Способ видовой дифференциации патогенных буркхольдерий с использованием моноклональных антител

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ видовой дифференциации патогенных буркхольдерий методом твердофазного иммуноферментного анализа. Способ включает сенсибилизацию планшета смесью антител, специфичных одновременно к возбудителям сапа и мелиоидоза, использование пары видоспецифичных иммунопероксидазных конъюгатов и парное внесение исследуемых проб в лунки планшета. Моноклональные антитела получают путем иммунизации линейных мышей культурами возбудителей сапа и мелиоидоза, слияния иммунных спленоцитов с клетками мышиной миеломы, наработки в брюшной полости линейных мышей и очистки методами жидкостной хроматографии. 1 табл., 1 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и иммунологии и может быть использовано для выявления и видовой дифференциации патогенных буркхольдерий. Среди представителей рода Burkholderia патогенными являются Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei (возбудители сапа и мелиоидоза, соответственно), относящиеся к микроорганизмам второй группы патогенности. В национальных системах классификации особо опасных бактериальных патогенов России, Великобритании, США и Канады возбудители сапа и мелиоидоза входят в ведущие группы по степени опасности для человека [Cheng А.С., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management // Clin Microbiol. - Rev. 2005. - Vol. 18(2). - P. 383-416].

В настоящее время заболевание сапом регистрируется в Турции, Иране, Объединенных Арабских Эмиратах, Афганистане, Индии, Китае, Монголии, на Филиппинах, а также в странах Африки и Латинской Америки [Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2005. - Vol. 44.- P. 91-97]. «Гиперэндемичными» регионами по мелиоидозу являются Таиланд и Австралия [Cheng А.С., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management // Clin Microbiol. - Rev. 2005. - Vol. 18(2). - P. 383-416].

Рост транспортных связей, увеличение объема грузоперевозок и пассажиропотока, увеличение числа туристических поездок российских граждан в эндемичные регионы, привлечение иностранной рабочей силы и незаконная миграция населения создают реальную угрозу заноса сапа и мелиоидоза на территорию России из эндемичных стран, что обусловливает актуальность создания эффективных средств диагностики сапа и мелиоидоза.

Близкое антигенное родство возбудителей сапа и мелиоидоза, их биологические особенности и клиническая картина заболеваний во многом схожи, что позволяет объединить два вида микроорганизмов в условную группу патогенных буркхольдерий. На сегодняшний день идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза является трудоемкой задачей, поскольку существующие методы их обнаружения оказываются недостаточно эффективными. Тем не менее, выявление и видовая дифференциация данных возбудителей крайне важны в эпидемиологическом отношении.

В последние годы методом идентификации буркхольдерий в клинических лабораториях является полимеразная цепная реакция (ПНР), в том числе с флуоресцентной детекцией [Van Pelt С, Verduin М., Goessens W., Vos M. Identification of Burkholderia spp.in the clinical microbiology laboratory: comparison of conventional and molecular methods // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 7. - P. 2158-2164; Suppiah G., Bagali P.G., Vadivelu G. Development of polymerase chain reaction assay to detect Burkholderia genus and to differentiate the species in clinical specimens // In: The 5-th world melioidosis congress, 2007, Thailand, Khon Kaen. - 2007. - 245 p.].

Твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА), наряду с ПНР, является одним из высокоспецифичных подтверждающих методов анализа и базируется на использовании моноклональных антител (МКАТ). Использование МКАТ, специфичных к различным антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза в реакциях агглютинации и латекс-агглютинации показало, что многие МКАТ этого типа обладали кросс-реактивностью в отношении грамположительных Bacillus sp. и Streptococcus pyogenes. Результаты исследования МКАТ, перспективных для включения в состав ТИФА тест-системы также свидетельствовали о недостаточной чувствительности экспериментального набора [Prokhvatilova E.V., Antonov V.A., Viktorov D.V., Khrapova N.P. The comparative evaluation of informativeness of immunologic and molecular genetics methods and means during stages of specific indication of melioidosis agent // Russian Clinical Laboratory Diagnostics. - 2014. - Vol. 12. - P. 58]. Таким образом, проведение исследований по разработке иммунодиагностических препаратов и тест-систем на основе МКАТ для выявления и видовой дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза крайне важно для совершенствования существующей схемы выявления буркхольдерий.

Для разработки способа видовой дифференциации патогенных буркхольдерий были использованы препараты специфических МКАТ к антигенам возбудителя сапа, секретируемые культурами гибридных клеточных линий 301E5F10 и 258F12H11, и препараты МКАТ, секретируемые культурами гибридных клеточных линий 285D4B4 и 255 В6Е1, специфичные к антигенам возбудителя мелиоидоза. Все гибридные клеточные линии были получены ранее в филиале ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации (г. Киров). Иммуноглобулины выделяли из асцитных жидкостей мышей BALB/c методом двукратного осаждения насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом против 0,15 М раствора натрия хлорида с добавлением 20 мМ фосфатного буферного раствора (рН 7,5). Окончательную очистку иммуноглобулинов осуществляли методом ионообменной хроматографии на колонке К 6/20 с ДЭАЭ-сефацелем [Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с анг. / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991. - 287 с.]. Концентрацию белка в очищенных препаратах иммуноглобулинов определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Fair A.L., Randall R.G. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275]. Синтез конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена осуществляли по методу Nakane Р.К. и Kawaoi A.J. [Nakane Р.К., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22(12). - P. 1084-1091]. Рабочее разведение иммунопероксидазных конъюгатов определяли методом «шахматного титрования» [Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с анг. / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991. - 287 с.].

Для сенсибилизации 96-луночного планшета готовили полиспецифичный раствор МКАТ - смесь препаратов сапных (301E5F10) и мелиоидозных (285D4B4) моноклональных антител с конечной концентрацией белка 20 мкг/мл на 50 мМ карбонатно-бикарбонатном буферном растворе. Готовый раствор МКАТ вносили по 100 мкл во все лунки планшета. Сенсибилизацию планшета проводили на шейкере-инкубаторе с частотой вращения 400 оборотов в мин при температуре 37°С в течение одного часа. Лунки планшета трехкратно отмывали, внося в них по 300 мкл фосфатно-солевого буферного раствора с добавлением 20% Твина 20 (ФСБ-Т). После отмывки во все лунки планшета вносили по 100 мкл ФСБ-Т.

Готовили суспензии микробных культур В.mallei штаммов 11, Ц-5, 10230 и B.pseudomallei штаммов Duc-V, С-141, Dalat (исследуемые образцы) с концентрацией 64 млн м.к./мл. Приготовление микробных взвесей с заданной концентрацией проводили визуально с помощью отраслевого стандартного образца мутности (ОСО 42-28-85).

Внесение проб осуществляли попарно по схеме: в лунки «Н1» и «Н7» - по 100 мкл суспензии В.mallei штамма 11; в лунки «Н2» и «Н8» - по 100 мкл суспензии В.mallei штамма Ц-5, в лунки «Н3» и «Н9» - по 100 мкл суспензии В.mallei штамма 10230; в лунки «Н4» и «Н10» - по 100 мкл суспензии B.pseudomallei штамма Duc-V; в лунки «Н5» и «Н11» - по 100 мкл суспензии B.pseudomallei штамма С-141, в лунки «Н6» и «Н12» - по 100 мкл суспензии B.pseudomallei штамма Dalat.

Внесенные образцы титровали двукратным шагом до ряда А, исключая лунки «А1» и «А7» (для определения фона конъюгата) - в них внесли по 100 мкл ФСБ-Т. Инкубировали планшет на шейкере-инкубаторе с частотой вращения 400 оборотов в мин при температуре 37°С в течение одного часа. Трехкратно отмывали лунки планшета, внося в них по 300 мкл ФСБ-Т. Готовили рабочие растворы иммунопероксидазных конъюгатов, специфичных к антигенам возбудителя сапа (конъюгат 258F12H11) и мелиоидоза (конъюгат 255 В6Е1). В лунки рядов 1-6 вносили по 100 мкл конъюгата 258F12H11, в лунки рядов 7-12 - по 100 мкл конъюгата 255 В6Е1. Инкубировали планшет на шейкере-инкубаторе с частотой вращения 400 оборотов в мин при температуре 37°С в течение одного часа. Трехкратно отмывали планшет, внося в лунки по 300 мкл ФСБ-Т.

Готовили раствор субстратно-индикаторной смеси на основе о-фенилендиамина (ОФД) с концентрацией ОФД 0,5 мг/мл. Приготовленный раствор вносили по 100 мкл во все лунки планшета. Инкубировали планшет в темноте при температуре 22°С в течение 20 минут. Останавливали реакцию, добавляя в лунки по 100 мкл 1М раствора серной кислоты. Определяли оптическую плотность реакционной смеси в лунках на планшетном спектрофотометре при длине волны 492 нм (ОП₄₉₂). Результаты принимали к учету в том случае, если фоновые значения иммунопероксидазных конъюгатов не превышали величину ОП₄₉₂, равную 0,15. В лунках с исследуемыми образцами результат считали положительным при величине ОП₄₉₂ равной 0,3 и более.

Пример 1. В предварительно сенсибилизированный планшет внесли образцы по следующей схеме: суспензию В.mallei штамма 11 - по 100 мкл в лунки «Н1» и «Н2»; суспензию B.pseudomallei штамма Duc-V - по 100 мкл в лунки «Н3» и «Н4». Образцы титровали двукратным шагом до ряда В, в лунки «А1» - «А4» вносили по 100 мкл ФСБ-Т. Инкубировали планшет на шейкере-инкубаторе с частотой вращения 400 оборотов в мин при температуре 37°С в течение одного часа. Трехкратно отмывали планшет, внося в лунки по 300 мкл ФСБ-Т. Во все лунки 1 и 3 рядов вносили по 100 мкл конъюгата 258F12H11, специфичного к антигенам возбудителя сапа, в лунки 2 и 4 рядов вносили по 100 мкл конъюгата 255 В6Е1, специфичного к антигенам возбудителя мелиоидоза. Инкубировали планшет на шейкере-инкубаторе с частотой вращения 400 оборотов в мин при температуре 37°С в течение одного часа. Трехкратно отмывали планшет, внося в лунки по 300 мкл ФСБ-Т. В лунки рядов 1-4 вносили по 100 мкл субстратно-индикаторной смеси. Инкубировали планшет в темноте при температуре 22°С в течение 20 минут. Останавливали реакцию, добавляя в лунки по 100 мкл 1М раствора серной кислоты. Определяли оптическую плотность реакционной смеси в лунках на планшетном спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Данная схема ТИФА с использованием полиспецифичной смеси МКАТ для сенсибилизации лунок планшета, внесением проб в парные ряды лунок и использованием видоспецифичных иммунопероксидазных конъюгатов позволяет дифференцировать возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрациях 8 млн м.к./мл и менее за счет различий в оптической плотности реакционных смесей при последовательных двукратных разведениях в лунках 96-луночного планшета.

Способ видовой дифференциации патогенных буркхольдерий методом твердофазного иммуноферментного анализа, основанный на использовании моноклональных антител, полученных путем иммунизации линейных мышей культурами возбудителей сапа и мелиоидоза, слияния иммунных спленоцитов с клетками мышиной миеломы, наработки в брюшной полости линейных мышей и очистки методами жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что для сенсибилизации планшета используют смесь антител, специфичную одновременно к возбудителям сапа и мелиоидоза, два иммуноферментных конъюгата, специфичных к возбудителям сапа и мелиоидоза, соответственно, и исследуемые пробы вносят в лунки планшета попарно.