Набор реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа "ом-сибирская язва-генотип"
Владельцы патента RU 2730868:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой набор реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип», состоящий из расфасованных в стрипованные микропробирки и лиофильно высушенных пяти реакционных смесей, включающих эквимолярную смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, Taq-ДНК-полимеразу, трегалозу, флюоресцентно-меченые праймеры, а также в отдельных микропробирках - разбавителя реакционных смесей, положительного контрольного образца, раствора для разбавления положительного контрольного образца. Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его использования в поддержке диагностики специфической патологии (сибирская язва) при исследовании клинических изолятов Bacillus anthracis, выделенных из материала от больного (подозрительного на заболевание); сибиреязвенных изолятов из объектов окружающей среды; в качестве генетического теста идентификации штаммов сибиреязвенного микроба; для эпидемиологического мониторинга. 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл.
Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской диагностике, и может быть использовано в учреждениях медицины и здравоохранения, в лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии и противочумных учреждениях Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах, а также в стационарных и мобильных лабораториях специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе Министерства обороны, для генетического типирования клинических изолятов, изолятов из объектов окружающей среды, а также коллекционных штаммов возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis) методом фрагментного анализа продуктов мультиплексной полимеразной цепной реакции 20-ти локусов, содержащих вариабельные тандемные повторы ДНК. Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его использования в поддержке диагностики специфической патологии (сибирская язва) при исследовании клинических изолятов Bacillus anthracis, выделенных из материала от больного (подозрительного на заболевание); сибиреязвенных изолятов из объектов окружающей среды; в качестве генетического теста идентификации штаммов сибиреязвенного микроба; для эпидемиологического мониторинга.
Высокая устойчивость сибиреязвенных спор к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды способствует длительному сохранению возбудителя и созданию стойких почвенных очагов, представляющих постоянную опасность для человека и животных. В настоящее время на территории нашей страны официально зарегистрировано более 35 тысяч неблагополучных по сибирской язве пунктов, а самыми опасными регионами считаются Северный Кавказ, Поволжье и Урал (Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М.: Медицина, 1984. 208 с.; Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 27.06.2008 г. № 41 «О мерах совершенствования мероприятий по профилактике сибирской язвы в Российской Федерации; Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: ИНТЭРСЭН, 2002. 384 с.). Периодические проявления их эпидемической активности, а также случаи заболеваний людей или животных вследствие заноса возбудителя с других территорий требуют разных подходов в проведении противоэпидемических мероприятий. Между тем, выявить истинный источник инфекции и пути ее распространения зачастую бывает достаточно сложно. Решению этих вопросов способствует внедрение в практику лабораторных исследований современных подходов к геноидентификации B.anthracis (Лабораторная диагностика опасных инфекционных заболеваний. Практическое руководство [под редакцией Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева]. М.: Медицина, Шико, 2009. 472 с.).
Основным современным методом геноидентификации бактерий является типирование по количеству повторов нуклеотидных мотивов в специфических локусах генома, так называемых вариабельных тандемных повторах (Variable-Number Tandem Repeat, VNTR). В настоящее время для генотипирования и штаммовой идентификации B.anthracis используется VNTR-анализ по нескольким вариабельным локусам (Multiple-Locus VNTR Analysis, MLVA). В 2000 г. P.Keim et al. предложили способ VNTR-анализа, позволяющий дифференцировать штаммы B.anthracis по восьми полиморфным локусам (J.Bacteriol. 2000. Vol. 182, P. 2928-2936.). Для 426 исследованных штаммов авторам удалось получить 89 генетических профилей, при этом дискриминирующая способность отдельных локусов составила 0,3-0,8. Использование данного способа позволило P.Keim et al. также определить происхождение вакцинного штамма B.anthracis, культура которого была распылена членами секты Aum Shinrikyo в Токио в 1993 г. (Emerg. Infect. Dis. 2004. № 10, P. 117-120.). С его помощью также было установлено, что штамм B.anthracis, использованный во время биотеррористических атак в США в октябре-ноябре 2001 г., имел сходный профиль с известным высоковирулентным штаммом Ames, выделенным от коровы в Техасе (США) в 1981 г. (Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2003, №1, С. 6-14; Science. 2002. Vol. 296, P. 2028-2033.).
В 2001 г. ученые исследователи из Франции на основании анализа вариабельных участков генома возбудителя сибирской язвы предложили альтернативный способ дифференциации с использованием информативных VNTR-локусов, обнаруженных при анализе геномных баз данных. При этом, в отличие от P.Keim et al., свой выбор авторы остановили на последовательностях ДНК только хромосомной локализации. Авторы выбрали 14 локусов, которые позволили получить 27 генетических профилей на выборке из 31 штамма. Дискриминирующая способность отдельных локусов составила 0,07-0,81 и была более 0,5 для девяти локусов (BMC Microbiol. 2001. Vol. 1, P. 2180-2193.).
Группа из 8 локусов, предложенная P. Keim et al. была позднее расширена до 15 локусов. В результате авторам удалось повысить дискриминирующую способность системы, получив 221 генетический профиль на коллекции из 1033 штаммов (PLoS One. 2007, 2:e461. DOI: 10.1371/journal.pone. 0000461).
Еще одна расширенная панель, включающая 25 локусов (преимущественно уже использованных ранее) была предложена в работе Lista et al. (BMC Microbiol. 2006; 6: 33. DOI: 10.1186/1471-2180-6-33). С помощью этой панели на выборке из 160 штаммов французского происхождения было получено 67 генотипов.
Помимо VNTR-локусов, были также исследованы потенциально информативные SNR-локусы (однонуклеотидные повторы; Single-Nucleotide Repeats, SNR). Из 39 локусов, обнаруженных при анализе геномных последовательностей, авторами были выбраны 22 локуса, обладавшие достаточной дискриминирующей способностью на исследованных штаммах, составившей 0,41-0,75 (J. Clin. Microbiol. 2006. Vol. 44, P. 777-782).
Известен патент United States Patent 8,563,250 «Methods for identifying bioagents». Данный патент относится к области судебно-медицинской экспертизы и предполагает идентификацию биологических агентов, используемых при разработках биологического оружия или для террористических актов или преступлений. Авторы указывают, что их методы также полезны при проведении эпидемиологических исследований по генотипированию биоагентов. Генотипирование штаммов Bacillus anthracis согласно данного патента проводится по 6 VNTR-локусам: pX01, pX02, vrrB2, CG3, Bavntr12 и Bavntr35.
Наиболее близким к заявляемому нами изобретению является «Multilocus Repetitve DNA sequences for genotyping Bacillus anthracis and related bacteria» (International Publication Number WO 01/81543 A2). Авторы данного изобретения (P. Keim et al.) разработали способ молекулярного типирования штаммов Bacillus anthracis по 8 полиморфным локусам, содержащим вариабельное число тандемных повторов с детекцией результатов методом фрагментного анализа с флуоресцентной детекцией.
Общим с заявляемой тест-системой для данного изобретения является использование аналогичного подхода к молекулярному типированию Bacillus anthracis, основанному на анализе с помощью ПЦР нуклеотидных последовательностей VNTR-локусов генома.
Отличительным моментом предлагаемого к патентованию набора реагентов является использование в качестве генетических маркеров нуклеотидных последовательностей 20 VNTR локусов генома сибиреязвенного микроба, уникальных флуоресцентно-меченых праймеров, а также мультиплексный формат исполнения анализа.
Задачей изобретения является разработка набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа с лазер-индуцируемой флуоресцентной детекцией.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверная внутривидовая дифференциация различных по происхождению штаммов и микробных культур B.anthracis.
Указанный технический результат достигается разработкой набора реагентов, в частности выбором и синтезом олигонуклеотидных праймеров к VNTR-локусам генома сибиреязвенного микроба, их флуоресцентным мечением, формированием на их основе мультиплексных реакционных смесей, с последующей лиофилизацией компонентов, комплектованием дополнительными реагентными средствами, используемыми при постановке ПЦР и детекции результатов амплификации методом фрагментного анализа с лазер-индуцируемой флуоресцентной детекцией.
Нуклеотидные последовательности флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных праймеров для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа представлены ниже (и в приложении к заявке):
для амплификации локуса CebBams3:
SEQ ID NO 1 (прямой праймер CebBams3 1_1_F_FAM):
FAM-gcagcaacagaaaacttctctccaataaca;
SEQ ID NO 2 (обратный праймер CebBams3 1_1_R):
tcctccctgagaactgctatcacctttaac;
для амплификации локуса CebBams13:
SEQ ID NO 3 (прямой праймер CebBams13 1_2_F_R6G):
R6G-ctagtgcatttgaccctaatcttgt;
SEQ ID NO 4 (обратный праймер CebBams13 1_2_R):
aattgagaaattgctgtaccaaact;
для амплификации локуса CebBams22:
SEQ ID NO 5 (прямой праймер CebBams22 1_3_F_TMR):
TAMRA-accgttaattcacgtttagcaga;
SEQ ID NO 6 (обратный праймер CebBams22 1_3_R):
atcaaaaattcttggcagactga;
для амплификации локуса CebBams23:
SEQ ID NO 7 (прямой праймер CebBams23 1_4_F_ROX):
ROX-cggtctgtctctattattcagtggt;
SEQ ID NO 8 (обратный праймер CebBams23 1_4_R):
cctgttgctcctagtgatttcttac;
для амплификации локуса CebBams15:
SEQ ID NO 9 (прямой праймер CebBams15 2_1_F_FAM):
FAM-gtatttcccccagatacagtaatcc;
SEQ ID NO 10 (обратный праймер CebBams15 2_1_R):
gtgtacatgttgattcatgctgttt;
для амплификации локуса VNTR32:
SEQ ID NO 11 (прямой праймер VNTR32 2_2_F_R6G):
R6G-acagctaatacgtatggttcattccc;
SEQ ID NO 12 (обратный праймер VNTR32 2_2_R):
aagaactggatccaggagattata;
для амплификации локуса pXO1:
SEQ ID NO 13 (прямой праймер pXO1 2_3_F_TMR):
TAMRA-tcccaatttattaacgatcagattaagttca;
SEQ ID NO 14 (обратный праймер pXO1 2_3_R):
caagtctagaattagttgcttcataatggc;
для амплификации локуса vrrC2:
SEQ ID NO 15 (прямой праймер VRRC2 2_4_F_ROX):
ROX-ccagaagaagtggaacctgtagcac;
SEQ ID NO 16 (обратный праймер VRRC2 2_4_R):
gtctttccattaatcgcgctctatc;
для амплификации локуса CebBams1:
SEQ ID NO 17 (прямой праймер CebBams1 3_1_F_FAM):
FAM-agttcaagcgccagaaggttatgagttatc;
SEQ ID NO 18 (обратный праймер CebBams1 3_1_R):
gttgagcatgagaggtaccttgtccttttt;
для амплификации локуса vrrC1:
SEQ ID NO 19 (прямой праймер VRRC1 3_2_F_R6G):
R6G-catttcctcaagtgctacaggttc;
SEQ ID NO 20 (обратный праймер VRRC1 2_3_R):
gaagcaagaaagtgatgtagtggac;
для амплификации локуса CebBams30:
SEQ ID NO 21 (прямой праймер CebBams30 3_3_F_TMR):
TAMRA-cagaaaatattggacctaccttcc;
SEQ ID NO 22 (обратный праймер CebBams30 3_3_R):
agctaatcacctacaacacctggta;
для амплификации локуса VNTR17:
SEQ ID NO 23 (прямой праймер VNTR17 3_4_F_ROX):
ROX-agaataataagggttctcatggtat;
SEQ ID NO 24 (обратный праймер VNTR17 3_4_R):
acggtaggtaaacaaattttcgtaatc;
для амплификации локуса VNTR16:
SEQ ID NO 25 (прямой праймер VNTR16 4_1_F_FAM):
FAM-agctaatcacctacaacacctggta;
SEQ ID NO 26 (обратный праймер VNTR16 4_1_R):
atgcatctcttgaaaatataaaacgca;
для амплификации локуса vrrA:
SEQ ID NO 27 (прямой праймер VRRA 4_2_F_R6G):
R6G-cacaactaccaccgatggcaca;
SEQ ID NO 28 (обратный праймер VRRA 4_2_R):
gcgcgtttcgtttgattcatac;
для амплификации локуса vrrB1:
SEQ ID NO 29 (прямой праймер VRRB1 4_3_F_TMR):
TAMRA-ataggtggttttccgcaagttattc;
SEQ ID NO 30 (обратный праймер VRRB1 4_3_R):
gatgagtttgataaagaatagcctgtg;
для амплификации локуса CL33:
SEQ ID NO 31 (прямой праймер CL33 4_4_F_ROX):
ROX-tggggtatattcccatcgaa;
SEQ ID NO 32 (обратный праймер CL33 4_4_R):
tgtaccgcagataccaacca;
для амплификации локуса VNTR23:
SEQ ID NO 33 (прямой праймер VNTR23 5_1_F_FAM):
FAM-tgggatcgtacaacagcaattatcat;
SEQ ID NO 34 (обратный праймер VNTR23 5_1_R):
acgcatttagaaacgttatcacgctta;
для амплификации локуса VNTR35:
SEQ ID NO 35 (прямой праймер VNTR35 5_2_F_R6G):
R6G-acccaaacaagagcaaacccaat;
SEQ ID NO 36 (обратный праймер VNTR35 5_2_R):
ttccctaaataatatgttccttttgctg;
для амплификации локуса vrrB2:
SEQ ID NO 37 (прямой праймер VRRB2 5_3_F_TMR):
TAMRA-cacaggctattctttatcaaactcatc;
SEQ ID NO 38 (обратный праймер VRRB2 5_3_R):
cccaaggtgaagattgttgttga;
для амплификации локуса CL12:
SEQ ID NO 39 (прямой праймер CL12 5_4_F_ROX):
ROX-tctcactgtgcctcgctaaa;
SEQ ID NO 40 (обратный праймер CL12 5_4_R):
aagccaggtgcaaaaacagt;
Примечание - FAM, R6G, TAMRA, ROX флуоресцентные красители, присоединенные к 5'-концевому нуклеотиду, соответствующего праймера.
Кроме того, в состав набора реагентов включены: разбавитель, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец.
Состав заявляемого набора реагентов приведен в таблице 1.
Таблица 1 - Состав набора реагентов «ОМ-Сибирская язва-Генотип»
| № | Состав набора | Описание | Объем/кол-во | Кол-во |
| 1 | Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-СЯ-Генотип1 | сухое вещество розового цвета | 1 мг | 48 пробирок |
| 2 | Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-СЯ-Генотип2 | сухое вещество розового цвета | 1 мг | 48 пробирок |
| 3 | Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-СЯ-Генотип3 | сухое вещество розового цвета | 1 мг | 48 пробирок |
| 4 | Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-СЯ-Генотип4 | сухое вещество розового цвета | 1 мг | 48 пробирок |
| 5 | Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-СЯ-Генотип5 | сухое вещество розового цвета | 1 мг | 48 пробирок |
| 6 | Разбавитель, РБ-Генотип | прозрачная бесцветная жидкость | 1,2 мл | 5 пробирок |
| 7 | Положительный контрольный образец, ПКО-СЯ-Генотип | сухое вещество белого цвета | 2 мг | 3 пробирки |
| 8 | Раствор для разбавления ПКО-СЯ-Генотип, ОКО |
прозрачная бесцветная жидкость | 1,5 мл | 8 пробирок |
Реакционные смеси в стрипованных микропробирках (лиофилизованные), РС-СЯ-Генотип1 - РС-СЯ-Генотип5, каждая расфасована в сорок восемь микропробирок (шесть стрипов) объемом 0,2 мл и упакована в непрозрачный полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 9×12 см. Все реакционные смеси в пакетах упакованы в один непрозрачный полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 15×20 см. Состав каждой реакционной смеси: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, четыре пары соответствующих флуресцентно-меченых олигонуклеотидов, фермент Taq ДНК-полимераза, трегалоза.
Разбавитель, РБ-Генотип, расфасован в пять пробирок из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающимися крышками, упакованных в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6×7 см, состав: ПЦР-буфер, хлорид магния, глицерол, вода для ПЦР.
Положительный контрольный образец (лиофилизованный), ПКО-СЯ-Генотип, расфасован в три пробирки из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающимися крышками, упакованных в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4×7 см, состав: смесь 20-ти рекомбинантных плазмид pGem-T, каждая из которых содержит встроенную специфическую последовательность соответствующего полиморфного локуса генома B.anthracis с известным количеством нуклеотидных повторов: CebBams-1, CebBams-3, CebBams-13, CebBams-15, CebBams-22, CebBams-23, VNTR32, pXO1, vrrC2, vrrC1, CebBams-30, VNTR17, VNTR16, vrrA, vrrB1, CL33, VNTR23, VNTR35, vrrB2, CL12.
Раствор для разбавления ПКО-СЯ-Генотип, ОКО, расфасован в три пробирки из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающимися крышками, упакованные в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6×7 см, состав: ТЕ-буфер.
Методика получения положительных контрольных образцов.
Положительный контрольный образец был получен методом клонирования. Компетентные клетки Е.coli линии ТОР 10 (Invitrogen, США) были трансформированы 20-тью рекомбинантными плазмидами pGem-T (Invitrogen, США), несущими встроенную специфическую последовательность соответствующего полиморфного локуса генома B.anthracis с известным количеством нуклеотидных повторов: CebBams-1, CebBams-3, CebBams-13, CebBams-15, CebBams-22, CebBams-23, VNTR32, pXO1, vrrC2, vrrC1, CebBams-30, VNTR17, VNTR16, vrrA, vrrB1, CL33, VNTR23, VNTR35, vrrB2, CL12.
Апробация набора реагентов.
Апробация набора реагентов была осуществлена на базе филиала ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров) с использованием водных суспензий агаровых культур штаммов возбудителя сибирской язвы из Государственной коллекции микроорганизмов I-II групп патогенности. Постановку ПЦР-РВ проводили в соответствии с разработанной инструкцией по применению набора реагентов на приборе АНК-32М производства ИАП РАН (г. Санкт-Петербург, Россия).
Инактивация материала.
Обеззараживание материала проводили согласно методическим указаниям по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности (МУ 1.3.2569-09).
Выделение ДНК.
Для выделения ДНК из инактивированных бактериальных суспензий использовали набор для выделения ДНК «М-Сорб» (ООО «Синтол», Россия). Полученные препараты ДНК использовали для проведения анализа.
Проведение генетического типирования.
Генетическое типирование с использованием набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа осуществляли в два этапа.
На первом этапе проводят амплификацию 20-ти VNTR-локусов генома Bacillus anthracis с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакцию амплификации для каждого образца проводили одновременно по всем пяти реакционным смесям (РС-СЯ-Генотип1 - РС-СЯ-Генотип2) из состава набора реагентов, следующего состава:
Реакционная смесь РС-СЯ-Генотип1: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в количестве 9 нмоль; праймер CebBams3 1_1_F_FAM в количестве 10 пмоль; праймер CebBams3 1_1_R в количестве 10 пмоль; праймер CebBams13 1_2_F_R6G в количестве 10 пмоль; праймер CebBams13 1_2_R в количестве 10 пмоль; праймер CebBams22 1_3_F_TMR в количестве 10 пмоль; праймер CebBams22 1_3_R в количестве 10 пмоль; праймер CebBams23 1_4_F_ROX в количестве 10 пмоль; праймер CebBams23 1_4_R в количестве 10 пмоль; фермент Taq ДНК-полимераза, 5 ед.; трегалоза, 5 %.
Реакционная смесь РС-СЯ-Генотип2: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в количестве 9 нмоль; праймер CebBams15 2_1_F_FAM в количестве 10 пмоль; праймер CebBams15 2_1_R в количестве 10 пмоль; праймер VNTR32 2_2_F_R6G в количестве 10 пмоль; праймер VNTR32 2_2_R в количестве 10 пмоль; праймер pXO1 2_3_F_TMR в количестве 10 пмоль; праймер pXO1 2_3_R в количестве 1 пмоль; праймер VRRC2 2_4_F_ROX в количестве 10 пмоль; праймер VRRC2 2_4_R в количестве 10 пмоль; фермент Taq ДНК-полимераза, 5 ед.; трегалоза, 5 %.
Реакционная смесь РС-СЯ-Генотип3: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в количестве 9 нмоль; праймер CebBams1 3_1_F_FAM в количестве 10 пмоль; праймер CebBams1 3_1_R в количестве 10 пмоль; праймер VRRC1 3_2_F_R6G в количестве 10 пмоль; праймер VRRC1 2_3_R в количестве 10 пмоль; праймер CebBams30 3_3_F_TMR в количестве 10 пмоль; праймер CebBams30 3_3_R в количестве 10 пмоль; праймер VNTR17 3_4_F_ROX в количестве 10 пмоль; праймер VNTR17 3_4_R в количестве 10 пмоль; фермент Taq ДНК-полимераза, 5 ед.; трегалоза, 5 %.
Реакционная смесь РС-СЯ-Генотип4: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в количестве 9 нмоль; праймер VNTR16 4_1_F_FAM в количестве 10 пмоль; праймер VNTR16 4_1_R в количестве 10 пмоль; праймер VRRA 4_2_F_R6G в количестве 10 пмоль; праймер VRRA 4_2_R в количестве 10 пмоль; праймер VRRB1 4_3_F_TMR в количестве 10 пмоль; праймер VRRB1 4_3_R в количестве 10 пмоль; праймер CL33 4_4_F_ROX в количестве 10 пмоль; праймер CL33 4_4_R в количестве 10 пмоль; фермент Taq ДНК-полимераза, 5 ед.; трегалоза, 5 %.
Реакционная смесь РС-СЯ-Генотип5: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в количестве 9 нмоль; праймер VNTR23 5_1_F_FAM в количестве 10 пмоль; праймер VNTR23 5_1_R в количестве 10 пмоль; праймер VNTR35 5_2_F_R6G в количестве 10 пмоль; праймер VNTR35 5_2_R в количестве 10 пмоль; праймер VRRB2 5_3_F_TMR в количестве 10 пмоль; праймер VRRB2 5_3_R в количестве 10 пмоль; праймер CL12 5_4_F_ROX в количестве 10 пмоль; праймер CL12 5_4_R в количестве 10 пмоль; фермент Taq ДНК-полимераза, 5 ед.; трегалоза, 5 %.
К каждой реакционной смеси добавляли по 20 мкл разбавителя (10×ПЦР-буфер; хлорид магния, 25 мМ; глицерол, 50 %; азид натрия 0,01 %; вода для ПЦР), 5 мкл отрицательного контрольного образца и 5 мкл исследуемого образца.
Постановку ПЦР осуществляли с использованием амплификатора
АНК-32М в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора. Оптимальный температурно-временной режим проведения ПЦР с учетом термодинамических характеристик праймеров и ДНК-зондов из состава набора реагентов для АНК-32М представлен в таблице 2.
Таблица 2 - Температурно-временной режим амплификации VNTR-локусов
| № п/п |
Температурно-временной режим | Число циклов |
| 1 | 95°С - 300 секунд | 1 |
| 2 | 60°С - 40 секунд | 35 |
| 3 | 95°C - 15 секунд |
На втором этапе проводят фрагментный анализ продуктов ПЦР методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией (например, Нанофор 05, производства ИАП РАН, г. Санкт-Петербург). При этом происходит электрофоретическое разделение фрагментов ДНК и осуществляется детекция их сигналов флуоресценции одновременно со стандартом размеров ДНК, представляющим собой смесь олигонуклеотидов известной длины. По положению исследуемых пиков флуоресценции относительно стандарта размеров ДНК, осуществляют определение размеров исследуемых ампликонов. Анализ результатов проводят в соответствии с инструкцией к прибору.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами (табл. 1-5, фиг. 1-5) и примерами (1-3).
Таблица 1. Состав набора реагентов «ОМ-Сибирская язва-Генотип»;
Таблица 2. Температурно-временной режим амплификации VNTR-локусов;
Таблица 3. Результаты внутривидовой дифференциации различных по происхождению штаммов B.anthracis с использованием набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип»;
Таблица 4. Результаты внутривидовой дифференциации штаммов B.anthracis с известным генетическим профилем с помощью набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип»;
Таблица 5. Результаты оценки воспроизводимости лабораторно-экспериментальных серий набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип»;
Фигура 1. Результаты автоматизированного гель-электрофоретического разделения с лазер-индуцируемой детекцией флуоресцентно-меченых продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК ПКО-СЯ-Генотип для реакционной смеси РС-СЯ-Генотип1: А - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Ceb-Bams-3, содержащего 29 повторов (цифрами от 1 до 30 обозначены известные повторы в данном локусе); Б - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Ceb-Bams-13, содержащего 24 повтора (цифрами от 1 до 75 обозначены известные повторы в данном локусе), В - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Ceb-Bams-22, содержащего 9 повторов (цифрами от 1 до 14 обозначены известные повторы в данном локусе); Г - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Ceb-Bams-23, содержащего 8 повторов (цифрами от 1 до 11 обозначены известные повторы в данном локусе);
Фигура 2. Результаты автоматизированного гель-электрофоретического разделения с лазер-индуцируемой детекцией флуоресцентно-меченых продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК ПКО-СЯ-Генотип для реакционной смеси РС-СЯ-Генотип2: А - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Ceb-Bams-15, содержащего 38 повторов (цифрами от 1 до 40 обозначены известные повторы в данном локусе); Б - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VNTR-32, содержащего 10 повторов (цифрами от 1 до 18 обозначены известные повторы в данном локусе), В - Электрофореграмма продукта амплификации локуса рХО1-aat, содержащего 12 повторов (цифрами от 1 до 14 обозначены известные повторы в данном локусе); Г - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VrrC2, содержащего 5 повторов (цифрами от 1 до 9 обозначены известные повторы в данном локусе);
Фигура 3. Результаты автоматизированного гель-электрофоретического разделения с лазер-индуцируемой детекцией флуоресцентно-меченых продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК ПКО-СЯ-Генотип для реакционной смеси РС-СЯ-Генотип3: А - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Ceb-Bams-1, содержащего 10 повторов (цифрами от 1 до 16 обозначены известные повторы в данном локусе); Б - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VrrC1, содержащего 10 повторов (цифрами от 1 до 11 обозначены известные повторы в данном локусе), В - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Ceb-Bams-30, содержащего 18 повторов (цифрами от 1 до 24 обозначены известные повторы в данном локусе); Г - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VNTR17, содержащего 4 повтора (цифрами от 1 до 12 обозначены известные повторы в данном локусе);
Фигура 4. Результаты автоматизированного гель-электрофоретического разделения с лазер-индуцируемой детекцией флуоресцентно-меченых продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК ПКО-СЯ-Генотип для реакционной смеси РС-СЯ-Генотип4: А - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VNTR16, содержащего 6+1 повторов (цифрами от 0 до 20+1 обозначены известные повторы в данном локусе); Б - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VrrA, содержащего 5 повторов (цифрами от 1 до 7 обозначены известные повторы в данном локусе), В - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VrrB1, содержащего 7 повторов (цифрами от 1 до 14 обозначены известные повторы в данном локусе); Г - Электрофореграмма продукта амплификации локуса CL33, содержащего 16 повторов (цифрами от 1 до 40 обозначены известные повторы в данном локусе);
Фигура 5. Результаты автоматизированного гель-электрофоретического разделения с лазер-индуцируемой детекцией флуоресцентно-меченых продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК ПКО-СЯ-Генотип для реакционной смеси РС-СЯ-Генотип5: А - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VNTR23, содержащего 4 повтора (цифрами от 1 до 6 обозначены известные повторы в данном локусе); Б - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VNTR23, содержащего 3 повтора (цифрами от 1 до 5 обозначены известные повторы в данном локусе), В - Электрофореграмма продукта амплификации локуса VrrB2, содержащего 4 повтора (цифрами от 1 до 7 обозначены известные повторы в данном локусе); Г - Электрофореграмма продукта амплификации локуса CL12, содержащего 16 повторов (цифрами от 1 до 20 обозначены известные повторы в данном локусе).
Пример 1
В эксперименте по оценке возможности проведения внутривидовой дифференциации штаммов B.anthracis с помощью набора реагентов исследовали ДНК различных по происхождению штаммов. Размеры продуктов амплификации полиморфных локусов ДНК исследуемых штаммов сибиреязвенного микроба определенные методом фрагментного анализа представлены в таблице 3.
Результаты генетического типирования штаммов B.anthracis, выделенных в различных географических регионах с использованием набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип» свидетельствуют о возможности внутривидовой дифференциации штаммов B.anthracis с помощью разработанного набора реагентов. Каждый исследованный штамм B.anthracis имел уникальный генетический профиль.
Пример 2
Оценку вероятности ложных причислений проводили с использованием ДНК штаммов B.anthracis с известным генотипом. Всего было исследовано 20 штаммов сибиреязвенного микроба. Для статистической достоверности каждый эксперимент проводили в трех повторах.
Результаты исследований штаммов сибиреязвенного микроба с известными генотипами с использованием набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип» представлены в таблице 4.
В результате проведенных исследований штаммов сибиреязвенного микроба с известными генетическими профилями, причислений ДНК штаммов к ложным генотипам выявлено не было, в каждом случае был подтвержден ранее описанный генотип.
Пример 3
Оценку воспроизводимости результатов эксперимента с использованием набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип» проводили с использованием положительного контрольного образца, входящего в состав набора реагентов. Расчет воспроизводимости и вероятности ложных причислений производили на основании 20 анализов.
Результаты оценки воспроизводимости лабораторно-экспериментальных серий набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип» представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Результаты оценки воспроизводимости лабораторно-экспериментальных серий набора реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип»
| Наименование исследуемого образца |
Количество совпадений выявленных генотипов (n=20) | |
| Абсолютное значение | Относительное значение, процент | |
| Положительный контрольный образец | 20 | 100 |
Данные, представленные в таблице 5, свидетельствуют, что испытываемые серии набора реагентов позволяют надежно дифференцировать различные по происхождению штаммы B.anthracis и выявлять их генотип.
Результаты автоматизированного гель-электрофоретического разделения с лазер-индуцируемой детекцией продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК ПКО-СЯ-Генотип, полученные с использованием генетического анализатора Нанофор-05 (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург) представлены на фиг. 1-5.
Таким образом, из вышеизложенного следует, что достигнут заявляемый технический результат, а именно: разработан набор реагентов, включающий флюоресцентно-меченые олигонуклеотидные праймеры, позволяющий достоверно проводить генетическое типирование штаммов возбудителя сибирской язвы по 20 VNTR-локусам методом фрагментного анализа.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Олигонуклеотидные праймеры для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа имеют представленную ниже структуру нуклеотидных последовательностей:
для амплификации локуса CebBams3:
SEQ ID NO 1 (прямой праймер CebBams3 1_1_F_FAM):
FAM-gcagcaacagaaaacttctctccaataaca;
SEQ ID NO 2 (обратный праймер CebBams3 1_1_R):
tcctccctgagaactgctatcacctttaac;
для амплификации локуса CebBams13:
SEQ ID NO 3 (прямой праймер CebBams13 1_2_F_R6G):
R6G-ctagtgcatttgaccctaatcttgt;
SEQ ID NO 4 (обратный праймер CebBams13 1_2_R):
aattgagaaattgctgtaccaaact;
для амплификации локуса CebBams22:
SEQ ID NO 5 (прямой праймер CebBams22 1_3_F_TMR):
TAMRA-accgttaattcacgtttagcaga;
SEQ ID NO 6 (обратный праймер CebBams22 1_3_R):
atcaaaaattcttggcagactga;
для амплификации локуса CebBams23:
SEQ ID NO 7 (прямой праймер CebBams23 1_4_F_ROX):
ROX-cggtctgtctctattattcagtggt;
SEQ ID NO 8 (обратный праймер CebBams23 1_4_R):
cctgttgctcctagtgatttcttac;
для амплификации локуса CebBams15:
SEQ ID NO 9 (прямой праймер CebBams15 2_1_F_FAM):
FAM-gtatttcccccagatacagtaatcc;
SEQ ID NO 10 (обратный праймер CebBams15 2_1_R):
gtgtacatgttgattcatgctgttt;
для амплификации локуса VNTR32:
SEQ ID NO 11 (прямой праймер VNTR32 2_2_F_R6G):
R6G-acagctaatacgtatggttcattccc;
SEQ ID NO 12 (обратный праймер VNTR32 2_2_R):
aagaactggatccaggagattata;
для амплификации локуса pXO1:
SEQ ID NO 13 (прямой праймер pXO1 2_3_F_TMR):
TAMRA-tcccaatttattaacgatcagattaagttca;
SEQ ID NO 14 (обратный праймер pXO1 2_3_R):
caagtctagaattagttgcttcataatggc;
для амплификации локуса vrrC2:
SEQ ID NO 15 (прямой праймер VRRC2 2_4_F_ROX):
ROX-ccagaagaagtggaacctgtagcac;
SEQ ID NO 16 (обратный праймер VRRC2 2_4_R):
gtctttccattaatcgcgctctatc;
для амплификации локуса CebBams1:
SEQ ID NO 17 (прямой праймер CebBams1 3_1_F_FAM):
FAM-agttcaagcgccagaaggttatgagttatc;
SEQ ID NO 18 (обратный праймер CebBams1 3_1_R):
gttgagcatgagaggtaccttgtccttttt;
для амплификации локуса vrrC1:
SEQ ID NO 19 (прямой праймер VRRC1 3_2_F_R6G):
R6G-catttcctcaagtgctacaggttc;
SEQ ID NO 20 (обратный праймер VRRC1 2_3_R):
gaagcaagaaagtgatgtagtggac;
для амплификации локуса CebBams30:
SEQ ID NO 21 (прямой праймер CebBams30 3_3_F_TMR):
TAMRA-cagaaaatattggacctaccttcc;
SEQ ID NO 22 (обратный праймер CebBams30 3_3_R):
agctaatcacctacaacacctggta;
для амплификации локуса VNTR17:
SEQ ID NO 23 (прямой праймер VNTR17 3_4_F_ROX):
ROX-agaataataagggttctcatggtat;
SEQ ID NO 24 (обратный праймер VNTR17 3_4_R):
acggtaggtaaacaaattttcgtaatc;
для амплификации локуса VNTR16:
SEQ ID NO 25 (прямой праймер VNTR16 4_1_F_FAM):
FAM-agctaatcacctacaacacctggta;
SEQ ID NO 26 (обратный праймер VNTR16 4_1_R):
atgcatctcttgaaaatataaaacgca;
для амплификации локуса vrrA:
SEQ ID NO 27 (прямой праймер VRRA 4_2_F_R6G):
R6G-cacaactaccaccgatggcaca;
SEQ ID NO 28 (обратный праймер VRRA 4_2_R):
gcgcgtttcgtttgattcatac;
для амплификации локуса vrrB1:
SEQ ID NO 29 (прямой праймер VRRB1 4_3_F_TMR):
TAMRA-ataggtggttttccgcaagttattc;
SEQ ID NO 30 (обратный праймер VRRB1 4_3_R):
gatgagtttgataaagaatagcctgtg;
для амплификации локуса CL33:
SEQ ID NO 31 (прямой праймер CL33 4_4_F_ROX):
ROX-tggggtatattcccatcgaa;
SEQ ID NO 32 (обратный праймер CL33 4_4_R):
tgtaccgcagataccaacca;
для амплификации локуса VNTR23:
SEQ ID NO 33 (прямой праймер VNTR23 5_1_F_FAM):
FAM-tgggatcgtacaacagcaattatcat;
SEQ ID NO 34 (обратный праймер VNTR23 5_1_R):
acgcatttagaaacgttatcacgctta;
для амплификации локуса VNTR35:
SEQ ID NO 35 (прямой праймер VNTR35 5_2_F_R6G):
R6G-acccaaacaagagcaaacccaat;
SEQ ID NO 36 (обратный праймер VNTR35 5_2_R):
ttccctaaataatatgttccttttgctg;
для амплификации локуса vrrB2:
SEQ ID NO 37 (прямой праймер VRRB2 5_3_F_TMR):
TAMRA-cacaggctattctttatcaaactcatc;
SEQ ID NO 38 (обратный праймер VRRB2 5_3_R):
cccaaggtgaagattgttgttga;
для амплификации локуса CL12:
SEQ ID NO 39 (прямой праймер CL12 5_4_F_ROX):
ROX-tctcactgtgcctcgctaaa;
SEQ ID NO 40 (обратный праймер CL12 5_4_R):
aagccaggtgcaaaaacagt;
<---
Примечание - FAM, R6G, TAMRA, ROX флуоресцентные красители, присоединенные к 5'-концевому нуклеотиду, соответствующего праймера.
1. Набор реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа «ОМ-Сибирская язва-Генотип», состоящий из расфасованных в стрипованные микропробирки и лиофильно высушенных пяти реакционных смесей, включающих эквимолярную смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, Taq-ДНК-полимеразу, трегалозу, флюоресцентно-меченые праймеры, а также в отдельных микропробирках - разбавителя реакционных смесей, положительного контрольного образца, раствора для разбавления положительного контрольного образца, причем в состав первой реакционной смести входят: специфические праймеры для амплификации локуса CebBams3: SEQ ID NO 1 (FAM-gcagcaacagaaaacttctctccaataaca) и SEQ ID NO 2 (tcctccctgagaactgctatcacctttaac); для амплификации локуса CebBams13: SEQ ID NO 3 (R6G-ctagtgcatttgaccctaatcttgt) и SEQ ID NO 4 (aattgagaaattgctgtaccaaact); для амплификации локуса CebBams22: SEQ ID NO 5 (TAMRA-accgttaattcacgtttagcaga) и SEQ ID NO 6 (atcaaaaattcttggcagactga); для амплификации локуса CebBams23: SEQ ID NO 7 (ROX-cggtctgtctctattattcagtggt) и SEQ ID NO 8 (cctgttgctcctagtgatttcttac); в состав второй реакционной смести входят: специфические праймеры для амплификации локуса CebBams15: SEQ ID NO 9 (FAM-gtatttcccccagatacagtaatcc) и SEQ ID NO 10 (gtgtacatgttgattcatgctgttt); для амплификации локуса VNTR32: SEQ ID NO 11 (R6G-acagctaatacgtatggttcattccc) и SEQ ID NO 12 (aagaactggatccaggagattata); для амплификации локуса pXO1: SEQ ID NO 13 (TAMRA-tcccaatttattaacgatcagattaagttca) и SEQ ID NO 14 (caagtctagaattagttgcttcataatggc; для амплификации локуса vrrC2: SEQ ID NO 15 (ROX-ccagaagaagtggaacctgtagcac) и SEQ ID NO 16 (gtctttccattaatcgcgctctatc); в состав третьей реакционной смести входят: специфические праймеры для амплификации локуса CebBams1: SEQ ID NO 17 (FAM-agttcaagcgccagaaggttatgagttatc) и SEQ ID NO 18 (gttgagcatgagaggtaccttgtccttttt); для амплификации локуса vrrC1: SEQ ID NO 19 (R6G-catttcctcaagtgctacaggttc) и SEQ ID NO 20 (gaagcaagaaagtgatgtagtggac); для амплификации локуса CebBams30: SEQ ID NO 21 (TAMRA-cagaaaatattggacctaccttcc) и SEQ ID NO 22 (agctaatcacctacaacacctggta); для амплификации локуса VNTR17: SEQ ID NO 23 (ROX-agaataataagggttctcatggtat) и SEQ ID NO 24 (acggtaggtaaacaaattttcgtaatc); в состав четвертой реакционной смести входят: специфические праймеры для амплификации локуса VNTR16: SEQ ID NO 25 (FAM-agctaatcacctacaacacctggta) и SEQ ID NO 26 (atgcatctcttgaaaatataaaacgca); для амплификации локуса vrrA: SEQ ID NO 27 (R6G-cacaactaccaccgatggcaca) и SEQ ID NO 28 (gcgcgtttcgtttgattcatac); для амплификации локуса vrrB1: SEQ ID NO 29 (TAMRA-ataggtggttttccgcaagttattc) и SEQ ID NO 30 (gatgagtttgataaagaatagcctgtg); для амплификации локуса CL33: SEQ ID NO 31 (ROX-tggggtatattcccatcgaa) и SEQ ID NO 32 (tgtaccgcagataccaacca); в состав пятой реакционной смести входят: специфические праймеры для амплификации локуса VNTR23: SEQ ID NO 33 (FAM-tgggatcgtacaacagcaattatcat) и SEQ ID NO 34(acgcatttagaaacgttatcacgctta); для амплификации локуса VNTR35: SEQ ID NO 35 (R6G-acccaaacaagagcaaacccaat) и SEQ ID NO 36 (ttccctaaataatatgttccttttgctg); для амплификации локуса vrrB2: SEQ ID NO 37 (TAMRA-cacaggctattctttatcaaactcatc) и SEQ ID NO 38 (cccaaggtgaagattgttgttga); для амплификации локуса CL12: SEQ ID NO 39 (ROX-tctcactgtgcctcgctaaa) и SEQ ID NO 40 (aagccaggtgcaaaaacagt).
2. Набор реагентов по п. 1, характеризующийся тем, что положительный контрольный образец представляет собой смесь 20-ти рекомбинантных плазмид pGem-T, каждая из которых содержит встроенную специфическую последовательность соответствующего полиморфного локуса генома B.anthracis с известным количеством нуклеотидных повторов: CebBams-1, CebBams-3, CebBams-13, CebBams-15, CebBams-22, CebBams-23, VNTR32, pXO1, vrrC2, vrrC1, CebBams-30, VNTR17, VNTR16, vrrA, vrrB1, CL33, VNTR23, VNTR35, vrrB2, CL12.
