Комбинированное лекарственное средство в виде раствора для получения спрея для лечения заболеваний ротовой полости
Владельцы патента RU 2687745:
Закрытое акционерное общество "Институт фармацевтических технологий" (ЗАО "ИФТ") (RU)
Изобретение относится к области фармакологии и касается лекарственного средства для лечения заболеваний ротовой полости. Предлагается лекарственное средство в виде раствора для получения спрея для лечения заболеваний ротовой полости, которое содержит комбинацию двух активных компонентов, вспомогательные вещества и растворитель. Первым активным компонентом является разветвленный олигогексаметиленгуанидин формулы
,
где R представляет
n1, n2 и n3 равны 1-3, a z равно 0,15-1,10 с молекулярно-массовым распределением Mw/Mn от 5,4 до 9,3 при среднемассовой молекулярной массе Mw в интервале от приблизительно 3800 до 6300 и среднечисловой молекулярной массе Mn в интервале от приблизительно 600 до 1100 в форме гидрохлорида (ОГМГ-ГХ). Второй активный компонент выбирают из бензалкония хлорида или бензоксония хлорида. Вспомогательные вещества включают глицерин, ментол, сахаринат натрия, а растворитель представляет собой воду очищенную или ее смесь со спиртом этиловым. При этом лекарственное средство имеет состав (в мас./об.%): ОГМГ-ГХ 0,1-0,5; бензалкония хлорид 0,005-0,05 или бензоксония хлорид 0,01-0,02; глицерин 30-50; ментол 0,01-0,03; сахаринат натрия 0,03-0,06; растворитель - до 100. Предлагаемое лекарственное средство эффективно в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов и может найти применение в стоматологической и ЛОР-практике. 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 10 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области фармакологии. Более конкретно, оно обеспечивает лекарственное средство в виде раствора для получения спрея для лечения заболеваний ротовой полости, таких как поражения ее слизистой оболочки (глоссит, гингивит, стоматит, альвеолит, пародонтит), содержащее комбинацию двух активных компонентов, вспомогательные вещества и растворитель. Изобретение может найти применение в стоматологической и ЛОР-практике.
Уровень техники
Одной из наиболее частых причин возникновения воспалительных процессов является влияние патогенной микрофлоры. В области стоматологии к вызываемым ей болезням относятся поражения слизистой оболочки ротовой полости (глоссит, гингивит, стоматит, пародонтит). Официальная статистика свидетельствует о возрастающем распространении таких болезней: гингивит (воспаление десны) и пародонтит (воспаление структуры периодонтальной связки и кости альвеолярных отростков) составляют 94-96% всех заболеваний пародонта, и уже в детском возрасте распространенность гингивита достигает 80-95%.
Одной из проблем, с которой сталкиваются практикующие специалисты, является приобретение патогенными микроорганизмами резистентности к существующим лекарственным препаратам. Так, например, некоторые виды стафилококков стали резистентны к аминогликозидам, в частности - к гентамицину. Это делает активно применяемые препараты неэффективными, либо вызывает необходимость повышения их доз. Последнее обстоятельство сопряжено с ростом токсичности и вероятностью проявления побочных эффектов. Также лечение заболеваний указанного рода затруднено еще и тем, что возбудителями инфекционного процесса являются как аэробные, так и анаэробные формы бактерий. Все это обусловливает необходимость создания новых фармацевтических композиций с широким спектром антимикробного действия, к которым патогенная микрофлора не выработала резистентность.
Возможным подходом является создание и применение соединений, действующих по иному механизму, чем антибиотики. В частности, известна группа сополимерных катионных полиэлектролитов - производных гуанидина, бигуанидина или бигуанида, которые вызывают нарушение структуры и целостности бактериальных мембран, что приводит к нарушению правильного баланса ионов между цитоплазмой клетки и внешней средой, выходу содержимого клетки в среду, потере способности поддерживать осмотическое давление и, в итоге, к лизису. Также возможно проникновение компонентов среды внутрь клетки.
В частности, для полигексаметиленгуанидина гидрохлорида (ПГМГ-ГХ) методом электронной микроскопии показано, что он повреждает клеточную мембрану Е. coli (Zhou Z.X. et al. Damage of Escherichia coli membrane by bactericidal agent polyhexamethylene guanidine hydrochloride: Micrographic evidences // J. Appl. Microbiol. 2010. Vol. 108. No. 3. Pp. 898-907). Клетки, обработанные 23 мкг/мл ПГМГ, коллапсируют и теряют свою характерную цилиндрическую форму, а подложка покрывается большим количеством дебриса. На изображениях, полученных с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, также наблюдается разрушение внешней мембраны Е. coli и конденсация содержимого клеток. Кроме того, в той же работе показано, что ПГМГ-ГХ способствует потере клеткой не только ДНК и РНК, но и белков: под действием ПГМГ-ГХ в раствор выходит β-галактозидаза, в норме содержащаяся в цитоплазме Е. coli.
Схожие изменения в структуре клеток Е. coli после воздействия ПГМГ-ГХ были показаны с помощью атомно-силовой микроскопии в работе Qian L. et al. Synthesis of modified guanidine-based polymers and their antimicrobial activities revealed by AFM and CLSMI/ACS Appl. Mater. Interfaces. 2011. Vol. 3. No. 6. Pp. 1895-1901. Помимо морфологических изменений, авторы также показали, что ПГМГ-ГХ способствует проникновению внутрь клеток флуоресцентного красителя пропидиума йодида, в норме не способного проходить через интактные клеточные мембраны.
Несмотря на то, что механизм действия соединений - производных гуанидина достаточно подробно описан в литературе, все упомянутые выше исследования были проведены на бактериях Е. coli. Однако, механизм действия подобных соединений в отношении грам-положительных микроорганизмов, а также анаэробных организмов, установлен не был. Кроме того, медицинскому применению ПГМГ-ГХ препятствует присутствие в нем остаточного высокотоксичного гексаметилен диамина (ГМДА). Поэтому основными областями применения ПГМГ-ГХ являются уборка и/или дезинфекция жилых и общественных объектов, дезинфекция медицинского оборудования, поверхностей и текстильных изделий в больницах, деревообработка, сельское хозяйство, ветеринария, водоочистка и водоподготовка, борьба с патогенными микроорганизмами в системах вентиляции и кондиционирования воздуха, при хранении и перекачке нефтепродуктов.
Предпринимались попытки удаления ГМДА как после завершения синтеза ПГМГ-ГХ, так и в качестве его стадии. Последний подход реализован, в частности, в изобретении в соответствии с заявкой CN 105820333 (опубл. 03.08.2016). Раскрытый в ней способ включает реакцию поликонденсации, после которой проводят реакцию омыления: при температуре реакционной массы 140-160°C добавляют раствор гидроксида натрия до pH 12 и выше, по окончании добавления гидроксида натрия температуру поддерживают в пределах 90-120°C в течение 1 часа или дольше с получением нерастворимого в воде полигексаметиленгуанидина, который далее переводят в форму гидрохлорида растворением в хлористоводородной кислоте и высушивают. Однако чистота получаемого продукта находится на уровне 96%, что ниже приемлемой для фармакопейной субстанции.
Сведения о медицинских применениях ПГМГ-ГХ весьма ограниченны. Так, патент RU 2143905 (опубл. 10.01.2000) раскрывает применение полигексаметиленгуанидиния в виде гидрохлорида, фосфата, бензоата, глюконата в качестве препаратов, обладающих антимикробной активностью по отношению к анаэробной и смешанной инфекции, представленной Staphylococcus spp., Proteus spp., Pseudomonaceae spp., Clostridium spp., Porphiromonas spp., Prevotella spp. и др., т.е. обладает широким спектром антибактериального действия. В описании указано, что «Изобретение относится к медицине и может быть использовано в хирургии, стоматологии, гинекологии, урологии, терапии и др. областях, где возможно возникновение анаэробной или смешанной инфекции». В примерах активность определена in vitro для солей ПГМГ линейного строения, что следует из изображенной в описании структурной формулы:
где, n=5-15, y = гидрохлорид, фосфат, глюконат, бензоат. Таким образом, изобретение лишь подтверждает широкий спектр антибактериальной активности ПГМГ, но не содержит конкретных указаний на возможные рецептуры для применения в стоматологии и ЛОР-практике, равно как и на комбинированные препараты.
Известны разветвленные сополимеры гуанидина и гексаметилендиамина далее именуемые олигогексаметиленгуанидины (ОГМГ). В патенте RU 2443684 (опубл. 27.02.2012) раскрыты разветвленные олигомеры гексаметилендиамина и гуанидина формулы (I)
где R представляет 
а n1, n2 и n3 равны 1-3, a z равно 0,15-1,10 с молекулярно-массовым распределением Mw/Mn от 5,4 до 9,3 при среднемассовой молекулярной массе Mw в интервале от приблизительно 3800 до 6300 и среднечисловой молекулярной массе Mn в интервале от приблизительно 600 до 1100, в виде соли. Способ их синтеза, раскрытый в примере осуществления изобретения, не предусматривает стадию очистки, поскольку в соответствии с изобретением они предназначены для получения дезинфицирующего средства. Однако в описании указано, что получение основания можно проводить в присутствии спирта, такого как этанол или изопропанол, взятого в количестве 0,5-1,0 объема от общего объема реакционной массы, состоящей из равных объемов приблизительно 50% водных растворов олигомера и щелочи. В этом случае остаточное содержание ГМДА можно снизить до 0,02-0,1% масс. в зависимости от времени и температуры проведения процесса, а также соотношения реагентов и спирта. Продукт такой чистоты вполне пригоден в качестве фармацевтической субстанции.
В патенте RU 2513997 (опубл. 27.04.2014) раскрыт офтальмологический препарат в виде капель, содержащий комбинацию активных компонентов, промотирующий компонент, вспомогательные вещества и воду, отличающийся тем, что комбинация активных компонентов состоит из разветвленного полигексаметиленгуанидина формулы (I), изображенной выше, где R, n1, n2 и n3, z, Mw/Mn, Mw и Mn имеют вышеуказанные значения, присутствующего в форме гидрохлорида, и таурина; промотирующий компонент выбран из янтарной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли, вспомогательные вещества выбраны из группы, состоящей из физиологически переносимых щелочных или кислотных агентов, присутствующих в количествах, требуемых для поддержания pH препарата в интервале от 6,0 до 7,8, и солевого тонического агента, выбранного из физиологически переносимых солей натрия или калия и их смесей, присутствующего в количестве, обеспечивающем тоничность препарата, сопоставимую с тоничностью естественной слезной жидкости здорового человека. Препарат обладает ранозаживляющим действием при травмах глаза. В условиях in vitro также показано его бактерицидное действие в отношении Е. coli, Staphylocuccus spp. и Candida spp., однако данных об эффективном лечении бактериальных офтальмологических инфекций описание изобретения не содержит. Рассматриваемое изобретение показывает бактерицидное действие ОГМГ-ГХ в отношении Е. coli, Staphylocuccus spp. и Candida spp., которые могут присутствовать в ротовой полости, но относится к препаратам офтальмологического, а не стоматологического назначения.
Аналогичное замечание применимо и к патентам RU 2509562 и RU 2510264. Патент RU 2509562 (опубл. 20.03.2014) относится к офтальмологическому препарату в виде капель, содержащему полигексаметиленгуанидин, фосфатный солевой буфер, гидратирующий компонент, выбранный из группы, состоящей из декстрана, сополимера винилпирролидона/винилацетата и водорастворимой метилцеллюлозы, отличающемуся тем, что полигексаметиленгуанидин представлен разветвленными олигомерами формулы (I), изображенной выше, где R, n1, n2 и n3, z, Mw/Mn, Mw и Mn имеют вышеуказанные значения, присутствующими в форме гидрохлорида, а препарат дополнительно содержит сополимер на основе N-винилпирролидона общей формулы (II):
где мономерное звено М представляет фрагмент 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП):
и содержание мономерных звеньев n составляет 25-50 мольн. %, средневязкостная молекулярная масса Мμ сополимера зависит от природы М: если М представляет МВТ, то Мμ=30-50 кДа; если М представляет МВП, то Мμ=15-40 кДа. Использование изобретения позволяет повысить эффективность лечения синдрома сухого глаза, а также возможной сопутствующей бактериальной и грибковой инфекции, вызванной, в частности, С. albicans. Препарат не оказывает раздражающего действия при длительном применении.
В патенте RU 2510264 (опубл. 27.03.2014) также представлен офтальмологический препарат в виде капель. Но, в отличие от патента RU 2513997, в комбинацию активных компонентов вместо таурина входит сульфацетамид. Препарат на модели собак показал активность против Е. coli, С. albicans, P. aeruginosa, S. oralis, что позволило излечить гнойный конъюнктивит.
Предложены различные механизмы действия бензалкония хлорида и бензоксония хлорида, однако наиболее вероятным считают нарушение окислительно-восстановительных процессов в микробной клетке путем вступления в реакцию с аминогруппами белков микроорганизмов. Также предполагают, что они ингибируют некоторые бактериальные ферменты. В частности установлено, что бензалкония хлорид подавляет плазмокоагулазу и гиалуронидазу стафилококков. Таким образом, реализуется непрямой мембранотропный эффект, т.е. действие активного вещества опосредованно через вмешательство в цитоплазматический метаболизм или иным косвенным путем.
В патенте RU 2219906 (опубл. 27.12.2003) на изобретение раскрыт водный лекарственный препарат в виде раствора, содержащего фармакологически активное вещество, для получения беспропеллентных аэрозолей для ингаляции, отличающийся тем, что содержит комплексообразователь в концентрации от 10 до 100 мг/100 мл раствора, активное вещество выбирают из группы бета-миметиков, антихолинергических средств, противоаллергических средств и/или антигистаминных средств. Рассматриваемое средство имеет предназначено для других применений, определяемых активным веществом, а бензалкония хлорид использован в качестве консерванта, а не активного компонента.
В заявке KR 20170033925 (опубл. 28.03.2017) раскрыта, в частности, противовирусная и антибактериальная композиция в форме спрея, получаемая смешиванием основного компонента с 1-10% бензалкония хлорида и добавлением 1-3% гидрокортизона, перемешиванием и разбавлением 30-150 массовых частей смеси на 100 массовых частей основного компонента 100-100000 массовыми частями очищенной воды на 100 массовых частей смеси. Композиция, полезная для лечения респираторных заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными инфекциями, обладает повышенной эффективностью, но направлено на решение иной задачи, чем настоящее изобретение.
В опубликованной международной заявке WO 00/047203 (опубл. 17.08.2000) раскрыт состав, эффективный для доставки в ротовую полость эффективного количества, по меньшей мере, одного фармацевтического агента в смеси с усилителем оральной абсорбции в орально приемлемом носителе-растворителе, где усилитель оральной абсорбции приспособлен чтобы модифицировать поверхностную мембрану ротовой полости пациента с целью улучшения оральной абсорбции фармацевтического агента. Примерами фармацевтического агента, в частности, являются глюкокортикоидные стероиды, дексаметазон, преднизолон, барбитураты, бензодиазепины, седативные средства, пептиды и белки с массой до 50 кДа, ненаркотические и наркотические анальгетики. Усилитель оральной абсорбции может быть выбран из гидроксипропил-β-циклодекстрина, бензалкония хлорида, бензетония хлорида, полисорбата 80, натрия лаурилсульфата, Tween, Brij, Pluronic. Изобретение обеспечивает быстрое, безболезненное и безопасное с токсикологической точки зрения введение активного вещества. Назначение бензетония хлорида отличается от такового в настоящем изобретении.
В опубликованной международной заявке WO 2002/002128 (опубл. 25.04.2004) раскрыта местная оральная композиция в виде спрея, содержащая безопасное и эффективное количество антимикробного агента, такого как триклозан, хлоргексидин, бензалкония хлорид, салициланилид, цетилпиридиния хлорид, тетрадецил пиридиния хлорид, и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция активна в отношении P. gingivalis, В. forsythus, A. actinomycetemcomitans, Т. denticola, Т. socranskii, F. nucleatum, P. intermedia, L. acidophilus, L. casei, A. viscosus, S. sobrinus, S. sanguis, S. viridans и S. mutans, что позволяет применять ее для лечения гингивита и пародонтита. Композиция содержит единственный активный компонент.
В международной заявке WO 2013/063695 (опубл. 10.05.2013) раскрыта композиция для профилактики и лечения заболеваний ротовой полости, включающая (а) связывающий железо протеин, выбранный из овотрансферрина, лактотрансферрина и серотрансферрина, (b) хелатирующий агент, выбранный из EDTA, EGTA, DTPA, EDDHA, IDA, CDTA, HEDTA, HEIDA, NTA, натрия цитрата, калия цитрата и цинка цитрата. Также она дополнительно содержит соединение для борьбы с инфекцией, выбранное из обширной группы, включающей, в частности, бензалкония хлорид. Композиция активна против Veillonella spp., Actinomyces spp., Bacillus spp., Mycobacterium spp., Fusobacterium spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp., Clostridium spp., Acinetobacter spp., P. mirabilis, K. pneumoniae, E. coli, P. cangingivalis и С.albicans и может быть представлена в виде спрея.
Имеются сведения о том, что патогенные микроорганизмы, такие как Pseudomonas aeruginosa, вырабатывают резистентность в отношении бензалкония хлорида за счет увеличения содержания фосфолипидов, а также жирных и нейтральных липидов в клеточных стенках (Sakagami Y., Yokoyama Н., Nishimura H., Ose Y., and Tashima T. Mechanism of resistance to benzalkonium chloride by Pseudomonas aeruginosa // Appl. Environ. Microbiol. 1989 Aug. Vol. 55(8). Pp. 2036-2040.
Из патента RU 2437647 (опубл. 27.12.2011) известна фармацевтическая композиция, обладающая антибактериальным, противовирусным и противогрибковым действием, содержащая хлоргексидин и бензоксония хлорид, воду, отличающаяся тем, хлоргексидин и бензоксония хлорид использованы в качестве основных действующих веществ, вода очищенная использована в качестве растворителя и формообразователя при следующем соотношении компонентов, масс./об. %:
| Хлоргексидин | 0,1-1,0 |
| Бензоксония хлорид | 0,05-0,5 |
| Вода очищенная | остальное до 100. |
Указано, что композиция является синергической. Ее применяют в виде беспропеллентного спрея для антисептической обработки и дезинфекции ран, ожоговых поверхностей, трещин кожи, поврежденных слизистых оболочек и укусов насекомых, однако данных, подтверждающих реализацию хотя бы одного из этих назначений, описание изобретения не содержит.
На рынке фармацевтических препаратов присутствует спрей для местного применения «ТераФлю® ЛАР» (Производитель: Новартис Консьюмер Хелс СА., Швейцария), представляющий собой прозрачный, бесцветный раствор с запахом мяты, который содержит (в мас./об. %) активные вещества - бензоксония хлорид - 0,2% и лидокаина гидрохлорид - 0,15%, и вспомогательные вещества:
этанол 96% (об./об.) - 10%; глицерин - 15%; хлористоводородную кислоту 0,1 н - 0,0581%; масло мяты перечной - 0,01%; ментол - 0,0025%; очищенную воду - до 100%. В официальной инструкции по применению (доступна по ссылке: https://medi.ru/instrukciya/teraflyu-lar-sprej_11160/) указано, что бензоксония хлорид - соль четвертичного аммония [N-бензил-N-додецил-N,N-ди(2-гидроксиэтил)аммония хлорид], благодаря своей катионной структуре обладает мембранотропной активностью и оказывает выраженное антибактериальное действие против грамположительных и, в меньшей степени, грамотрицательных микроорганизмов. Лидокаин является местным анестетиком, который при воспалительных процессах уменьшает болезненные ощущения в горле при глотании. В качестве показаний перечислены инфекции ротовой полости и глотки: фарингит, ларингит, катаральная ангина, стоматит, язвенный гингивит.
Таким образом, в известном уровне техники не выявлены решения, обеспечивающие лечение инфекций ротовой полости, сходные по составу и принципу действия с предлагаемым комбинированным лекарственным средством.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей изобретения является создание лекарственного средства в виде раствора для получения спрея для лечения заболеваний ротовой полости, вызванных, в особенности, бактериальной инфекцией, которое не вызывает резистентности и эффективно в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов с целью расширения арсенала средств указанного назначения для замещения на рынке импортной продукции.
В результате исследований авторы изобретения установили, что техническая задача может быть решена за счет создания лекарственного средства в виде раствора для получения спрея для лечения заболеваний ротовой полости, содержащего комбинацию двух активных компонентов, вспомогательные вещества и растворитель, в котором первым активным компонентом является разветвленный олигогексаметиленгуанидин формулы
где R представляет 
n1, n2 и n3 равны 1-3, a z равно 0,15-1,10 с молекулярно-массовым распределением Mw/Mn от 5,4 до 9,3 при среднемассовой молекулярной массе Mw в интервале от приблизительно 3800 до 6300 и среднечисловой молекулярной массе Mn в интервале от приблизительно 600 до 1100 в форме гидрохлорида (ОГМГ-ГХ), а второй активный компонент может быть выбран из бензалкония хлорида
или бензоксония хлорида
вспомогательные вещества включают глицерин, ментол, сахаринат натрия, а растворитель представляет собой воду очищенную или ее смесь со спиртом этиловым.
Предпочтительно лекарственное средство имеет состав (в мас./об. %):
| ОГМГ-ГХ | 0,1-0,5; |
| бензалкония хлорид | 0,005-0,05; |
| или бензоксония хлорид | 0,01-0,02; |
| глицерин | 30-50; |
| ментол | 0,01-0,03; |
| сахаринат натрия | 0,03-0,06; |
| растворитель | до 100. |
Более предпочтительно лекарственное средство имеет состав (в мас./об. %):
| ОГМГ-ГХ | 0,1-0,3; |
| бензалкония хлорид | 0,005-0,05; |
| глицерин | 30-40; |
| ментол | 0,01-0,025; |
| сахаринат натрия | 0,03-0,05; |
| растворитель | до 100. |
В отличие от антибиотиков предлагаемое лекарственное средство не вызывает появления резистентных штаммов микроорганизмов. Также оно обладает низкой токсичностью и аллергенностью, не является мутагенным, канцерогенным и тератогенным. Острая токсичность при внутрижелудочном введении для беспородных крыс характеризуется величинами 450 мг/кг (самки) и 500 мг/кг (самцы). При орошении ротовой полости крыс достичь дозы выше 370 мг/кг не представляется возможным, однако при такой дозе не наблюдается признаков острой токсичности. Признаки хронической токсичности отсутствуют при концентрации 15,6 мг/кг, что соответствует 20-кратной терапевтической дозе (ТД). Рекомендуемая для человека высшая суточная терапевтическая доза (ТД×10) равна 0,13 мг/кг. Высшая суточная терапевтическая доза для крыс со средней массой тела 280 г составляет 0,77 мг/кг, а для мышей с массой тела 25 г она равна 1,5 мг/кг.
В мутационном тесте Эймса на Salmonella typhimurium (штаммы ТА 100, ТА 98 и ТА 97), в тесте учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей и в тесте учета хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека исследования показали отсутствие у испытуемого препарата мутагенной (в испытаниях по полной программе) и канцерогенной (в краткосрочном тестировании) активностей.
При внутрибрюшинном введении препарата в тесте общей анафилаксии в дозе 6,0 мг/кг индекс по Weigle составляет 1,6 для самцов и 1,8 для самок морских свинок, что характеризует слабый анафилактический шок (умеренный анафилактический шок характеризуется индексом по Weigle от 2 до 3).
Тератогенность лекарственного средства при орошении ротовой полости как самцов, так и самок беспородных крыс (7,5 мг/кг, ТД×10) оценена по основным факторам развития потомства: масса тела с 4 по 40 сутки, время открытия глаз, прорезывание резцов, отлипание ушной раковины, появление шерстного покрова, опускание семенников (открытие влагалища), а также по скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания. Все показатели в группах самцов и самок статистически значимо не отличались от контрольных животных.
Лекарственное средство эффективно против широкого спектра аэробных и анаэробных патогенных микроорганизмов, таких как, например, Streptococcus spp. (S. oralis, S. pneumoniae, S. pyogenes), Staphylococcus spp. (S. aureus), Klebsiella spp. (K. pneumoniae), Pseudomomas aeruginosa, Escherichia coli, Peptostreptococcus anaerobius, Veillinella parvula, Porphyromonas gingivalis. В ходе проведенных исследований было установлено, что минимальные подавляющие концентрации (МПК) находятся на уровнях: для Moraxella catarrhalis - 0,05 мкг/мл, для S. pneumoniae и S. pyogenes - 0,25 мкг/мл, Neisseria gonorrhoeae и S. aureus - 1 мкг/мл.
Для лекарственного средства, содержащего ОГМГ-ГХ в концентрации 0,1% мас./об., на модели термического травматического стоматита и гингивита у кроликов через 7 дней после создания дефекта происходит практически полное заживление слизистой оболочки ротовой полости без признаков эрозивно-язвенных поражений, воспалительной инфильтрации и геморрагий.
Лекарственное средство имеет срок годности 3 года, что меньше, чем у присутствующего на рынке ТераФлю® ЛАР (5 лет). Однако данное обстоятельство не следует считать существенным недостатком предлагаемого лекарственного средства с учетом его несомненных достоинств: более высокой активности и широты спектра антибактериального действия. В частности, на модели травматического стоматита и гингивита у кроликов авторы установили, что лекарственное средство, приготовленное в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, способствует ранозаживлению в дозе, более чем в полтора раза меньшей, чем ТераФлю® ЛАР.
Также в соответствии с изобретением предложено механическое устройство для беспропеллентного получения спрея, включающее резервуар с лекарственным средством и герметично присоединенный к нему распылительный узел, соединенный по потоку лекарственного средства с резервуаром заборной трубкой, а по потоку воздуха соединенный с атмосферой. Предпочтительно резервуар изготовлен из органического полимера медицинского назначения, металла или стекла, а распылительный узел приводится в действие ограниченным ходом его привода в направлении резервуара. Это обеспечивает получение порций спрея заданного объема, что предохраняет от передозировки. В соответствии с этим предпочтительны баллоны алюминиевые моноблочные 40 мл с внутренним лакированным покрытием с микродозатором и защитным колпачком из полиэтилена высокой плотности.
Далее возможность осуществления изобретения с достижением его технических результатов будет показана на неограничивающих примерах.
Осуществление изобретения
Примеры 1-4. Приготовление лекарственной композиции для получения спрея
Общая методика. К 50 мл воды очищенной при перемешивании добавляют первый активный компонент - ОГМГ-ГХ (m1 г, чистота 99,8%, влажность 1,5%), а после его растворения вносят навеску второго активного компонента - бензалкония хлорида (БАХ, m2 г) или бензоксония хлорида (БОХ, m2* г). К полученному раствору активных веществ добавляют вспомогательные вещества: сахаринат натрия (m3 г), ментол (m4 г) и глицерин (m5 г). Полученную смесь перемешивают в течение 15-20 минут, после чего доводят ее объем до 100 мл добавлением воды очищенной. Затем полученную лекарственную композицию снова тщательно перемешивают в течение 5-10 минут и расфасовывают в баллоны алюминиевые моноблочные (40 мл) с внутренним лакированным покрытием с микродозатором и защитным колпачком из полиэтилена высокой плотности.
Составы приготовленных спреев (значения масс компонентов m1…m5 численно совпадают с их содержаниями в мас./об. %) приведены в таблице 1.
Пример 5. Оценка острой токсичности лекарственного средства
А) Оценка острой токсичности при внутрижелудочном введении
Острую токсичность оценивают по результатам исследований на беспородных крысах (самки и самцы) с начальной массой тела 210-260 г самки, 300-350 г самцы. Животных распределяют по группам (n=5) методом случайной выборки. В качестве критерия принимают массу тела. Разброс по исходной массе не превышает 20%. Кроме того, формируют аналогичные по численности группы контрольных животных каждого вида и пола, которым аналогичным путем вводят растворитель.
Животных содержат в клетках из поликарбоната со стальными решетчатыми крышками с приспособлениями для корма (комбикорм для лабораторных грызунов ПК-120) и воды. Животные получают корм и воду без ограничения. Температура 18-22°C, относительная влажность 50-65%, двенадцатичасовой цикл освещения и десятикратная смена объема воздуха комнаты в час. Лекарственное средство, приготовленное в соответствии с примером 3, вводят натощак внутрижелудочно однократно через металлический атравматичный зонд. Эвтаназию декапитацией с предварительной анестезией производят на 14 день эксперимента. Аутопсию осуществляют в тот же день.
Оценку токсического действия лекарственного средства проводят по следующим клиническим признакам: 1) респираторные показатели (затрудненное дыхание, цианоз, учащенное дыхание, выделения из носа); 2) двигательная активность (повышенная/пониженная, сонливость, потеря равновесия, чувствительности, каталепсия, атаксия, необычные передвижения, прострация, тремор, фасцикуляция; 3) конвульсии (клонические, тонические, тонико-клонические, асфиктические); 4) рефлексы (корнеальный, равновесие, миотатический, световой, рефлекс испуга); 5) глазные признаки (слезотечение, миоз, мидриаз,экзофтальмоз, птоз, помутнение, ирит, конъюнктивит, хромодактриорея, ослабление мигательной мембраны); 6) сердечно-сосудистые явления (брадикардия, тахикардия, аритмия, вазодилатация, вазоконстрикция); 7) повышенная саливация; 8) состояние шерстного покрова (пилолейомиома, алопеция); 8) аналгезия; 9) мышечный тонус (гипотония, гипертония); 10) желудочно-кишечные показатели (мягкий стул, диарея, рвота, полиурия, ринорея).
Кожу, лимфатические узлы, аорту, сердце, гортань, трахею, легкие, тимус, пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, печень, поджелудочную железу, селезенку, почки, надпочечники, мочевой пузырь, семенники, яичники, матку, подчелюстную слюнную железу с лимфатическими узлами, щитовидную железу, головной мозг подвергают макроскопическому исследованию. Сердце, легкие, тимус, печень, селезенку, почки, семенники, яичники, надпочечники, головной мозг подвергают взвешиванию.
Статистический анализ проводят с использованием программы Statistica (разработка Dell Corp. Ltd., ver. 7.0). Достоверность отличий между группами данных оценивают с применением t-критерия Стьюдента. Различия считают достоверными при p<0,05.
При макроскопическом исследовании отчетливого влияния препарата на состояние внутренних органов не установлено, различий между контрольными и опытными группами не обнаружено.
Масса тела крыс на протяжении эксперимента значимо не отличается между опытными и контрольными группами (таблица 2).
У крыс самок при введении лекарственного средства в дозе 400 мг/кг достоверно увеличилась относительная масса печени и головного мозга по отношению к контрольным животным. Остальные показатели в группах самок и самцов значимо не отличались от показателей в контрольных группах.
Б) Оценка острой токсичности при орошении ротовой полости
Характеристики животных и сформированных из них групп и условия исследования (режим содержания животных, длительность исследования, оцениваемые клинические признаки, перечни органов, подвергаемых макроскопическому исследованию и взвешиванию) аналогичны указанным в разделе А). Ротовую полость орошают с помощью распылителя. Крысам производят по 2 распыления 3 раза в течение дня, что соответствует дозам: самцы 220-260 мг/кг, самки 300-370 мг/кг.
Масса тела крыс на протяжении эксперимента значимо не отличаются между опытными и контрольными группами (таблица 3).
При макроскопическом исследовании и взвешивании внутренних органов отчетливого влияния препарата на состояние внутренних органов не установлено, различий между контрольными и опытными группами не обнаружено.
Пример 6. Оценка хронической токсичности лекарственного средства при орошении ротовой полости
Хроническую токсичность для дозы 15,6 мг/кг (ТД×20) оценивают по результатам исследований на беспородных крысах (самки и самцы) с начальной массой тела 150-190 г самки, 200-230 г самцы. Животных распределяют по группам (n=5) методом случайной выборки, принимая в качестве критерия массу тела. Разброс по исходной массе не превышает 10%. Кроме того, формируют аналогичные по численности группы контрольных животных каждого вида и пола, которым аналогичным путем вводят растворитель.
Животных содержат в клетках из поликарбоната со стальными решетчатыми крышками с приспособлениями для корма (комбикорм для лабораторных грызунов ПК-120) и воды. Животные получают корм и воду без ограничения. Температура 18-22°C, относительная влажность 50-65%, двенадцатичасовой цикл освещения и десятикратная смена объема воздуха комнаты в час. Лекарственное средство, приготовленное в соответствии с примером 3, вводят орошением ротовой полости с помощью распылителя. Эвтаназию декапитацией с предварительной анестезией производят в три серии на 15, 29 и 43 дни эксперимента. Аутопсию осуществляют в тот же день.
Определяют следующие показатели: массу тела, потребление корма и воды, температуру тела (ректально), частоту сердечных сокращений. Проводят клинический анализ крови для определения: 1) количества эритроцитов; 2) гематокрита; 3) количества тромбоцитов; 4) количества гемоглобина; 5) количества лейкоцитов.
Выполняют биохимический анализ крови для определения: 1) аспартатаминотрансферазы; 2) аланинаминотрансферазы; 3) щелочной фосфатазы; 4) общего белка; 5) мочевины; 6) креатинина; 7) глюкозы; 8) холестерина; 9) триглицеридов; 10) общего билирубина; 11) натрия; 12) калия.
Также выполняют биохимическое исследование мочи и определяют следующие показатели: 1) лейкоциты; 2) нитриты; 3) pH; 4) белок; 5) глюкозу; 6) уробилиноген; 7) билирубин; 8) кетоны; 9) эритроциты; 10) аскорбиновую кислоту; 11) удельный вес.
Оценивают поведенческие реакции в тесте «открытое поле» (камера 100×100×60 см, 16 квадратов): время адаптации (латентный период), количество пересеченных горизонтальных квадратов (горизонтальная активность), вставаний на задние лапы (вертикальная активность), умывание (груминг), акты дефекации (количество болюсов), число уринаций.
После эвтаназии макроскопическому исследованию подвергают лимфатические узлы, аорту, сердце, гортань, трахею, легкие, тимус, пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, печень, поджелудочную железу, селезенку, почки, надпочечники, мочевой пузырь, семенники, яичники, матку, подчелюстную слюнную железу с лимфатическими узлами, щитовидную железу, головной мозг, место введения (слизистую языка). Взвешиванию подвергают сердце, легкие, тимус, печень, селезенку, почки, семенники, яичники, надпочечники, головной мозг.
Масса и ректальная температура тела крыс на протяжении эксперимента значимо не отличается между опытными и контрольными группами (таблица 4).
Гр. к. - группа контроля
Многократное (в течение 28 дней) орошение ротовой полости крыс лекарственным средством, приготовленным в соответствии с примером 3, в двадцатикратной терапевтической дозе, не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии животных. На протяжении всего опыта гибели животных не зарегистрировано. Не выявлено существенных различий в потреблении воды и пищи. Препарат не вызывает изменений в поведенческих реакциях, реакции на внешние раздражители, а также нарушений в двигательной активности животных. Относительные массы внутренних органов крыс, которым вводят препарат, существенно не отличаются от контроля.
Применение лекарственного средства не оказывает влияние на гематологические показатели крови при длительном применении за исключением того, что статистический анализ биохимических показателей крови выявил у самок крыс повышение печеночных ферментов (АЛТ и ACT), однако эти данные не превышают референсных показателей.
При вскрытии животных после многократного орошения ротовой полости в течение 28 дней было выявлено увеличение межклеточного пространства и изменение формы клеток в печени и легких. Изменения носят обратимый характер.
Местно-раздражающего действия при орошении ротовой полости лекарственным средством в рамках проведенного исследования не выявлено.
Пример 7. Оценка аллергенности лекарственного средства в тесте в тесте «Реакция общей анафилаксии» у морских свинок
Перед началом исследования необходимое количество животных массой 800-850 г (самки) и 1000-1100 г (самцы) распределяют на группы методом рандомизации по массе тела. Разброс по массе не превышает 10%. Животных содержат в клетках по 5 особей, предоставляют свободный доступ к стандартному комбикорму гранулированному полнорационному экструдированному (ГОСТ Р 51849-2001 Р.5) и воде. Животных содержат в контролируемых условиях окружающей среды: температура воздуха 20-26°C, относительная влажность 30-70%, двенадцатичасовой цикл освещения и десятикратная смена объема воздуха комнаты в час.
Сенсибилизацию проводят в дозах ТД (0,6 мг/кг) и 10 ТД×10 (6,0 мг/кг) в виде ежедневных ингаляций по 7 минут в течение 5 дней. В качестве негативного контроля используют 0,9% масс, раствор NaCl. Разрешающие (составляющие суммарные сенсибилизирующие) дозы препарата вводят внутрибрюшинно через 21 день после сенсибилизации.
Клиническую картину описывают следующим образом: 0 - шок не развился, признаки его отсутствуют; + - слабый шок (некоторое беспокойство, учащенное дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть взъерошена); ++ - умеренный шок (небольшие судороги, выраженные явления бронхоспазма); +++ - шок тяжелой степени (общие судороги, асфиксия, животное теряет способность удерживаться на лапах, падает на бок, не погибает); ++++ - шок со смертельным исходом.
Вычисление анафилактического индекса по Weigle проводят по формуле:
где N - число морских свинок, у которых наступила смерть;
N1 - число морских свинок, у которых развился тяжелый шок;
N2 - число морских свинок, у которых развился умеренный шок;
N3 - число морских свинок, у которых развился слабый шок;
N4 - число морских свинок, у которых не наступило шока.
При гибели всех животных в группе индекс Weigle составляет 4 (++++), при тяжелом шоке - 3 (+++), при умеренном шоке - 2 (++), при слабом шоке - 1 (+), при отсутствии анафилактоидных реакций у морских свинок индекс равен 0.
Ингаляционная сенсибилизация морских свинок в дозе 0,6 мг/кг (ТД) приводит к развитию слабого анафилактического шока у самцов и самок морских свинок после введения разрешающей дозы. Введение препарата в дозе 6,0 мг/кг (ТД×10) вызывает слабый шок, но его проявление более выражено, чем в дозе ТД (таблица 5).
Пример 8. Оценка мутагенности лекарственного средства в тесте учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах мышей
Животных (самцов) отбирают и распределяют по группам (n=6), исходя из веса и возраста. Масса тела каждого животного не отклоняется от средней по группе более чем на 20%. Животных содержат в клетках из поликарбоната со стальными решетчатыми крышками с приспособлениями для корма (комбикорм для лабораторных грызунов ПК-120) и воды. Животные получают корм и воду без ограничения. Животных содержат при температуре 18-22°C, относительной влажности 50-65%, двенадцатичасовом цикле освещения и десятикратной смене объема воздуха комнаты в час.
Лекарственное средство, приготовленное в соответствии с примером 3, вводят однократно распылением в ротовую полость в объеме 0,13 мл, что соответствует ТД×10, получение препаратов для исследований осуществляют через 24 часа после последнего введения.
В качестве негативного контроля используют 0,9% мас. раствор NaCl (ООО «Компания «ДЕКО», Россия), который вводят распылением в ротовую полость четырехкратно с интервалом 24 часа. В качестве позитивного контроля используют раствор циклофосфана (ОАО «Биохимик», Россия), который вводят внутрибрюшинно однократно в дозе 10 мг/кг за 24 часа до эвтаназии, осуществляемой методом цервикальной дислокации.
Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовят общепринятым способом. После эвтаназии выделяют обе бедренные кости и очищают их от мышц. Для вымывания костного мозга используют сыворотку крови эмбриональную телячью. В микропробирку наливают 1 мл сыворотки. Набирают сыворотку в шприц и вымывают костный мозг из обеих бедренных костей в микропробирку. Центрифугируют суспензию при 1000 об/мин. в течение 5 минут, супернатант удаляют пипеткой с пластиковым наконечником, осадок осторожно ресуспендируют. Маленькую каплю суспензии помещают на край предметного стекла, подводят к капле шлифованное стекло под углом 45° и делают мазок, который затем высушивают на воздухе. Препараты фиксируют метанолом в течение 3 минут, окрашивают по методу Романовского-Гимзы и высушивают на воздухе.
Микроскопический анализ проводят методом световой микроскопии, используя микроскоп LeicaDM 1000, увеличение 10×100, масляная иммерсия (Лейка Майкросистемз GmbH., Германия). Анализируют по 2000 полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) от каждого животного для учета ПХЭ с микроядрами. Долю ПХЭ от суммы ПХЭ и нормохромных эритроцитов определяют при дополнительном подсчете 400 эритроцитов.
Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводят путем сравнения опытной группы с контрольными с помощью критерия сопряженности χ2 при уровне значимости для каждого из сравнений 0,05. Сравнение доли ПХЭ от суммы всех эритроцитов в контрольных и опытных группах проводят с использованием критерия Манна-Уитни.
При сравнении группы мышей, получавших лекарственное средство (группа 3), с контрольной группой самцов (группа 1) статистически значимых различий по частоте ПХЭ с микроядрами не выявлено. Циклофосфан (позитивный контроль, группа 2) индуцировал 
ПХЭ с микроядрами, что статистически достоверно выше, чем в группах 1 и 3 (p<0,05, таблица 6).
Таким образом, в тесте учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей показано, что лекарственное средство, приготовленное в соответствии с примером 3, не проявляет цитогенетической активности при однократном введении распылением в ротовую полость как в рекомендуемой человеку высшей тической дозе, так и в дозе, превышающей терапевтическую в 10 раз.
Пример 9. Оценка тератогенности лекарственного средства
В исследовании использовали половозрелых беспородных крыс массой тела 180-200 г, которых содержат в отдельных полипропиленовых клетках с железной решеткой при температуре воздуха 20-26°C, относительной влажности 30-70%, двенадцатичасовом цикле освещения и десятикратной смене объема воздуха комнаты в час. Перед началом исследования необходимое количество животных, отвечающих критериям включения в исследование, распределяют на группы методом рандомизации по массе тела с разбросом по группе, не превышающим 10%.
Статистический анализ данных выполняют с помощью программного обеспечения Statistica (разработка Dell Corp., ver. 10.0). Исследованные показатели усредняют по экспериментальным группам и представляют в виде M±m, где М - среднее по группе, m - стандартное отклонение. Достоверность различий между группами определяют с помощью t-критерия Стьюдента при p<0,05 при нормальном распределении выборки и непараметрического U-критерия Манна-Уитни при p<0,05 при распределении, отличающемся от нормального.
Максимальная суточная доза лекарственного средства (ЛС) «Спрей 0,3% на основе разветвленного олигогексаметиленгуанидина гидрохлорида», приготовленного в соответствии с примером 3, для взрослого человека средней массой 70 кг в виде распылений в ротовую полость составляет 3 мл (0,04 мл/кг), чему соответствует терапевтическая доза по ОГМГ-ГХ (ТД) 0,5 мл (0,75 мг/кг) и доза ТД×10 равная 7,5 мг/кг для крысы массой 200 г.
Лекарственное средство (ЛС) вводят внутрижелудочно половозрелым самкам в течение 15 дней (3 эстральных цикла) до спаривания в дозах ТД и ТД×10. Каждая группа состоит из 10 животных. Самкам контрольной группы вводят воду для инъекций по той же схеме эксперимента. По окончании введения ЛС самок подсаживают к интактными самцам в соотношении 2:1.
Проводят наблюдение за общим физическим состоянием, поведением животных, течением беременности и родами у самок крыс. Роды крыс проходили без осложнений. Регистрируют дату родов, продолжительность беременности, размер помета, а также количество живых и мертворожденных плодов. В ходе исследования случаев гибели крысят среди потомства зарегистрировано не было. Результаты оценки тератогенного действия ЛС на репродуктивную функцию самок, регистрируемые по физическим параметрам развития потомства, представлены в таблице 7. Размер помета и все показатели крысят в опытных группах не отличаются от контрольных показателей.
При исследовании репродуктивной функции самцов ЛС вводят внутрижелудочно в дозах ТД и ТД×10 в течение 48 дней. Каждая группа состоит из 10 животных. Контрольной группе животных по той же схеме вводят воду для инъекций. По окончании введения к самцам подсаживали интактных самок в соотношении 2:1.
Результаты оценки тератогенного действия ЛС на репродуктивную функцию самцов, регистрируемые по физическим параметрам развития потомства, представлены в таблице 8, из которых следует, что физиологическое развитие потомства, полученного от опытных самцов, находится в пределах нормы, регистрируемые показатели не имеют статистически значимых отличий от контроля.
Пример 10. Оценка специфической активности лекарственного средства
А) Исследования in vitro
В исследовании в качестве тест-культур используют Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida albicans. Культуры микроорганизмов сохраняют при -75°C в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 10-15% глицерина. Перед началом эксперимента бактериальные штаммы активируют высевом на агаризованную среду ГРМ-1 (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия), инкубируют при 35 2°C в течение 18-20 часов.
При получении рабочих растворов все манипуляции производят в асептических условиях со стерильными материалами. Готовят основной раствор, содержащий 1000 мкг/мл ОГМГ-ГХ, и разбавляют его в питательном бульоне: 2,56 мл основного раствора доводят питательной средой до объема 10 мл, получают рабочий раствор, содержащий 256 мкг/мл ОГМГ-ГХ.
Препарат сравнения Таваник®, раствор для инфузий, 5 мг/мл левофлоксацина (Санофи-Авентис Дойчланд ГмбХ, Германия, 1,0 мл) доводят стерильной дистиллированной водой до 5 мл в мерном цилиндре, получая основной раствор, содержащий 1000 мкг/мл левофлоксацина. Основной раствор разбавляют в питательном бульоне: 2,56 мл основного раствора доводят питательной средой до 10 мл. Получают рабочий раствор, содержащий 256 мкг/мл левофлоксацина.
Установление минимальной подавляющей концентрации (МПК) лекарственного средства, приготовленного в соответствии с примером 1, проводят микрометодом серийных разведений в бульоне в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований.
Для тест-культур микроорганизмов готовят серии двукратных разведений в среде Mueller-Hinton Broth I (Oxoid) в объеме 50,0 мкл, в питательный бульон вносят натрия хлорид до концентрации 2%. Для приготовления инокулята используют суточные культуры, активированные после криохранения. Отдельные морфологически однородные колонии суспендируют в стерильном 0,9% масс. растворе натрия хлорида до мутности, эквивалентной 0,5 по стандарту МакФарланда, определяемой с помощью денситометра DEN-1 (BioSan, Латвия), что соответствует 1,5×108 КОЕ/мл. Последующее разведение суспензии готовят разбавлением до титра 2×106 КОЕ/мл.
По 50 мкл инокулята вносят в каждую ячейку, содержащую 50 мкл ЛС в концентрации 256 мкг/мл, конечная концентрация ЛС составляет 128 мкг/мл. Для контроля роста в 3 ячейки вносят 50 мкл питательного бульона без ЛС («контроль роста»). В качестве «отрицательного контроля» в лунки планшет вносят разведения субстанции и иноку лята, который хранили при температуре 4°C до учета результатов. Конечный титр микроорганизмов в каждой ячейке составляет 1×106 КОЕ/мл. Инокулят вносят в ячейки с разведениями ЛС не позднее 30 минут с момента его приготовления. Диапазон концентраций ОГМГ-ГХ составляет от 128 до 0,001 мкг/мл.
Планшеты с тестируемыми штаммами инкубируют в обычной атмосфере при температуре 35±2°C в течение 20-24 часов. Для определения наличия роста планшеты с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культур в присутствии ЛС сравнивают с отрицательным контролем, содержащим исходный инокулят и хранившимся при температуре 4°C. МПК определяют по наименьшей концентрации ЛС, которая подавляет видимый рост микроорганизмов.
По результатам эксперимента установлено, что исследованные микроорганизмы чувствительны к ЛС, приготовленному в соответствии с примером 1, не в равной степени. Наиболее выраженную активность ЛС проявляет в отношении Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes (МПК 0,002-0,25 мкг/мл), Moraxella catarrhalis (МПК 0,03-0,06 мкг/мл), Neisseria gonorrhoeae (МПК 0,125-2 мкг/мл). Несколько меньшую стабильную активность наблюдают для Staphylococcus aureus (метициллинчувствительные и метициллинустойчивые, МПК 1-2 мкг/мл). Низкую чувствительность проявили культуры Candida parapsilosis и Candida glabrata (МПК 32-64 мкг/мл). В отношении Candida albicans ЛС более активно (МПК 2 мкг/мл).
Б) Исследования in vivo на модели травматического стоматита и гингивита
Перед началом исследования необходимое количество животных, отвечающих критериям включения в исследование, распределяют по группам методом рандомизации по массе тела (3,2-3,5 кг). Разброс не превышает 10%. Животных содержат в индивидуальных клетках в контролируемых условиях окружающей среды: температура воздуха 16-22°C, относительная влажность 30-70%, двенадцатичасовом цикле освещения и десятикратной смене объема воздуха комнаты в час. Кроликам предоставляют свободный доступ к стандартному комбикорму гранулированному полнорационному экструдированному (ГОСТ Р 51849-2001 Р.5) и воде.
Орошение ротовой полости экспериментальных животных проводят 3 раза в день по 2 распыления, что составляет 0,5-0,6 мл раствора (для 0,1% раствора приблизительно 0,2 мг/кг, для 0,3% раствора приблизительно 0,6 мг/кг). Растворы испытуемого ЛС наносят методом распыления с помощью пластикового спрей-дозатора (40 мл) в течение 7 дней. Растворы готовят ежедневно непосредственно перед применением.
Травматический стоматит и гингивит воспроизводят на 18 кроликах породы Шиншилла (в группе 3 самца и 3 самки) под наркозом (0,7 мл Золетил 100+1,3 мл Рометар) путем термического ожога слизистой оболочки ротовой полости в области нижних резцов и щеки раскаленным докрасна штопфером диаметром 3 мм в течение 7-10 секунд.
Через 24 часа начинают лечение 0,1% и 0,3% растворами испытуемого ЛС. В контрольной группе распыляют стерильную воду для инъекций по аналогичной с опытными группами схеме. Об эффекте субстанции судили по скорости заживления ран (визуально) и патоморфологическому заключению.
Клиническое наблюдение за животными в клетках содержания производят ежедневно, также визуально отмечают отклонения в потреблении корма и воды животных в отдельных клетках. После лечения проводят эвтаназию животных всех экспериментальных групп с последующим взятием образцов пораженных участков слизистой оболочки ротовой полости для гистологических исследований с целью сравнения эффекта.
Исследование специфической активности показывает, что в течение эксперимента динамика массы тела животных остается положительной, их физиологическое состояние, аппетит и водопотребление в норме. Через 7 дней у большинства животных в опытных группах (0,1 и 0,3% ДВ) отмечают снижение отека слизистой оболочки, уменьшение гиперемии тканей, под частично снятым фибринозным налетом наблюдают розово-красную слизистую оболочку.
При микроскопическом исследовании во всех гистологических препаратах слизистых оболочек щек максиллярной зоны и десен перидентальных областей мандибуллярной зоны, полученных от кроликов после местного применения раствора ЛС в концентрациях 0,1 и 0,3% обнаруживают сходные по выраженности патоморфологические изменения, характеризующие слабый воспалительный процесс и выраженную регенерацию поврежденной ткани. Слизистая оболочка максиллярной зоны щеки покрыта многослойным плоским эпителием с зонами ороговения. На поверхности слизистой оболочки наблюдают отдельные незначительные эрозивно-язвенное повреждение, а также умеренную пролиферацию грануляционной ткани и практически полное восстановление эпителия, выстилающего слизистую оболочку. Щечные мышцы и слюнные железы щеки интактны.
Слизистая оболочка десен перидентальных областей мандибуллярной зоны опытных животных покрыта многослойным плоским ороговевающим эпителием. На поверхности слизистой оболочки, распространяясь в область лунок нижних резцов, обнаруживают эрозивно-язвенное повреждение на стадии заживления с развитием выраженной регенерации. Воспалительной инфильтрации и геморрагии не наблюдают.
Слизистую оболочку максиллярной зоны щеки и оболочку десен перидентальных областей мандибуллярной зоны в контрольной группе характеризуют наличием очаговых эрозивно-язвенных поражений и слабой пролиферацией грануляционной ткани, отмечены участки воспалительной инфильтрации и геморрагии.
Таким образом, при исследовании слизистых оболочек ротовой полости кроликов делают вывод о практически полном заживлении дефектов в группах применения исследуемого ЛС в концентрации 0,1% и 0,3% через 7 дней после термического формирования модели стоматита и гингивита.
В соответствии с инструкцией по применению спрея «Терафлю® ЛАР, 0,2%» максимальная суточная доза для взрослого человека (4 распыления 6 раз в день) составляет 3 мл раствора, в которых содержится 6 мг активного вещества (БОХ). При средней массе тела человека 70 кг доза выражается величиной 0,086 мг/кг. Эквивалентная ей максимальная суточная доза для кролика с учетом метаболического коэффициента, равного 3,2, составляет 0,28 мг/кг.
На основании полученных данных излечение травматического стоматита и гингивита у кролика со средней массой тела 3,5 кг достигается при распылении в ротовую полость 0,6 мл раствора ЛС, содержащего 0,1% мас./об. ОГМГ-ГХ в качестве основного активного вещества, чему соответствует доза 0,17 мг/кг, что в 1,65 раза ниже, чем для БОХ в случае спрея «Терафлю® ЛАР, 0,2%». Это указывает на более высокую эффективность лекарственного средства, приготовленного в соответствии с изобретением по сравнению с присутствующим на рынке препаратом.
1. Лекарственное средство в виде раствора для получения спрея для лечения заболеваний ротовой полости, содержащее комбинацию двух активных компонентов, вспомогательные вещества и растворитель, отличающееся тем, что первым активным компонентом является разветвленный олигогексаметиленгуанидин формулы
,
где R представляет 
n1, n2 и n3 равны 1-3, a z равно 0,15-1,10 с молекулярно-массовым распределением Mw/Mn от 5,4 до 9,3 при среднемассовой молекулярной массе Mw в интервале от приблизительно 3800 до 6300 и среднечисловой молекулярной массе Mn в интервале от приблизительно 600 до 1100 в форме гидрохлорида (ОГМГ-ГХ), а второй активный компонент выбран из бензалкония хлорида
или бензоксония хлорида
вспомогательные вещества включают глицерин, ментол, сахаринат натрия, а растворитель представляет собой воду очищенную или ее смесь со спиртом этиловым, при этом лекарственное средство имеет состав, мас./об.%:
| ОГМГ-ГХ | 0,1-0,5 |
| бензалкония хлорид | 0,005-0,05 |
| или бензоксония хлорид | 0,01-0,02 |
| глицерин | 30-50 |
| ментол | 0,01-0,03 |
| сахаринат натрия | 0,03-0,06 |
| растворитель | до 100 |
2. Лекарственное средство по п. 1, отличающееся тем, что оно имеет состав, мас./об.%:
| ОГМГ-ГХ | 0,1-0,3 |
| бензалкония хлорид | 0,005-0,05 |
| глицерин | 30-40 |
| ментол | 0,01-0,025 |
| сахаринат натрия | 0,03-0,05 |
| растворитель | до 100 |
