент силиконовых частиц, отбор и отсеивание апоптозных клеток (сортировка на магнитной ячейке и стекловате), сортировка клеток по поверхностному заряду (электрофорез и ψ-потенциал), морфологический отбор с помощью ультрамикроскопии [1].

При экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) в методе ПИКСИ (Physiologic ICSI) селективным фактором для «физиологического отбора» полноценных сперматозоидов человека выступает гиалуроновая кислота. Многочисленные исследования показали, что сперматозоиды, имеющие в клеточной мембране рецепторы, обладающие высоким сродством к гиалуроновой кислоте, обладают целостной ДНК, низким уровнем остаточных гистонов и сниженным уровнем анеуплоидии, что положительно сказывается на качестве полученных эмбрионов и частоте наступления беременности [2-3].

Однако метод ПИКСИ применяется для отбора единичных полноценных сперматозоидов человека, является дорогостоящим, а также не подходит для применения в искусственном оплодотворении у сельскохозяйственных животных.

Технический результат заключается в повышении эффективности оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных, путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных путем связывания генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1%-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов.

Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных (хряков) осуществляется следующим образом. Для поддержания физиологического статуса сперматозоидов исследование проводят при температуре 37°C. Первоначально готовят 1%-ную высокомолекулярную гиалуроновую кислоту. Для ее приготовления необходимо взвесить 100 мг гиалуроновой кислоты с молекулярным весом не менее 500 кДа и добавить навеску к 10 мл подогретой до 40°C дистиллированной воды, постоянно перемешивая. После полного растворения гиалуроновой кислоты и образования текучего геля добавляют 2-3 мл геля в опытные емкости, имеющие объем 50 мл, покрывая их дно слоем толщиной 3-4 мм. Оставляют сформированные емкости на 3 час при комнатной температуре для подсушки слоя высокомолекулярной гиалуроновой кислоты.

На следующим этапе эякулят хряков в пакетах объемом 100 мл переливают в 2 пробирки по 50 мл, затем отбирают небольшую аликвоту для контрольной оценки концентрации и подвижности сперматозоидов. Центрифугируют пробирку с эякулятом в течение 10 мин при 1000 об/мин, затем большую часть супернатанта (около 80 мл) сливают. В остаточном объеме, включающим осадок сперматозоидов, общим объемом 20 мл подсчитывают концентрацию сперматозоидов с помощью камеры Горяева. Концентрированный эякулят помещают в опытную емкость с гиалуроновой кислотой и инкубируют в термостате при 37°C в течение 30 мин, периодически помешивая. Затем сливают супернатант с не прикрепившимися к иммобилизованной гиалуроновой кислоте незрелыми и имеющими генетические дефекты сперматозоидами. Добавляют в опытную емкость устройства для отбора генетически полноценных сперматозоидов 20 мл элюирующего раствора (среда для разбавления сперматозоидов), подогретого до 37°C, помещают емкость в шейкер и встряхивают в течение 10 мин для отделения сперматозоидов от иммобилизованной гиалуроновой кислоты.

Подсчитывают в отобранной фракции эякулята, включающего генетически полноценные сперматозоиды с высоким оплодотворяющим потенциалом, концентрацию сперматозоидов и оценивают подвижность. В случае если концентрация сперматозоидов составит 60 и более млн/мл, а общая подвижность сперматозоидов повысилась, переливают эякулят, содержащий генетически полноценные сперматозоиды с высоким оплодотворяющим потенциалом, в стерильную тубу для спермы объемом 100 мл, добавляют среду для разбавления в объеме 50 мл и запаивают тубу.

Оценку генетической полноценности сперматозоидов в отобранной аликвоте проводят с помощью комплекса методик, позволяющих оценить структурно-функциональные изменения ядра и хроматина, одноцепочечные разрывы ДНК, уровень процессов перекисного окисления липидов [4].

При оценке генетической полноценности сперматозоидов используют методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258, определяют фрагментацию ДНК методом Гало, анализируя интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [5-7].

Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л).

Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.

Селекция сперматозоидов по признаку рецептор-опосредованного связывания с иммобилизованной гиалуроновой кислотой позволяет получать фракцию сперматозоидов, имеющих минимальное количество генетических и морфологических нарушений, высокоподвижных с высоким оплодотворяющим потенциалом, и использовать ее для искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. Сперматозоиды, способные связываться с гиалуроновой кислотой, характеризуются отсутствием первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, низкой интенсивностью процессов перекисного окисления липидов. При выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15%, достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные.

Таким образом, разработка способа массового отбора сперматозоидов сельскохозяйственных животных, основанного на рецептор-опосредованном связывании с иммобилизованной гиалуроновой кислотой является обоснованной и актуальной, поскольку данная биотехнология отбора позволит селектировать генетически полноценные сперматозоиды и тем самым повысить эффективность искусственного оплодотворения у животных и использовать для осеменения только зрелые сперматозоиды, обладающие высоким оплодотворяющим потенциалом.

Способ заключается в имитации природного явления аффинного взаимодействия зрелых и генетически полноценных сперматозоидов, имеющих в клеточной мембране, экспонированные наружу рецепторы с гиалуроновой кислотой, являющейся компонентом клеточной мембраны яйцеклетки. Зрелые и генетически полноценные сперматозоиды имеют на своей мембране рецепторы, связывающиеся с мономерными остатками гиалуроновой кислоты [8-9]. Если мембрана сперматозоида незрелая или в ней имеются структурно-функциональные нарушения, то связывание с гиалуронатом не происходит или сильно затруднено.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой.

Источники информации

1. Said Т.М., Land J.A. Effects of advanced selection methods on sperm quality and ART outcome: a systematic review // Hum Reprod Update., 2011, 17, pp. 719-733.

2. Huszar G., Ozenci C.C., Cayli S. et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status // Fertil Steril., 2003, 79, pp. 1616-1624.

3. Parmegiani L., Cognigni G.E., Bernardi S. et al. "Physiologic ICSI": hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality // Fertil Steril., 2010, 93, pp. 598-604.

4. RU 2568845, МПК G01N 33/48, опубл. 20.11.2015.

5. Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1H NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39.

6. Fernandez J.L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66.

7. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, PP. 515-540.

8. Redgrove K.A., Anderson A.L., McLaughlin E.A. et al. Investigation of the mechanisms by which the molecular chaperone HSPA2 regulates the expression of sperm surface receptors involved in human sperm-oocyte recognition // Mol Hum Reprod. 2013, 19, PP. 120-35.

9. Huszar G., Stone K., Dix D. et al. Putative creatine kinase M-isoform in human sperm is identified as the 70-kilodalton heat shock protein HspA2 // Biol Reprod., 2000, 63, pp. 925-932.

Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных, заключающийся в связывании генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1%-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, в частности к стоматологии/детской стоматологии и микробиологии/бактериологии, и может быть использовано для неспецифической профилактики и входить в комплексное лечение кариеса молочных зубов воздействием на кариесогенные S.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для диагностики тяжелых форм псориаза у взрослых. Для этого определяют скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита, при ее значении не меньше 420 мкМ лития/литр клеток/час дополнительно проводят оценку степени тяжести заболевания по индексу PASI, определяют количество фибриногена в плазме крови, сопоставляют результаты всех обследований и при значении количества фибриногена в плазме крови 3,5 г/л и выше однозначно диагностируют тяжелую форму псориаза.

Изобретение относится к области медицины - стоматология/детская стоматология и микробиология/бактериология, и может быть использовано для определения титра кариесогенных бактерий S.

Изобретение относится к обнаружению аналитов в биологических жидкостях. Способ определения концентрации глюкозы в крови с помощью системы измерения глюкозы включает вставку тест-полоски в разъем порта полоски измерительного прибора; инициирование последовательности измерения после нанесения образца, при этом инициирование содержит: приложение первого напряжения, близкого к потенциалу земли, к измерительной камере в течение первого промежутка времени; приложение второго напряжения к измерительной камере в течение второго промежутка времени; изменение второго напряжения на третье напряжение, отличное от второго напряжения, на третий промежуток времени; переключение третьего напряжения на четвертое напряжение, отличное от третьего напряжения, на четвертый промежуток времени; смену четвертого напряжения на пятое напряжение, отличное от четвертого напряжения, на пятый промежуток времени; модифицирование пятого напряжения на шестое напряжение, отличное от пятого напряжения, на шестой промежуток времени; изменение шестого напряжения на седьмое напряжение, отличное от шестого напряжения, на седьмой промежуток времени, причем второе напряжение представляет собой напряжение, противоположное по полярности третьему, пятому и седьмому напряжениям и одинаковое по полярности с четвертым и шестым напряжениями, измерение по меньшей мере одного из: первого выходного переходного сигнала тока от измерительной камеры во время первого интервала, проксимального второму и третьему промежуткам времени; второго выходного переходного сигнала тока во время второго интервала, проксимального четвертому и пятому промежуткам времени; третьего выходного переходного сигнала тока во время третьего интервала, проксимального пятому и шестому промежуткам времени; четвертого выходного переходного сигнала тока во время четвертого интервала, проксимального шестому и седьмому промежуткам времени; и пятого выходного переходного сигнала тока во время пятого интервала, близкого к концу седьмого промежутка времени; вычисление концентрации глюкозы в образце исходя из по меньшей мере одного из первого, второго, третьего, четвертого или пятого выходных сигналов тока.

Изобретение относится к области медицины, а именно к профилактической медицине. Способ прогнозирования значений относительной концентрации гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови через 4-5 лет у стажированных работающих в условиях экспозиции винилхлоридом без признаков патологии заключается в том, что определяют уровень гамма-глутамилтрансферазы, альбумина и относительного содержания липопротеидов высокой плотности, рассчитывают прогнозируемое значение относительного содержания концентрации гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови по формуле: У=620,9241+0,5718×ГГТ1-16,832×АЛЬБ1-05181×ЛПВП1+0,1195×АЛЬБ12, где У - прогнозируемое значение относительной концентрации ГГТ в сыворотке крови, 620,9241 - константа; 0,5718; -16,832; -0,5181; 0,1195 - коэффициенты предикторов; ГГТ1 - уровень гамма-глутамилтрансферазы на момент обследования (Е/мл); АЛЬБ1 - содержание альбумина в сыворотке крови на момент обследования (%), ЛПВП1 - содержание липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови на момент обследования (%).

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии. Способ оценки перекисного гомеостаза организма кроликов включает введение самцам и самкам кроликов антиоксидантного препарата «Окси-Нил драй» на ранних стадиях постнатального онтогенеза в одинаковых дозах по 300 мг/кг корма, подготовку биологического материала, исследования общеклинических и биохимических показателей крови, определение физиологических параметров организма в динамике пола и возраста; в качестве маркеров определены активность основных антиоксидантных ферментов и концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в плазме крови, совокупно позволяющие судить о глубине активации перекисного окисления липидов, при этом если суммарное накопление продуктов перикисного окисления липидов превышает общую активность ферментативного звена, то организм находится в состоянии окислительного стресса, если наоборот - то в состоянии активированной компенсации.

Изобретение относится к молекулярной онкологии и представляет собой способ прогнозирования метастазов в регионарные лимфоузлы при аденокарциноме желудка, отличающийся тем, что осуществляют амплификацию фрагментов локусов В2М, NFKB1 и HER2 NFKB1 и HER2 методом ПЦР в реальном времени, рассчитывают относительную копийность генов по формуле rC=rCопухоль/rCнорма=2-ΔCt(опухоль/2-ΔCt(норма), где rC - относительная копийность гена, ΔCt - разность среднего значения сигналов флюоресценции (Ct) по трем повторам для гена мишени и среднего Ct по трем повторам для референсного гена: ΔCt=Ct(ген мишень)-Ct(B2M), осуществляют иммуногистохимическое исследование на срезах парафиновых блоков с помощью моноклональных антител к Ki67 и HER2, и при значениях rCNFKB1<0,8±0,02 и rCHER2<1,1±0,08 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki67игх<35,6±6,1 и негативной экспрессией HER2игх(-) прогнозируют отсутствие метастазов, а при значениях rCNFKB1>0,9±0,01 и rCHER2>2,0±0,1 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki67игх>54,2±4,9 и позитивной экспрессией HER2игх (+++) прогнозируют развитие метастазов.

Группа изобретений относится к области анализа, в частности к аппаратам разжижения и фильтрации для получения раствора для анализа кала. Аппарат для разжижения и фильтрации содержит компонент для отбора проб, верхнюю крышку и корпус пробоотборной трубки.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к способу прогнозирования резистентности к инфекционному некрозу поджелудочной железы у лосося и способу отбора лосося для использования в качестве производителя.

Изобретение относится к способу обнаружения пациентов с подозрением на болезнь Альцгеймера (AD) или умеренные когнитивные нарушения (MCI) in vitro, включающему сравнение уровня экспрессии изоформы тропомиозина Р09493-3 в образце от пациента с контрольным значением, где увеличение уровня экспрессии Р09493-3 является показателем AD или MCI.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и биомедицины, а именно к способу получения эритроцитов, а также способу получения препарата крови. К настоящему изобретению также относятся препараты клеток для получения эритроцитов, замороженные препараты популяций клеток для получения эритроцитов и набор для получения вышеуказанных препаратов клеток.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению сфероидов клеток HepaRG, экспрессирующих цитохромы Р450 3А4, 2В6, 2С19, 2С9. Способ включает культивирование клеток HepaRG в полной питательной среде William’s E с добавлением L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки, 5 мкг/мл рекомбинантного инсулина человека, 5х10-5 М гидрокортизона гемисукцината, 1% пенициллина/стрептомицина, в СО2-инкубаторе при 37°C, 95% воздуха, 5% CO2 и относительной влажности 98%, индукцию.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии. Перед эндоваскулярным этапом лечения, включающим эндоваскулярную коронарную ангиопластику и стентирование инфаркт-связанной артерии, у пациента осуществляют забор костного мозга в количестве 120-140 мл из области рукоятки грудины и области передневерхней ости подвздошной кости.

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано в лабораторной диагностике туберкулеза легких. Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого заключается в добавлении к образцу ткани легкого, находящемуся в пробирке, содержащей стеклянные шарики, деконтаминирующего лизирующего буфера состава 5 М GuSCN, 100 мМ TRIS HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0,5% SDS, с последующими центрифугированием и осаждением спиртом.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к способам получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включения экспрессии и индуцирования PDX1, NKX6.1 и HB9.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у млекопитающего, исключая человека, способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у собаки и способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у кошки.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использована для лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использована при вспомогательной репродукции для профилактики неудачного исхода имплантации в матку самки млекопитающего.

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки, отличающийся тем, что лабораторным животным проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генетически-модифицированным TCR-дефицитным Т-клеткам, и может быть использовано в медицине для лечения рака.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии. Выполняют стимуляцию суперовуляции, пункцию фолликулов, выделение из фолликулярной жидкости ооцитов, оплодотворение ооцитов, культивирование эмбрионов, перенос 1-2 эмбрионов в полость матки.

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных, заключающийся в связывании генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов. Изобретение обеспечивает возможность повышения эффективности оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных, путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой. 1 пр.

Наверх