Способ клонального микроразмножения алычи in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету. Изобретение позволяет повысить эффективность производства корнесобственных микрорастений. 4 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности плодоводству, и может быть использовано для оздоровления и микроразмножения растений алычи in vitro.

В современном сельском хозяйстве широко используются достижения биотехнологии растений для получения оздоровленного быстрорастущего посадочного материала. Для этого используют способ клонального микроразмножения растений.

Род Слива (Prunus sp.) включает в себя около 40 видов, таких как слива домашняя (P. domestica), абрикос (P. armeniaca), персик (P. persica), миндаль (P. dulcis), лавровишня (P. laurocerasus) и алыча гибридная (или слива русская - P. rossica). Несмотря на близкое родство этих видов способы их размножения в культуре in vitro имеют значительные различия. Из-за того, что алыча гибридная - молодая плодовая культура, проведено мало работ по размножению ее в культуре in vitro.

Известен способ размножения плодовых деревьев, в частности персика, «Rapid Recovery of Shoots through Thin Stem Slices after Preconditioning of Micropropagated Fruit Tree Shoots» (патент США №6127182). Он включает подготовку эксплантов, культивирование их на подходящей среде для получения побегов, деление стеблей на тонкие поперечные срезы (1 мм и тоньше), культивирование их на среде до получения побегов. Основным недостатком данного способа размножения является то, что получаемые побеги образуются de novo. Это значительно увеличивает риск сомаклональных изменений, влекущих за собой потерю сортовых качеств.

Наиболее близким техническим решением из известных является «Оптимизация этапов клонального микроразмножения при массовом производстве растений» (Лебедев В.Г. с соавт. // Плодоводство и ягодоводство России. 2011, т. 26, с. 307-314). В нем на этапе мультипликации культивирование проводится на искусственной питательной среде QL (Quorin М. & Lepoivre P. Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus // Acta Hort. 1977. V. 78. P. 437-442) с добавлением сахарозы 30 г/л, 6-бензиламинопурина (БАП) 2 мг/л в течение 4 недель на свету, получающиеся конгломераты переносятся на 6 суток в темноту, после снова выставляются на свет на 4 суток, нормально сформированные побеги используются для укоренения. На этапе укоренения культивирование проводится на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,1-1 мг/л и/или индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1-1 мг/л, и/или нафтилуксусной кислоты (НУК) 0,1-1 мг/л в течение 2-4 недель. Его недостатками является: получаемые на этапе мультипликации экспланты очень хрупкие (ломкие), и при пересадке на среду укоренения большая часть побегов повреждается и гибнет; схема размножения сложна для исполнения в условиях производства из-за увеличения в 2 раза требуемой культуральной поверхности.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение схемы производства, повышение выхода качественных микропобегов алычи на этапе мультипликации, увеличение общей эффективности микроразмножения алычи в культуре in vitro для получения качественного посадочного материала без признаков плагиотропности.

Поставленная цель достигается за счет того, что культивирование на этапе мультипликации делится на 2 пассажа по 3 недели каждый. На второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения. Для обоих пассажей используют среду QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л. Культивирование на этапе укоренения проводится на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л в течение первых 2-7 суток в темноте, после 1-2 недели на свету.

Суть изобретения состоит в том, что предлагаемый способ, заключающийся в культивировании микропобегов на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л в течение 2 пассажей по 3 недели каждый, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л в течение первых 2-7 суток в темноте, после 1-2 недели на свету, значительно повышает выход качественных микропобегов на этапе мультипликации, увеличивает эффективность укоренения микропобегов, ускоряет темпы роста, устраняет плагиотропный рост осевого побега и благодаря вышеперечисленному увеличивает эффективность производства корнесобственных микрорастений.

Анализ известных способов клонального микроразмножения растений, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует условию патентоспособности изобретения - «новизна».

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, рН 5,6-5,8. После этого растворяется навеска агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 ати (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В остывшую до 55°С среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам. Все манипуляции с растительным материалом производятся в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в сосудах составляет 15-25 шт.

2. Размножение растительного материала проводят на среде мультипликации QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л в течение 2 пассажей длительностью 3 недели каждый. После первого пассажа получают конгломераты почек и побегов. Их без разделения переносят на свежую среду второго пассажа. Коэффициент мультипликации рассчитывается как среднее количество микропобегов, полученное с одного конгломерата.

3. Полученные микропобеги отделяются от конгломерата. Часть эксплантов повторно проходят этап мультипликации, остальные микропобеги высаживаются на укоренение. В качестве среды для укоренения используется половинная по макросолям среда QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л. Первые 2-7 суток культивирование проводится в темноте, после этого экспланты переносятся на 1-2 недели на свет. Эффективность укоренения оценивается долей укорененных хорошо сформированных микрорастений от числа всех эксплантов, выраженной в процентах.

В таблицах 1-4 представлены результаты исследований по влиянию способа культивирования алычи гибридной на этапе мультипликации на эффективность каждого из этапов клонального размножения in vitro.

Для большинства культур растений при возникновении затруднений на этапе мультипликации, таких как малый коэффициент размножения, укорочение междоузлий или витрифицированность (стекловидность), изменяют длительность и/или концентрацию фитогормонов цитокининов в меньшую сторону. В случае алычи гибридной наблюдается обратный эффект - суммарное увеличенное цитокининовое воздействие значительно улучшило не только качество получаемых микропобегов, но и их количество (таблица 1).

Данный способ культивирования на этапе мультипликации также влияет и на последующие этапы выращивания. Так, на этапе укоренения увеличивается выход укорененных микрорастений (таблица 2).

Кроме того, у предлагаемого способа размножения имеются следующие положительные эффекты. Ускоряется темп роста после адаптации микрорастений в 1,3-2 раза. За счет более коротких сроков доращивания увеличивается темп производства стандартного посадочного материала (таблица 3). Преодолевается плагиотропность роста осевого побега некоторых сортов как в условиях in vitro, так и ex vitro (в условиях защищенного грунта. За счет этого увеличивается выход качественного посадочного материала (таблица 4).

Преимуществом предложенного способа размножения является увеличение выхода качественных микропобегов на этапе мультипликации, увеличение доли укорененных микропобегов и ускорение темпов роста растений после адаптации к естественным условиям роста.

Способ применен в опытно-производственных условиях. Он позволяет произвести до 4000 микрорастений с 1 квадратного метра световой поверхности культуральной комнаты за 1 месяц производства. Получено и высажено более 30 тысяч микрорастений.

Способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, в частности к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, а также трансгенной клетке растения, трансгенному растению и трансгенному семени, содержащим вышеуказанную нуклеиновую кислоту.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий индукцию микропобегов непосредственно из апикальной недифференцированной ткани вегетативных почек экспланта на агаризованной среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга и дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20-30 г/л сахарозы, 6 г/л агара.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с насекомыми, выбранными из группы, состоящей из Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda и Heliothis virescens, а также к способу борьбы с сорняками сельскохозяйственной культуры сои, который включает обработку сельскохозяйственной культуры сои гербицидом глюфосинатом.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле рекомбинантной ДНК, указывающей на присутствие трансгенного события, где показательный образец семени, содержащего указанное трансгенное событие, депонирован в ATCC как РТА-12669.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения трансгенных растений пшеницы методом биобаллистики, включающий в себя холодовой шок (низкотемпературную обработку растений-доноров), культивирование эксплантов перед трансформацией на среде для индукции каллусообразования, при этом среда содержит пиклорам, осмотическую обработку эксплантов перед трансформацией, при этом экспланты помещают на среду с высоким осмотическим давлением, чтобы вызвать плазмолиз, введение в клетки эксплантов чужеродной ДНК с использованием пушки PIG (particle inflow gun), пролиферацию трансформированных клеток без селективного отбора, регенерацию и селективный отбор трансгенных побегов, укоренение побегов на среде с селективным агентом при пониженной температуре, где для индукции каллусообразования у незрелых зародышей используют холодовой шок, где низкотемпературную обработку свежесобранных колосьев растений-доноров осуществляют при +4°C в течение 48 часов, для индукции каллусообразования у незрелых зародышей используют модифицированную питательную среду, содержащую 0,5 мг 2,4-D, 2 мг пиклорама, 40 г мальтозы, 0,5 г глютамина, 0,1 г гидролизата казеина, перед и после трансформации экспланты выдерживают на осмотической среде, содержащей 120 г/л мальтозы, при этом перед трансформацией в течение 4-6 часов, а после трансформации в течение 20-24 часов, после трансформации клетки экспланта проходят этап размножения (пролиферации) на питательной среде без селективного агента, укоренение побегов проводят на селективной среде и при пониженной температуре.

Изобретение относится к области биохимии, в частности, к применению последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, для получения трансгенного растения, у которого стадия цветения подавлена, остановлена или задержана.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенной конструкции нуклеиновой кислоты для борьбы с западным кукурузным жуком, также к молекуле РНК, кодируемой вышеуказанной конструкцией.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированной клетке растения сои, продуцирующей масло, содержащее 0,36-8,00% ДГК от общего количества жирных кислот и 0,30-3,98% ДПК(n-6) от общего количества жирных кислот, а также к способу ее получения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенной растительной клетке табака, трансгенному растению табака, растительному материалу табака для получения повышенного количества С2С16:0, С2С17:0 и С2С18:0 сложных эфиров сахарозы, а также к курительному изделию, содержащему вышеуказанный растительный материал или часть вышеуказанного растения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению темных семян канолы для получения кормовой муки канолы, причем темные семена канолы выбраны из группы, состоящей из семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11697, семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11696, семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11698, и семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11699.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к кукурузному продукту, содержащему семя кукурузы от растения кукурузы, несущего генотип коричневой центральной жилки 3 (bm3) в гомозиготном состоянии и генотип мучнистости-2 (fl2) в гомозиготном состоянии.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий индукцию микропобегов непосредственно из апикальной недифференцированной ткани вегетативных почек экспланта на агаризованной среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга и дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20-30 г/л сахарозы, 6 г/л агара.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к биотехнологии. Способ включает высадку микрорастений на пластиковые поддоны, покрытые лутрасилом с предварительно выполненными в нем посадочными отверстиями, путем погружения корневой системы растений в водный антисептический раствор с последующим обеспечением проточной циркуляции воды в поддоне и верхнего мелкодисперсного увлажнения растений.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения картофеля, при котором выделяют апикальные этиолированные проростки (1-1,5 см), стерилизуют в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной H2O, культивируют меристемы, получают оздоровленные растения, проводят микрочеренкование, черенки вносят в стеклянные банки с металлической крышкой.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для ввода меристем винограда в условия in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 350-450; калий азотнокислый 1000-1200; кальций азотнокислый 400-500; кальций хлористый 50-70; магний сернокислый 300-350; натрий фосфорнокислый 150-200; железо сернокислое 27,8-30,0; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3-40,0; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,0-9,2; калий йодистый 0,40-0,80; натрий молибденовокислый 0,2-0,3; медь сернокислая 0,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 50-100; тиамин 0,2-0,5; пиридоксин 0,2-0,5; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза 20000-30000; агар 5000-6000; вода остальное до 1,0 л.
Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства, в частности к растениеводству. В способе клональное размножение оздоровленных растений осуществляют путем черенкования.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к растениеводству и питомниководству. Способ включает использование в качестве исходных эксплантов одно- и двухузловых сегментов весенних или летних побегов, их стерилизацию, выгонку пазушных побегов, мультипликацию и укоренение, которое осуществляется на питательной среде 1/2 WPM, перевод растений к нестерильным условиям и высаживание в грунт.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения микрорастений березы в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов на питательной среде MS без гормонов с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты 2,0 мг/л, с добавлением агар-агара 6 г/л при хранении пробирочных растений при температуре +4…+7°С в темноте.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Способ включает культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту и сахарозу, получение растений-регенерантов и получение микроклубней картофеля.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения растений сем.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к картофелеводству. Способ включает получение оздоровленных растений картофеля для черенкования (промежуточный продукт), мини-клубней картофеля (промежуточный продукт), клубней супер – суперэлиты (промежуточный продукт), клубней суперэлиты (промежуточный продукт), клубней элиты (промежуточный продукт), клубней первой полевой репродукции (конечный продукт). При этом меристемные растения выращивают в трубках различного диаметра, выполненных из стекла или пластика. После черенкования элитные растения и растения высоких репродукций выращивают параллельно по времени на жидких питательных растворах – среде Кноппа на поточной автоматической линии, состоящей из синхронно работающих блоков. Способ позволяет повысить производительность и улучшить условия роста выращиваемых растений. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 гл, агар-агара 9 гл, БАП 0,5-2 мгл и зеатина 0,05-1 мгл, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 гл, агар-агара 9 гл, ИУК 0,1-1 мгл иили ИМК 0,1-1 мгл, иили НУК 0,1-1 мгл, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету. Изобретение позволяет повысить эффективность производства корнесобственных микрорастений. 4 табл.

Наверх