Способ экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов. Способ включает подготовку дозы спермы к замораживанию - оттаиванию и оценку подвижности спермиев. Для оценки используют мини-дозу спермы - 0,5 мл, которую замораживают в жидком азоте в течение 5 минут. Использование изобретения позволит сократить время общего анализа и обработки результатов. 1 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к экспресс способам оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известны способы оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию, имеющие высокую корреляцию с ее оплодотворяющей способностью после замораживания-оттаивания и поэтому используемые для прогноза ее криоустойчивости. При этом оценивают подвижность и выживаемость спермиев, целостность мембран, акросом и ферментов после холодового удара, показатели стимуляции дыхания, время редукции метиленового синего или определяют коэффициент осмотической устойчивости (Курбатов, А.Д. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных [Текст] / А.Д. Курбатов, Е.М. Платов, Н.Б. Корбан, Л.Г. Мороз, В.А. Наук - Л,: Агропромиздат, 1988. - 255 с.; Осташко, Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей [Текст] / Ф.И. Осташко. - Киев: Урожай, 1978. - 255 с.; Милованов, В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных [Текст] / В.К. Милованов. - М., 1962. - 695 с.)

Наиболее близким к изобретению является способ определения резистентности спермиев жеребцов к холодовому шоку, который позволяет провести относительно быстро оценку спермы перед криоконсервацией (Сперма жеребцов неразбавленная свежеполученная [Текст]: ГОСТ 23681-79. - Введ. 1980-07-01. - М.: Изд-во стандартов, 1979 - 6 с).

Сущность способа определения резистентности спермиев к холодовому шоку (далее - резистентность) заключается в определении их выживаемости после резкого охлаждения до нулевой температуры. Резистентность вычисляется по формуле:

, где

П1 - подвижность спермиев после холодового шока, т.е. после 20 минут выдержки пробы спермы при нулевой температуре;

П2 - подвижность спермиев после выдержки пробы спермы при температуре 37°С в течение 5 мин в термостате и 20 мин при комнатной температуре.

Сперма, предназначенная для замораживания, должна иметь резистентность к холодовому шоку не ниже 0,1.

Как видим прежде, чем определять резистентность, необходимо знать подвижность спермиев, которая выражается в баллах и вычисляется по формуле:

, где

n - общее число подсчитанных спермиев;

n1 - число подсчитанных спермиев с прямолинейным поступательным движением;

10 - постоянный коэффициент.

Минимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,5 балла (Сперма быков неразбавленная [Текст]: ГОСТ 20909.4-75. - Введ. 1976-07-01. - М.: Изд-во стандартов, 1976 - 11 с.).

Главным недостатком этого способа является трудоемкость и поэтому его рекомендовано проводить при первой проверке семени на холодоустойчивость, а затем периодически - один раз в квартал.

Сперма жеребцов отличается тем, что в нее попадает большое количество секретов придаточных половых желез, и их выделение происходит неравномерно. Очень часто разные эякуляты от одного и того же жеребца отличаются по объему, концентрации, подвижности спермиев. Различия по биохимическим свойствам, неоднородность ферментного и микроэлементного состава плазмы влияют на устойчивость спермы к глубокому охлаждению. Поэтому прогноз криоустойчивости спермиев желательно проводить для каждого эякулята.

В производственных условиях очень часто не хватает оборудования и условий для применения данного способа, т.е. для практики до сих пор не разработан быстрый, простой и дешевый способ оценки криоустойчивости спермы.

Свежеполученная неразбавленная сперма жеребцов должна соответствовать известным требованиям и нормам (Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов [Текст]. - Дивово, 2006. - 23 с.; Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей [Текст]. - Дивово, 2012. - 72 с.). Но не всегда хорошее качество семени после получения является гарантией его хорошего состояния после замораживания и последующего оттаивания. Как правило, большой процент спермодоз приходится выбраковывать из-за низкой подвижности или плохой выживаемости спермиев после размораживания. Только около 50% замороженного материала остается для хранения и использования. Поэтому перед нами стояла задача найти простой и дешевый способ, позволяющий быстро оценить криоустойчивость спермиев каждого эякулята.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаемый способ позволяет быстро оценить устойчивость спермы жеребцов к замораживанию, влияние на нее глубокого охлаждения, избавить от необходимости последующей выбраковки замороженного семенного материала, повысить эффективность проводимых работ без дополнительных вложений и затрат на оборудование и материалы, без сложной подготовки и обучения персонала, сократить время общего анализа и обработки результатов до 15 минут.

Для решения этих задач был подобран оптимальный режим ускоренной подготовки разбавленной спермы к замораживанию с таким условием, чтобы подвижность спермиев после деконсервации совпадала или была близка к показателям после обычного замораживания. Были испытаны параметры, которые могли повлиять на подвижность спермиев после процедуры замораживания-оттаивания - это объем дозы, формы фасовки спермы, режим предварительного охлаждения и режим процедуры криоконсервации и оттаивания.

В результате испытания разных объемов дозы и формы фасовки выяснилось, что подвижность спермиев практически не зависит ни от объема дозы (1,5 мл - 0,5 мл), ни от формы фасовки (пробирки Эппендорфа, соломины или тубы). С целью экономии спермы, для дальнейших исследований, мы выбрали самый маленький объем, равный 0,5 мл в любой из имеющихся фасовочных форм (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).

Нами были проведены опыты по сокращению времени предварительной выдержки спермы в холодильнике при рекомендуемой температуре 4°С - 5°С, а также при более низкой - 1°С - 0°С.

Данный опыт показал, что сокращение времени выдержки спермы в условиях холодильника при 4°С - 5°С до 1,5 часа не приводит к снижению подвижности спермиев. При уменьшении времени выдержки в холодильнике до 1 часа, наблюдается небольшое снижение подвижности (на 0,2 балла или 8,7%). Таким образом, чем меньше время выдержки перед замораживанием, тем большие расхождения с контрольным вариантом наблюдались и тем больший поправочный коэффициент нужно применять

Так же выяснилось, что снижение температуры предварительного охлаждения разбавленной спермы перед криоконсервацией до 0°С не привело к желаемому результату, увеличив разницу между вариантами. Подвижность спермиев в таких пробах достоверно отличалась от контрольного варианта с обычным режимом подготовки к замораживанию. Разница составила 0,4-0,5 балла (Р>0,95) (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).

Изучив зависимость подвижности спермиев после оттаивания от времени нахождения дозы в парах азота в процессе замораживания, мы установили, что оптимальное время нахождения мини-дозы (0,5 мл) в парах азота оказалось равным 5 минутам (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007), т.е. таким же как для дозы объемом 5 мл. (Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей [Текст]. - Дивово, 2012. - 72 с.).

При обычном способе замораживания-оттаивания после выдержки спермы в парах азота, дозы опускаются в жидкий азот и процесс замораживания продолжается непосредственно в нем не менее суток с целью стабилизации кристаллов льда. Только после этого проводится контрольное оттаивание.

Для ускорения оценки мы проводили оттаивание, выдерживая сперму в азоте в течение 5, 10, 15 минут. Опытным путем было доказано, что подвижность спермиев во всех этих случаях была одинаковой. Мы считаем возможным выдерживать сперму в азоте в течение 5 минут (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).

По результатам испытаний подобран оптимальный режим быстрой подготовки спермы к замораживанию в мини-объеме для проведения экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов с результативностью, получаемой при обычном способе замораживания-оттаивания. Совпадение оценки подвижности спермиев контрольных и опытных образцов отмечено в 99% случаев.

Применение данного способа экспресс-оценки дает возможность заранее спрогнозировать и определить результативность применения глубокого охлаждения семени без последующей выбраковки замороженного семенного материала. Способ отличается простотой и быстротой исполнения в ходе проведения плановых работ по криоконсервации, без сложных манипуляций, без дополнительных затрат на дорогостоящие реактивы и оборудование и на специальную подготовку работников.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, чтобы оценить криоустойчивость спермы жеребца, осуществляют следующие действия:

1 сперму после получения и разбавления ЛХЦЖ-средой ставят для предварительного охлаждения и эквилибрации в холодильник, согласно «Рекомендациям по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов» (Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов [Текст]. - Дивово, 2006. - 23 с.). От общего объема разбавленной спермы отливают 0,5 мл и помещают в соломину для ее фасовки или в пробирку Эппендорфа;

2 выдерживают соломину или пробирку в холодильнике при температуре 4°С - 5°С в течение 1 или 1,5 часа.

3 переносят дозу для замораживания в охладитель с жидким азотом на поплавок. Выдерживают в парах жидкого азота в течение 5 минут и опускают непосредственно в азот на 5 минут;

4 сперму извлекают из жидкого азота с помощью пинцета и сразу переносят в водяную баню с температурой 38°С на 30 секунд, если это соломина, и на 60 секунд, если это пробирка Эппендорфа, вынимают из воды, обсушивают и раскупоривают;

5 после оттаивания, определяют подвижность спермиев известным способом, выражая ее в баллах.

Способ экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов, включающий подготовку дозы спермы к замораживанию - оттаиванию и оценку подвижности спермиев, отличающийся тем, что для оценки используют мини-дозу спермы - 0,5 мл, которую замораживают в жидком азоте в течение 5 минут.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к способу получения препарата натуральных половых феромонов хряка. Способ включает измельчение и гомогенизацию семенников, корней пастернака посевного и сельдерея корневого, инкубирование полученной массы при температуре 37-39°C в течение 60 мин, добавление мочи половозрелых хряков, перемешивание и отжим в прессе с ячейками 0,7×0,7 мм.

Изобретение касается способа капацитации криоконсервированных сперматозоидов КРС для in vitro оплодотворения яйцеклеток в полностью химически «определенной» системе.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к средам для искусственного осеменения сельскохозяйственной птицы. Среда для разбавления спермы птицы изготовлена путем растворения в 100 мл бидистиллированной воды сухих компонентов, взятых при следующем соотношении (г): сахароза - 4,0-5,0, глюкоза - 0,3-0,5, уксуснокислый натрий - 1,1-1,6, углекислый кислый натрий - 0,1-0,2, щавелевая кислота - 0,02-0,04, при этом среда обеспечивает время хранения разбавленной спермы при сохранении оплодотворяющей способности для кур 24 часа, цесарок и индеек - 7 часов, уток - 4 часа, гусей - 3 часа.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Добавка для стимулирования спермы содержит неорганический пирофосфат (PPi) в количестве примерно между 1 мкМ и примерно 200 мкМ.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к получению биологически активных препаратов для стимуляции половой функции у самок домашних животных.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к воспроизводству крупного рогатого скота. Способ повышения выживаемости сперматозоидов быков при криоконсервации предусматривает выдерживание сперматозоидов в течение 4 часов при температуре 38,5°С в среде, содержащей индукторы капацитации.
Изобретение относится к ветеринарии и биологии, в частности к составу среды для разбавления и хранения спермы кобелей. Среда содержит ТРИС - 6.06 г, лимонную кислоту - 3.4 г, фруктозу - 2.5 г, глицерин - 16 мл, альбумин человека 10% - 40 мл, сыворотку крови собаки 0,1-0,2 мкг, энроген - 25 мг, воду для инъекций - 184 мл.

Изобретение относится к коневодству, а именно к среде для разбавления и хранения спермы жеребцов при 4-5°C. Среда содержит растворенные в дистиллированной воде сухое молоко 4-7 г, лактозу - 4-7 г, двунатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б, хелатон-3) - 0,1 г, натрий двууглекислый - 0,008 г, натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный - 0,089 г, желток куриных яиц 1,6-2 мл, гентамицин 0,005 г.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарному акушерству, и может быть использовано в целях экспресс-диагностики по слюне полового цикла в репродуктивной системе коров.

Изобретение относится к области репродуктивной биотехнологии, а именно к способу экстракорпорального культивирования ооцитов коров. Способ включает оценку фазы роста ооцитов, выделенных стандартными методами из яичников коров после убоя, методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым, отделение не завершивших рост ооцитов и культивирование их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов. Способ включает подготовку дозы спермы к замораживанию - оттаиванию и оценку подвижности спермиев. Для оценки используют мини-дозу спермы - 0,5 мл, которую замораживают в жидком азоте в течение 5 минут. Использование изобретения позволит сократить время общего анализа и обработки результатов. 1 табл.

Наверх