Рекомбинантный fab-scfv на основе нейтрализующего антитела против интерферона бета-1а человека и антитела против рецептора erbb2 человека

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантному биспецифическому антителу, селективно связывающему интерферон бета-1а человека и способному нейтрализовать его биологическую активность и связывающему рецептор ErbB2 человека. Также раскрыт изолированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь указанного антитела. Изобретение также относится к антигенсвязывающему фрагменту рекомбинантного биспецифического антитела, селективно связывающему интерферон бета-1а человека и рецептор ErbB2 человека. Изобретение позволяет получить новые биспецифические антитела с терапевтическим потенциалом и снизить побочные эффекты от применения интерферона бета-1а человека. 4 н.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и биохимии, в частности к биспецифическим антителам, их получению и применению.

Уровень техники

Известны моноклональные анти-IFNα антитела, которые связываются с подтипами интерферона-альфа (IFNα): IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8, IFNα10, IFNα21 и содержат три CDR участка тяжелой цепи. Описанные анти-IFNα антитела содержат, по меньшей мере, одну легкую цепь и одну тяжелую. Раскрыты варианты нуклеиновых кислот, кодирующих указанные антитела, и варианты векторов для экспрессии нуклеиновых кислот, а также варианты трансформированных клеток-хозяев. Среди векторов экспрессии описаны также векторы, депонированные под №2881 и под №2882, несущие соответственно тяжелую и легкую цепь антитела. Описан способ получения антитела из указанных клеток. Раскрыта гибридомная линия клеток мыши, депонированная в АТСС под номером №РТА-2917, и антитело, продуцируемое указанной линией. Описаны также варианты фармацевтической композиции на основе антитела и способ диагностики аутоиммунного заболевания. Раскрыто также применение антител для лечения заболевания или состояния, ассоциированного у пациента с повышенными уровнями IFNα. Использование изобретения позволяет одновременно подавлять биологическую активность, по крайней мере, семи подтипов IFNα человека, а именно IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8, IFNα10, IFNα21, что может найти применение в диагностике и терапии различных заболеваний человека, опосредуемых IFNα, таких как инсулинозависимый сахарный диабет или системная красная волчанка [Патент RU 2314317, С07К 16/24, опубл. 10.01.2008 г. ].

Известны антитела, которые избирательно нейтрализуют биологическую активность по крайней мере двух подтипов интерферона-альфа в отношении подтипов белка А, 2, В2, С, F, G, Н2, I, J1, К, 4а, 4b и WA, и не нейтрализуют по крайней мере одну биологическую активность белка IFNα подтипа D. Также в этом патенте представлено применение антитела для производства лекарственного средства. Кроме того, в этом патенте представлены продуцирующие антитело клетка-хозяин и гибридома. Антитела по изобретению эффективны для выявления подтипов IFNα в образце или ткани и/или для терапевтического применения, включающего в себя лечение и/или улучшение состояния при связанном с IFNα заболевании, таком как системная красная волчанка (SLE), волчанка, диабет типа I, псориаз, СПИД и реакция "трансплантат против хозяина" [Патент RU 2431638C2 С07К 16/24, опубл. 20.10.2011 г.].

Известно гуманизированное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент (Fab), которые селективно связывают человеческий ИФН-γ и содержат вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где VH и VL имеют последовательности аминокислот соответственно SEQ ID NO: 1 и 2, представленные в описании в патенте RU 2539752. Также раскрыты фрагменты ДНК, кодирующие указанные антитело и его Fab-фрагмент; плазмидные ДНК для экспрессии указанных специфичных белков; и модифицированные клетки бактерий и эукариот, содержащие указанные плазмидные ДНК и предназначенные для экспрессии указанных антитела и его Fab-фрагмента. Предложены способы получения указанных антитела или его Fab-фрагмента, включающие культивирование указанных модифицированных клеток в питательной среде и выделение антитела и его Fab-фрагмента по изобретению RU 2539752 из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получить гуманизированное антитело или его Fab-фрагмент, связывающиеся с ИФН-γ с Кд 4,6 и IC₅₀ не менее 1,5 нМ в тесте на клетках U937, с сохранением аффинности исходного мышиного моноклонального антитела [Патент RU 2539752, С2 C07K 16/24, опубл. 27.01.2017 г.].

Известно гуманизированное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент (Fab), которые селективно связывают человеческий IFN-γ и содержат вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где VH и VL имеют последовательности аминокислот соответственно SEQ ID NO: 1 и 2, представленные в описании. Также раскрыты фрагменты ДНК, кодирующие указанные антитело и его Fab-фрагмент; плазмидные ДНК для экспрессии указанных специфичных белков; и модифицированные клетки бактерий и эукариот, содержащие указанные плазмидные ДНК и предназначенные для экспрессии указанных антитела и его Fab-фрагмента. Предложены способы получения указанных антитела или его Fab-фрагмента, включающие культивирование указанных модифицированных клеток в питательной среде и выделение антитела и его Fab-фрагмента по настоящему изобретению из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получить гуманизированное антитело или его Fab-фрагмент, связывающиеся с IFN-γ с Кд 4,6 и IC₅₀ не менее 1,5 нМ в тесте на клетках U937, с сохранением аффинности исходного мышиного моноклонального антитела [Патент RU 2539752 C2, С07Л 16/24, опубл. 27.01.2015 г.].

Известны бивалентные и тривалентные Fab-scFv на основе антитела РН1 к ассоциированному с поверхностями опухолевых клеток антигену MUC1, экспрессированные в клетках Pichia pastoris и в клетках млекопитающих - человека (НЕЛ293Т) и мыши (NS0). В этих Fab-scFv scFv PH1 были присоединены к С-концам тяжелой и легкой цепей Fab PH1 с помощью подвижных пептидных линкеров (EPSGP(G₄S)₃ и DVDGGSRGDGPG, соответственно). Вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепей антитела РН1 в scFv соединены подвижным линкером (G₄S)₃ и имеют на С конце легкой цепи гексагистидиновую последовательность. Производные антител эффективно экспрессируются в клетках млекопитающих NS0 и клетках дрожжей, и очищаются без гомодимера легкой цепи. Для выделения целевых продуктов используются комбинация осаждения сульфатом аммония, металл-аффинной хроматографии IMAC (Chelating Sepharose Fast Flow) и гель-фильтрации SEC (Sephacril S-200) [Efficient production of human bivalent and trivalent anti-MUC1 Fab-scFv antibodies in Pichia pastoris Steve Schoonooghe, Vladimir Kaigorodov, Monika Zawisza, Caroline Dumolyn, Jurgen Haustraete, Johan Grooten, Nico Mertens. BMC Biotechnol. 2009; 9: 70. Published online 2009 Aug 11. doi: 10.1186/1472-6750-9-70. PMCID: РМС2736937].

Известны слитные белки на основе рекомбинантного интерферона-а-2b человека и моноклонального гуманизированного антитела против опухолевого антигена HER2 с использованием транзиторной экспрессии в Nicotiana benthamiana. Проведена оптимизация генетических конструкций для обеспечения эффективной экспрессии и сборки полноценной молекулы целевого иммуноцитокина. Показана зависимость уровня экспрессии от размера линкера между цитокином и антителом в гибридной молекуле. Проведенная модификация последовательности домена интерферона посредством замены остатков цистеина на серии показала незначительное увеличение продукции целевого белка. Сборка полноразмерных молекул слитного белка подтверждена разработанным авторами качественным методом «комбинированного иммуноферментного анализа» (ИФА). Показано сохранение функции аффинного домена в составе слитных белков при взаимодействии с антигеном в ИФА [Кособокова Е.Н., Шешукова Е.В., Пинюгина М.В., Коноплина К.М., Косоруков B.C. Разработка технологии получения слитного белка на основе моноклонального гуманизированного антитела против опухолевого антигена HER2 и интерферона-а-2b человека из Nicotiana benthamiana. // Биотехнология (2019), N 2. - С. 49-57]. Эти белки могут быть использованы в онкотерапии для усиления воздействия интерферона альфа-2б в зоне локализации опухолей [Кособокова Е.Н., Шешукова Е.В., Щербаков А.И., Пинюгина М.В., Косоруков B.C. Получение векторных конструкций для экспрессии в Nicotiana benthamiana слитного белка на основе моноклонального гуманизированного антитела против опухолевого антигена HER2 и интерферона-α-2b человека // Проблемы современной науки и образования. (2017) №36 (118)].

Известно антитело Трастузумаб (трастузумаб, герцептин), селективно связывающееся с рецептором ErbB2 (HER2) человека с высокой аффинностью. Трастузумаб продуцируется в клетках СНО в варианте изотипа IgG1 каппа и используется для лечения опухолей, гиперэкспрессирующих ErbB2 (HER2) человека [Патент US 20060275305 A1, A61K 39/395, опубл. 07.12.2006]. Гуманизированное моноклональное антитело Трастузумаб (Герцептин), связывающееся с внеклеточным доменом HER2, было первым препаратом против HER2, одобренным для клинического применения [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp.3637-3643., Roche. Герцептин (трастузумаб). https://www.roche.ru/ru/produkty/katalog/gerceptin.html]. Связываясь с HER2, Трастузумаб вызывает эндоцитоз и деградацию рецептора HER2 с последующим ингибированием сигнальных каскадов PI3K и MAPK, что индуцирует p27kip1, который снижает активность cdk2 и вызывает остановку клеточного цикла и апоптоз. Также связывание трастузумаба с HER2 может модулировать иммунную систему по механизму антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), ингибировать ангиогенез, блокировать расщепление внеклеточного домена HER2 (ECD) с образованием р95 с повышенной киназной активностью. Использование трастузумаба как адъюванта в сочетании с химиотерапией или после нее, повышает безрецидивную и общую выживаемость пациентов с ранней стадией рака молочной железы [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp. 3637-3643]. Однако наличие или возникновение резистентности к трастузумабу является серьезной клинической проблемой и требует дальнейших исследований возможностей комплексной терапии. Кроме того, одна из проблем с применением трастузумаба в терапии онкозаболеваний заключается в том, что это антитело не может блокировать димеризацию HER2 с другими членами семейства HER, такими как EGFR и HER3, и не предотвращает передачу сигнала от этих гетеродимеров, что может способствовать снижению ответа на лечение [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp. 3637-3643.]. Это антитело является патентным предшественником полученного рекомбинантного биспецифического антитела.

Известно мышиное моноклональное антитело, связывающее интерферон бета-1а человека с константой диссоциации комплекса 3,2×10^-9 М и способное нейтрализовать его биологическую активность. Также известны изолированные фрагменты ДНК, кодирующие участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела. Специфичность моноклонального антитела к интерферону бета-1а человека подтверждена методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Нейтрализующая активность антитела показана в тесте по ингибированию антипролиферативного действия интерферона бета-1а. Установлены аминокислотная и нуклеотидная последовательности вариабельных доменов моноклонального антитела [Алиев, Т.К., Долгих, Д.А., Кирпичников, М.П., Панина, А.А., Рыбченко, B.C., Свешников, П.Г., Солопова, О.Н., Топорова, В.А., Шемчукова, О.Б. Моноклональное антитело, способное нейтрализовать биологическую активность интерферона бета-la человека. Заявка на патент №2018147193 от 28.12.2018]. Это антитело является патентным предшественником полученного рекомбинантного биспецифического антитела.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, было получение биспецифического антитела, способного к связыванию с интерфероном бета-1а человека и нейтрализации его биологической активности, и способного связывать ErbB2 человека, как потенциального агента для лечения опухолей с гиперэкспрессией HER2 (рак молочной железы и распространенная аденокарцинома желудка или пищеводно-желудочного перехода с опухолевой гиперэкспрессией HER2). А также получение изолированных фрагментов ДНК, кодирующих участки легкой и тяжелой цепей указанного биспецифического антитела и антигенсвязывающего фрагмента указанного биспецифического антитела.

Техническим результатом является получение нового биспецифического Fab-scFv антитела, способного к связыванию с интерфероном бета-1а человека и нейтрализации его биологической активности, и способного связывать ErbB2 человека, на основе кодирующих последовательностей двух антител - нейтрализующего антитела к интерферону бета-1а человека, и антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 (HER2), далее антитела B16Fab-TzLH(6). В этом Fab-scFv одноцепочечный вариант антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 (Трастузумаб) присоединен к С-концу Fab-варианта тяжелой цепи антител к интерферону бета-1а человека. Связывание с интерфероном бета-1а человека обеспечивает Fab, a scFv - с рецептором HER2. Для упрощения выделения целевых белков с помощью аффинной хроматографии на С-конец scFv помещается гексагистидиновая последовательность. В качестве линкера между Fab и scFv используются последовательности link1 EPSGP и link2 (GGGGS)₃. В качестве линкера link3 между вариабельными доменами в scFv используется последовательность (GGGGS)₆. Также техническим результатом является расширение арсенала средств аналогичного назначения, а именно получение нового биспецифического нейтрализующего антитела B16Fab-TzLH(6) к интерферону бета-1а человека, способного связывать также ErbB2 человека.

Поставленная техническая проблема решается получением рекомбинантного Fab-scFv антитела, селективно связывающего интерферон бета-1а человека и нейтрализующего его биологическую активность, и способного связывать ErbB2 человека. Рекомбинантное биспецифическое антитело B16Fab-TzLH(6) включает B16H-TzLH(6), состоящий из Fab-варианта тяжелой цепи нейтрализующего антитела к интерферону бета-1a человека и одноцепочечного варианта scFv антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 и содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1; а аминокислотная последовательность легкой цепи нейтрализующего антитела к интерферону бета-1а человека содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 (Фиг. 1).

Поставленная техническая проблема решается также тем, что установлен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий B16H-TzLH(6) указанного бифункционального антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3 (Фиг. 1).

Поставленная техническая проблема решается также тем, что получен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь указанного биспецифического антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 (Фиг. 1).

Поставленная техническая проблема решается также тем, что получены антигенсвязывающие фрагменты указанного биспецифического антитела, содержащие для Fab вариабельные участки тяжелой (VH) и легкой цепи (VL) нейтрализующего антитела к интерферону бета-1а человека, а для одноцепочечного варианта scFv вариабельные участки тяжелой (VH) и легкой цепи (VL) антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2.

Новое рекомбинантное биспецифическое Fab-scFv антитело B16Fab-TzLH(6), селективно связывающее интерферон бета-1а человека и нейтрализующее его биологическую активность, а также связывающее ErbB2 человека, настоящего изобретения характеризуется тем, что B16H-TzLH(6), состоящий из Fab-варианта тяжелой цепи нейтрализующего антитела к интерферону бета-1а человека и одноцепочечного варианта scFv антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 указанного антитела содержит (Фиг. 2)

(i) CDR1-H1 с последовательностью аминокислот GFTFTSYTMS из SEQ ID NO: 1;

(ii) CDR1-H2 с последовательностью аминокислот YISNGGGSTYYPDTVKG из SEQ ID NO: 1;

(iii) CDR1-H3 с последовательностью аминокислот LDWVFAY из SEQ ID NO: 1.

(iv) CDR2-L1 с последовательностью аминокислот RASQDVNTAVA из SEQ ID NO: 1;

(v) CDR2-L2 с последовательностью аминокислот SASFLYS из SEQ ID NO: 1;

(vi) CDR2-L3 с последовательностью аминокислот QQHYTTPPT из SEQ ID NO: 1.

(vii) CDR2-H1 с последовательностью аминокислот GFNIKDTYIH из SEQ ID NO: 1;

(viii) CDR2-H2 с последовательностью аминокислот RIYPTNGYTRYADSVKG из SEQ ID NO: 1;

(ix) CDR2-H3 с последовательностью аминокислот WGGDGFYAMDY из SEQ ID NO: 1.

(x) link1 с последовательностью аминокислот EPSGP из SEQ ID NO: 1.

(xi) link2 с последовательностью аминокислот (GGGGS)₃ из SEQ ID NO: 1.

(xii) link3 с последовательностью аминокислот (GGGGS)₆ из SEQ ID NO: 1.

При этом вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит (Фиг. 2)

(i) CDR1 с последовательностью аминокислот KASQDVGTAVA из SEQ ID NO: 2;

(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот WASTRHT из SEQ ID NO: 2;

(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот LQYSSFPYT из SEQ ID NO: 2.

Новое рекомбинантное биспецифическое Fab-scFv антитело B16Fab-TzLH(6) сконструировано на основе мышиного моноклонального антитела В16, полученного путем иммунизации мышей Balb/C человеческим рекомбинантным интерфероном-бета, экспрессированным в E.coli (E.coli-HuIFN-β), получением и селекцией линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному интерферону бета-1а человека, анализа аффинности и специфичности отобранного моноклонального антитела, определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности его вариабельных доменов. В Fab-scFv антителе B16Fab-TzLH(6) одноцепочечный вариант антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 (Трастузумаб) присоединен к С-концу Fab-варианта тяжелой цепи антитела В16 к интерферону бета-1а человека. Связывание с интерфероном бета-1а человека обеспечивает Fab, a scFv - с рецептором HER2. Для упрощения выделения целевых белков с помощью аффинной хроматографии на С-конец scFv помещается гексагистидиновая последовательность. В качестве линкера между Fab и scFv используются последовательности link1 EPSGP и link2 (GGGGS)₃. В качестве линкера link3 между вариабельными доменами в scFv используется последовательность (GGGGS)₆. Получены кодирующие последовательности рекомбинантного биспецифического Fab-scFv антитела B16Fab-TzLH(6), на их основе созданы вектора для экспрессии полноразмерной версии рекомбинантного антитела B16Fab-TzLH(6) в клетках СНО. Антитело выделено и его аффинность и специфичность, а также способность нейтрализовать биологическую активность интерферона бета-1а человека изучены.

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата [Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office] в сочетании с данными рентгеноструктурного анализа. Участки CDRs и каркасные участки антител могут также быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике [International Immunogenetics Information System, www.imgt.org].

Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein [Kohler et al., (1976) Nature 256: pp.495-497]. Моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин «выращенные клетки», использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др. [Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988]. Получение материала, использующегося в качестве антигена для инъекции животных, включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, а также любыми другими методами, известными из уровня техники [Harlow и др. Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988].

Антитела к ассоциированным с опухолью поверхностным антигенам активно используются для иммунотерапии злокачественных опухолей человека, являясь более специфическими и обладая меньшим побочным эффектом, чем химиотерапевтические препараты [Sharkey, R.M., Goldenberg, D.M. // СА Cancer J Clin. 2006, vol. 56(4), pp.226-243.]. Однако полноразмерные антитела обладают слабой проникающей способностью в опухоли в связи с замедлением диффузии через стенки сосудов. В то же время, молекулы менее 60 кДа обычно выводятся слишком быстро, не обеспечивая достаточного накопления в опухоли. Поэтому получение модифицированных вариантов антител со средним размером молекул, что увеличивает проникающую способность препарата и увеличивает время его жизни в кровотоке, является наиболее перспективным [Schoonooghe, S., Kaigorodov, V., Zawisza, M., Dumolyn, C., Haustraete, J., Grooten, J., Mertens, N. // BMC Biotechnol., 2009, vol. 9, 70.].

Производные антител с отсутствующим эффекторным доменом Fc могут использоваться в качестве блокирующих агентов для рецепторов факторов роста и индукторов апоптоза [Schoonooghe, S., Kaigorodov, V., Zawisza, М., Dumolyn, С., Haustraete, J., Grooten, J., Mertens, N. // BMC Biotechnol., 2009, vol. 9, 70.]. Антитела и их производные могут также быть использованы как переносчики цитотоксических веществ (радиоизотопы, лекарственные препараты, токсины, цитокины, другие биологически активные белки) к опухоли [Schoonooghe, S., Kaigorodov, V., Zawisza, М., Dumolyn, С., Haustraete, J., Grooten, J., Mertens, N. // BMC Biotechnol., 2009, vol. 9, 70.]. Для этих же целей могут быть использованы биспецифические антитела [Sharkey, R.M., Goldenberg, D.M. // СА Cancer J Clin. 2006, vol. 56(4), pp.226-243.].

Рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) сверхэкспрессируется в 20-30% случаев рака молочной железы и связан со снижением выживаемости пациентов [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp.3637-3643.]. Кроме того, с опухолевой гиперэкспрессией HER2 связана и распространенная аденокарцинома желудка или пищеводно-желудочного перехода [Roche. Герцептин (трастузумаб). https://www.roche.ru/ru/produkty/katalog/gerceptin.html].

Гуманизированное моноклональное антитело Трастузумаб (Герцептин), связывающееся с внеклеточным доменом HER2, было первым препаратом против HER2, одобренным для клинического применения [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp.3637-3643., Roche. Герцептин (трастузумаб). https://www.roche.ru/ru/produkty/katalog/gerceptin.html]. Связываясь с HER2, Трастузумаб вызывает эндоцитоз и деградацию рецептора HER2 с последующим ингибированием сигнальных каскадов PI3K и MAPK, что индуцирует p27kip1, который снижает активность cdk2 и вызывает остановку клеточного цикла и апоптоз. Также связывание трастузумаба с HER2 может модулировать иммунную систему по механизму антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), ингибировать ангиогенез, блокировать расщепление внеклеточного домена HER2 (ECD) с образованием р95 с повышенной киназной активностью. Использование трастузумаба как адъюванта в сочетании с химиотерапией или после нее, повышает безрецидивную и общую выживаемость пациентов с ранней стадией рака молочной железы [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp.3637-3643.]. Однако наличие или возникновение резистентности к трастузумабу является серьезной клинической проблемой и требует дальнейших исследований возможностей комплексной терапии. Кроме того, одна из проблем с применением трастузумаба в терапии онкозаболеваний заключается в том, что это антитело не может блокировать димеризацию HER2 с другими членами семейства HER, такими как EGFR и HER3, и не предотвращает передачу сигнала от этих гетеродимеров, что может способствовать снижению ответа на лечение [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp.3637-3643.].

Интерферон бета-1a человека используется для лечения больных рецидивирующим рассеянным склерозом, оказывая противовоспалительное и иммуносупрессорное действие. Кроме того, интерферон бета-1а обладает противовирусным, иммуномодулирующим и антипролиферативным действием [Интерферон бета-1а (Interferon beta-1a). Регистр лекарственных средств России. https://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_2711.htm]. Показана способность рекомбинантного IFN-β1a оказывать сильное антипролиферативное действие in vitro на клетки двух человеческих андроген-резистентных клеточных линий рака предстательной железы с нейроэндокринной дифференцировкой (DU-145, РС-3) [Dicitore, A., Grassi, E.S., Borghi, М.О., Gelmini, G., Cantone, M.C., Gaudenzi, G., Persani, L., Caraglia, M., Vitale, G. // J Endocrinol Invest. 2017, vol. 40(7), pp. 761-770], адренокортикальной карциномы (ACC линии H295 и SW13) [van Koetsveld, P.M., Vitale, G., de Herder, W.W., Feelders, R.A., van der Wansem, K., Waaijers, M., van Eijck, C.H., Speel, E.J., Croze, E., van der Lely, A.J., Lamberts, S.W., Hofland, L.J. // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2006, vol. 91(11), pp.4537-4543.], гастроэнтеропанкреатических нейроэндокринных опухолей [Vitale, G., de Herder, W.W., van Koetsveld, P.M., Waaijers, M., Schoordijk, W., Croze, E., Colao, A., Lamberts, S.W., Hofland, L.J. // Cancer Res., 2006, vol. 66(1), pp.554-562.], 3 клеточных линий аденокарциномы поджелудочной железы человека (ВхРС-3, MiaPaCa-2 и Panc-1) [Vitale, G., van Eijck, С.Н., van Koetsveld Ing, P.M., Erdmann, J.I., Speel, E.J., van der Wansem Ing, K., Mooij, D.M., Colao, A., Lombardi, G., Croze, E., Lamberts, S.W., Hofland L.J. // Annals of Surgery. 2007, vol. 246(2), pp.259-268.].

Как Трастузумаб, так и интерферон бета-1a разрешены к клиническому применению на территории Российской Федерации [Интерферон бета-1a (Interferon beta-la). Регистр лекарственных средств России, https://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_2711.htm, Трастузумаб (Trastuzumab). Регистр лекарственных средств России. https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_87759.htm].

В связи с этим получение биспецифических антител, связывающихся одновременно с HER2 и интерфероном бета-1а человека, как потенциального агента для лечения опухолей с гиперэкспрессией HER2 (рак молочной железы и распространенная аденокарцинома желудка или пищеводно-желудочного перехода с опухолевой гиперэкспрессией HER2) может иметь терапевтическое значение. Для этой создания таких антител выбраны антитело Трастузумаб и полученное нами ранее нейтрализующие антитело В16 к интерферону бета-1a человека [Рыбченко, B.C., Панина, А.А., Топорова, В.А., Аргентова, В.В., Якимов, С.А., Алиев, Т.К., Долгих, Д.А. // Казань: Издательство Казанского университета, 2018. В поисках моделей персонализированной медицины. Сборник научных трудов V Международной конференции «ПОСТГЕНОМ'2018», стр. 317.]. Одним из способов получения биспецифических антител является конструирование Fab-scFv. Они представляют собой объединение Fab-фрагмента одного антитела и одноцепочечного варианта другого антитела. В этом биспецифическом Fab-scFv антителе B16Fab-TzLH(6) одноцепочечный вариант антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 (Трастузумаб) присоединен к С-концу Fab-варианта тяжелой цепи антитела В16 к интерферону бета-1а человека. Связывание с интерфероном бета-1а человека обеспечивает Fab, a scFv - с рецептором HER2. Для упрощения выделения целевых белков с помощью аффинной хроматографии на С-конец scFv помещается гексагистидиновая последовательность. В качестве линкеров между Fab и scFv, обеспечивающих подвижность соединения, используют последовательность EPSGP (link1) и последовательность (GGGGS)₃ (link2). В качестве линкера между вариабельными доменами в scFv (link3) используют последовательность (GGGGS)₆. Эти линкеры выбраны на основании литературных данных [Brinkmann, U., Kontermann, R.E. // MAbs. 2017, vol. 9(2), pp.182-212.]. В качестве вектора для обеспечения биосинтеза целевого белка в клетках эукариот используется плазмида pcDNA3.4 Poly40 (собственная модификация вектора pcDNA3.4 (Invitrogen) со встроенным полилинкером).

Однако, сложностью при таком подходе является вероятность падения аффинности и специфичности антител при их объединении в биспецифическое антитело в связи с возможными нарушениями в структуре модифицированных антител по сравнению с исходным.

Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (а) анализ последовательностей антител и составление кодирующих последовательностей биспецифических рекомбинантных тяжелых и легких цепей и их получение в составе экспрессионных векторов, (b) биосинтез, выделение и исследование рекомбинантного биспецифического антитела.

В частности, антителом согласно настоящему изобретению является рекомбинантное биспецифическое Fab-scFv антитело B16Fab-TzLH(6), селективно связывающее интерферон бета-1а человека и нейтрализующее его биологическую активность, а также связывающее ErbB2 человека.

Таким антителом является антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое антитело селективно связывается с интерфероном бета-1а человека и нейтрализует его биологическую активность, а также связывает рецептор ErbB2 человека. Консервативные участки тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелой цепи согласно настоящему изобретению. Консервативные участки легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда могут быть использованы в качестве консервативных участков для легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению.

В настоящем изобретении фраза "антитело, обладающее способностью к связыванию с рекомбинантным интерфероном-бета человека и рецептором ErbB2 человека» означает молекулу, которая связывается с интерфероном-бета человека и рецептором ErbB2 человека и образует стабильный комплекс.Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом иммуноферментного анализа (ИФА), равновесным диализом, с использованием плазмон-поверхностного резонанса. Методы определения аффинности хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. [Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)].

Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело, согласно настоящему изобретению является фрагмент ДНК, кодирующий вариабельные легкую или тяжелую цепи рекомбинантного бюиспецифического Fab-scFv антитела, селективно связывающего интерферон-бета человека и нейтрализующего его биологическую активность, а также связывающего рецептор ErbB2 человека, содержащего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.

Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO: 3 или 4 при условии, что они кодируют участки цепей антитела, содержащего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.

Используемый в настоящем документе термин «антигенсвязывающая область» антитела обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb [Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546], состоящий из домена VH; и (vi) отдельная определяющая комплементарность область (CDR). Более того, несмотря на то что два домена в фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антигенсвязывающая область» антитела.

Краткое описание чертежей и таблиц, иллюстрирующих изобретение

На Фиг. 1 показаны аминокислотные (SEQ ID NO: 1 и 2) и нуклеотидные (SEQ ID NO: 3 и 4) последовательности биспецифического Fab-scFv антитела B16Fab-TzLH(6), способного к связыванию с интерфероном бета-1а человека и нейтрализации его биологической активности, и способного связывать ErbB2 человека.

На Фиг. 2 показано расположение участков CDRs в вариабельных доменах легких и тяжелых цепей биспецифического Fab-scFv антитела B16Fab-TzLH(6). Участки CDRs подчеркнуты.

На Фиг. 3 показана схема получения укороченных Fab-вариантов Н-цепей антитела В16, способного к связыванию с интерфероном бета-1а человека и нейтрализации его биологической активности, с присоединенными к С-концу СН1-домена линкерами link1 и link2.

На Фиг. 4 показана схема получения кодирующей последовательности одноцепочечного варианта scFv антитела Трастузумаб к ErbB2 человека с гексагистидиновой последовательностью на С-конце (TzL-link3-H-6His).

На Фиг. 5 показано схематическое изображение плазмид pcDNA3.4-B16L и pcDNA3.4-B16H-TzLH(6) в области экспрессируемых генов.

На Фиг. 6 показаны кривые титрования Fab-scFv в непрямом ИФА по сравнению с исходным моноклональным антителом В16. Ось X - концентрация биспецифического антитела нг/мл. Ось Y - А₄₅₀.

На Фиг. 7 показаны результаты нейтрализации антипролиферативной активности ИФН-бета биспецифическими Fab-scFv. НТ29 - клетки линии аденокарциномы кишечника (не экспрессирующей HER2), SCOV3 HER2+ - клетки линии аденокарциномы яичника человека (с гиперэкспрессией HER2), SCOV3 - клетки с низкой экспрессией HER2.

В Таблице 1 приведен состав олигонуклеотидных праймеров для получения Fab-scFv.

Осуществление изобретения

Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.

Пример 1. Получение генов рекомбинантного биспецифического Fab-scFv антитела B16Fab-TzLH(6), способного к связыванию с интерфероном бета-1а человека и нейтрализации его биологической активности, и способного связывать ErbB2 человека.

Конструирование Fab-scFv является одним из способов получения биспецифических антител. Fab-scFv представляют собой объединение Fab-фрагмента одного антитела и одноцепочечного варианта другого антитела.

На основе кодирующих последовательностей антитела В16 к интерферону бета-1а человека [Алиев, Т.К., Долгих, Д.А., Кирпичников, М.П., Панина, А.А., Рыбченко, B.C., Свешников, П.Г., Солопова, О.Н., Топорова, В.А., Шемчукова, О.Б. Моноклональное антитело, способное нейтрализовать биологическую активность интерферона бета-1а человека. Заявка на патент №2018147193 от 28.12.2018] и антитела Трастузумаб [Nahta, R., Esteva, F. // Oncogene. 2007, vol. 26, pp.3637-3643.] конструируются Fab-scFv следующего состава - одноцепочечные варианты антитела Трастузумаб, присоединеные к С-концу Fab-варианта тяжелой цепи антитела к интерферону бета-1а человека. Для выделения целевых белков с помощью аффинной хроматографии на С-конец scFv помещена гексагистидиновая последовательность. В качестве линкеров между Fab и scFv, обеспечивающих подвижность соединения, используются последовательность EPSGP (link1) и последовательность (GGGGS)₃ (link2). В качестве линкера между вариабельными доменами в scFv (link3) используется последовательность (GGGGS)₆. Эти линкеры выбраны на основании литературных данных [Brinkmann, U., Kontermann, R.E. // MAbs. 2017, vol. 9(2), pp.182-212.].

В качестве вектора для обеспечения биосинтеза целевого белка в клетках эукариот выбрана плазмида pcDNA3.4 Poly40 (собственная модификация вектора pcDNA3.4 (mvitrogen) со встроенным полилинкером).

Ранее нами получены плазмиды, содержащие гены легких и тяжелых цепей антитела Трастузумаб и нейтрализующего антитела В16 к интерферону бета-1 человека под контролем промотора CMV, регуляторного элемента WPRE и сайта полиаденилирования тимидинкиназы вируса простого герпеса TKpA, соответственно [Алиев, Т.К., Долгих, Д.А., Кирпичников, М.П., Панина, А.А., Рыбченко, B.C., Свешников, П.Г., Солопова, О.Н., Топорова, В.А., Шемчукова, О.Б. Моноклональное антитело, способное нейтрализовать биологическую активность интерферона бета-1а человека. Заявка на патент №2018147193 от 28.12.2018; B.C. Рыбченко, А.А. Панина, В.А. Топорова, В.В. Аргентова, С.А. Якимов, Т.К. Алиев, Д.А. Долгих. Конструирование и получение нейтрализующих химерных антител к интерферону бета. Казань: Издательство Казанского университета, 2018. В поисках моделей персонализированной медицины. Сборник научных трудов V Международной конференции «ПОСТГЕНОМ'2018». стр. 317.]. Кодирующие последовательности вариабельных доменов антитела трастузумаб против рецептора ErbB2 человека получают путем синтеза из синтетических олигонуклеотидов. Кодирующие последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей нейтрализующего антитела В16 получают согласно Заявке на патент №2018147193 от 28.12.2018 и объединяют с соответствующими константными доменами в составе вектора pcDNA3.4 Poly40.

Получение Fab-фрагмента В16. Для получения Fab-варианта ген тяжелой цепи антитела В16 укорачивают, оставляя первый константный домен и присоединяя к 3'-концу укороченного гена последовательности linkl и link2. Работу проводят в два этапа. На первом этапе на матрице плазмиды pcDNA3.4-TzH (схема получения Fab-варианта Н-цепи антитела В16 представлена на Фиг. 3) с помощью ПЦР с праймерами TzHF6 и IgG-link1 (Таблица 1), получают фрагмент, кодирующий CHI-домен IgG1 с присоединенным к С-концу линкером link1. При этом вместе с праймером IgG-link1 на 3'-конец фрагмента вместе с линкером link1 вносятся сайты узнавания рестриктаз XmaI, BamHI и XhoI для последующих клонирований. Полученный фрагмент клонируют в плазмиду pcDNA3.4-В16Н по сайтам узнавания рестриктаз Bsp120I и XhoI. Таким образом получают плазмиду pcDNA3.4-B16Hvcl-linkl (Фиг. 3).

На втором этапе к Fab-варианту гена тяжелой цепи антитела В16 с linkl присоединяют кодирующую последовательность link2 (кодирует (GGGGS)₃). Для этого с помощью отжига фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров Link2F2 и Link2R2 (Таблица 1) получают олигонуклеотидный дуплекс с «липкими» концами XmaI и ВаmHI, который клонируют в плазмиду pcDNA3.4-B16Hvc1-link1, предобработанную рестриктазами XmaI и BamHI с очисткой электрофорезом в 1% агарозе и последующим выделением из геля. Таким образом получают плазмиду pcDNA3.4-B16Hvc1-link1-link2 (Фиг. 3).

Получение scFv антитела Трастузумаб. Кодирующую последовательность одноцепочечного варианта scFv антитела Трастузумаб с гексагистидиновой последовательностью на С-конце получают с помощью ПЦР в несколько стадий. Состав олигонуклеотидных праймеров для всех стадий ПЦР приведен в Таблице 1.

На первой стадии получают фрагменты, содержащие кодирующие последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела Трастузумаб с помощью ПЦР (PCR1) с специфическими для цепей праймерами Tz1-HF2 и B10-HR2 для тяжелой и Tz1-LF2 и Tz1-LR2 для легкой цепи. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Фрагменты выделяют из геля и используют для второй стадии ПЦР (PCR2) с универсальными перекрывающимися олигонуклеотидными праймерами Link2F3 и Link2R3, вносящими на 3'-конец первых фрагментов и 5'-конец вторых фрагментов участки link3. Для легкой цепи (первый фрагмент) используют праймеры Tz1-LF2 и Link2R3, для тяжелой Link2F3 и B10-HR2. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Фрагменты выделяют из геля и используют для третьей стадии ПЦР (SOE-PCR) с концевыми праймерами Tz1-LF2 и B10-HR2, которые вносят на концы сайты рестрикции BamHI и XhoI, а также кодирующую последовательность 6His на 3'-конец фрагмента перед сайтом XhoI. Продукты реакции клонируют в вектор pAL-TA (Евроген) и секвенируют.Схема получения кодирующей последовательности одноцепочечного варианта scFv антитела Трастузумаб к ErbB2 человека с гексагистидиновой последовательностью на С-конце (TzL-link3-H-6His) представлена на Фиг. 4.

Получение экспрессионных векторов Fab-scFv. Для получения Fab-scFv фрагмент scFv антитела Трастузумаб клонируют по сайтам узнавания рестриктаз BamHI и XhoI в вектор и pcDNA3.4-B16Hvc1-link1-link2. Таким образом получают плазмиду pcDNA3.4-B16H-TzLH(6), содержащую B16H-TzLH(6), состоящий из Fab-варианта тяжелой цепи нейтрализующего антитела к интерферону бета-1а человека и одноцепочечного варианта scFv антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2 под контролем промотора CMV, регуляторного элемента WPRE и сайта полиаденилирования тимидинкиназы вируса простого герпеса TKpA. Эту плазмиду совместно с плазмидой pcDNA3.4-B16L (Фиг. 5) используют для биосинтеза рекомбинантного биспецифического антитела B16Fab-TzLH(6) в клетках СНО.

Пример 2. Получение рекомбинантного биспецифического антитела B16Fab-TzLH(6).

Транзиентная экспрессия Fab-scFv антитела B16Fab-TzLH(6) в клетках СНО DG44 (dhfr -/-). Клетки яичника китайского хомячка СНО DG44 (dhfr -/-) используют для секретируемой экспрессии рекомбинантного Fab-scFv. Для этого клетки культивируют в колбах Эрленмейера в СО₂-инкубаторе при 37°С, 95% влажности и 8% СО₂ в стандартной бессывороточной среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen, USA) до концентрации 4×10⁶ клеток/мл 24 часа до трансфекции. Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевают 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и через 20-24 ч проводят трансфекцию с использованием трансфецирующего реагента Lipofectamine-3000 Transfection Kit (Invitrogen, USA) согласно стандартному протоколу производителя [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, электронный вариант протокола доступен https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf.].

Плазмидную ДНК добавляют к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Культуральный флакон инкубируют при температуре 37°С, 95% влажности, в атмосфере 8% СО₂ и непрерывном перемешивании 130 об/мин. После 7-9 дней инкубации культуры осаждают центрифугированием при 1200 оборотах/мин в течение 10 минут. Супернатант дополнительно осветляют центрицугированием при 4000 оборотов/мин в течение 15 минут.

Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводят с использованием 0.04% раствора трипанового синего в камере Горяева. Продуктивность измеряют с помощью иммуноферментного анализа по стандартной методике.

Очистка Fab-scFv антитела B16Fab-TzLH(6). Проводят выделение антитела B16Fab-TzLH(6) из культуральной жидкости на колонке с носителем HiTrap KappaSelect (GE Healtcare) объемом 5 мл. К культуральной жидкости добавляют 0,1 объема 10-кратного Tris-HCl буфера (200 мМ Tris-HCl, 1,5 М NaCl рН 7.2) и наносят на предварительно уравновешенную колонку при скорости потока 2-3 мл/мин при давлении не более 0,5 МПа. Колонку промывают буфером Tris-HCl объемом равным 5 объемам колонки. Элюцию осуществляют с помощью глицинового буфера (0.1 М глицин, рН 3.0). Элюированный раствор нейтрализуют, добавляя 0,1 объема буфера для нейтрализации (1 М Tris рН 8.0). Полученный раствор белка диализуют против фосфатного буфера (0,01 М Na₂HPO₄, 0.137 М NaCl, 0.0027 М KCl, рН 7,2) и стерилизуют через мембранные фильтры 0.22 мкм. Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят с использованием электрофоретического метода [Laemmli, U.K. // Nature, 1970, vol. 227, pp.680-685]. Дополнительно образцы характеризуют с помощью гель-фильтрации по стандартной методике. Концентрацию целевых белков определяют спектрофотометрически с использованием NanoPhotometer Р300 (IMPLEN, Germany).

Пример 3. Анализ рекомбинантного биспецифического Fab-scFv антитела B16Fab-TzLH(6).

Непрямой ИФА. Непрямой ИФА используют для определения способности полученных белков взаимодействовать с ИФН-бета или рекомбинантным внеклеточным доменом HER2. Антигены в буфере PBS (0.5 мкг/мл) сорбируют на планшет, блокируют 5% раствором BSA в PBS и промывают.Затем добавляют исследуемые белки, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, промывают раствором 0.05% Tween 20 в PBS. После промывки добавляют конъюгат моноклонального антитела 4G7 (ООО «Биалекса», Россия) с пероксидазой хрена в разведении 1:75000, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, промывают раствором 0.05% Tween 20 в PBS и добавляют проявляющий субстрат тетраметилбензидин. После развития окраски реакцию останавливают добавлением 10% серной кислоты. Измеряют оптическое поглощение при 450 нм. Кривые титрования Fab-scFv в непрямом ИФА по сравнению с исходным моноклональным антителом В16 представлены на Фиг. 6.

Непрямой ИФА с использованием клеточных лизатов. ИФА проводят на лизатах клеток различных опухолевых линий, как экспрессирующих, так и не экспрессирующих HER2. Для приготовления лизатов культуральные флаконы или чашки Петри помещают на лед, промывают один раз холодным PBS, затем снимают клетки при помощи культурального скребка. Клеточный осадок дважды промывают холодным PBS, центрифугируя со скоростью 2000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Затем клеточный осадок лизируют буфером RIPA с добавлением ингибиторов протеаз 1 mM PMSF и 1 mM апротинина. Состав буфера RIPA: 20 мМ Tris-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 1 мМ Na₂EDTA, 1 мМ EGTA, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 2.5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ b-глицерофосфат, 1 мМ Na₃VO₄, 1 мкг/мл леупептина. Осадок обрабатывают ультразвуком для наиболее полной экстракции мембранных белков, затем центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об./мин и температуре 4°С.Супернатанты отбирают, измеряют в них концентрацию белка, аликвоты супернатантов хранят при -20°С.Для проведения ИФА используют процедуру, описанную выше, с некоторыми вариациями. Клеточные лизаты сорбируют на планшет в концентрации 10 мкг/мл в PBS (0.01М KH₂PO₄, 0.1М NaCl), рН 7.2-7.4 по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для ИФА в течение ночи при 4°С. Планшет трижды отмывают PBS Т (0.1% Твин 20) по 200 мкл в лунку. Образцы биспецифических антител титруют от 3000 нг/мл с шагом 3 в PBS-AT (0.01М KH₂PO₄, 0.1М NaCl, 0.2% БСА, 0.1% Твин 20). Планшет инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Отмывки, реакцию с конъюгатом, проявление и измерение оптического поглощения проводят, как описано выше.

В качестве положительного контроля используют антитело трастузумаб (Герцептин) в концентрации 10 мкг/мл.

Определение одновременного связывания интерферона-бета и рецептора ErbB2 методом «сэндвич»-ИФА. Подтверждение биспецифического характера связывания полученного антитела проводят с помощью «сэндвич»-ИФА в двух вариантах. В 1-ом варианте на твердую фазу сорбируют ИФН-бета (1 мкг/мл) в количестве 100 мкл/лунку, затем после блокировки инкубируют с Fab-scFv (1 мкг/мл) в серийных разведениях, кратным 3. После отмывки несвязавшихся антител добавляют биотинилированный рекомбинантный HER2 (200 нг/мл) и конъюгат авидин-пероксидаза хрена (150 нг/мл). Во 2-ом варианте на твердую фазу сорбируют рекомбинантный внеклеточный домен HER2 (200 нг/мл), затем Fab-scFv также в серийных разведениях, биотинилиро ванный ИФН-бета (250 нг/мл) и конъюгат авидин-пероксидаза хрена (150 нг/мл). В качестве контроля используют моноспецифичные антитела: химерное нейтрализующее антитело против ИФН-бета, антитело против HER2-рецептора (Герцептин) и полученное нами рекомбинантное антитело Трастузумаб (аналог Герцептина).

Определение нейтрализующей активности Fab-scFv. Для анализа используют опухолевые клетки человека 3-х линий: аденокарцинома кишки НТ29, не экспрессирующая HER2; аденокарцинома яичника человека SKOV3 с низкой экспрессией HER2; аденокарцинома яичника человека SKOV3-HER2+с высокой экспрессией HER2. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МПК) выделяют из цельной крови здорового донора в градиенте фиколла-1077 по методике [Panda, S.K. and Ravindran, В. // Bio-protocol, vol. 3(3), 2013, pp.323].

Готовят серийные разведения антител биспецифических Fab-scFv, а также контрольных антител: мышиного антитела В16, нейтрализующего ИФН-бета, в качестве положительного контроля и биспецифического антитела, обладающего анти-HER2 активностью, но лишенного ИФН-бета-активности, в качестве отрицательного контроля (-Контроль). К антителам добавляют рекомбинантный гликозилированный ИФН-бета производства ООО «Фармапарк» в концентрации 3 нг/мл. Все растворы готовят в полной ростовой среде с 2% телячьей сывороткой.

Опухолевые клетки культивируют в смеси с МПК в присутствии ИФН-бета и антител в различных концентрациях. Конечные концентрации активных веществ и клеток составляют следующие значения: антитела - от 0 до 100 мкг/мл; ИФНб - 1нг/мл (0 в контрольных лунках); МПК - 50 тыс.клеток/лунку; опухоли: 3 тыс.клеток/лунку. Культивирование проводят в течение 5 суток. Количество живых клеток оценивают в тесте МТТ [Mosmann, Т. // J. of Immunol. Methods, 1983, vol. 65(1-2), pp. 55-63.]. Каждое измерение проводят в 4 повторах, находят среднее значение. Нейтрализующую активность антител выражают в % от скорости пролиферации клеток без ИФНб и вычисляли по формуле: % нейтрализации = (Ai - А0) / (А100 - А0) × 100%, где Ai - среднее значение оптической плотности в лунках с i-той концентрацией антитела; А0 - среднее значение оптической плотности в лунках с ИФН-бета без антител; А100 - среднее значение оптической плотности в лунках с без ИФН-бета и без антител. Поскольку биспецифические антитела обладают собственной антипролиферативной активностью по отношению к HER2 - позитивным клеткам за счет анти-HER2 активности (Tz), из показателей нейтрализующей активности для Fab-scFv вычитают соответствующие показатели для контрольного антитела -Контроль. Результаты нейтрализации антипролиферативной активности ИФН- бета биспецифическими Fab-scFv представлены на Фиг. 7.

Показано, что рекомбинантное биспецифическое Fab-scFv антитело B16Fab-TzLH(6) демонстрирует способность к связыванию с интерфероном бета-1а человека и нейтрализации его биологической активности, а также способность связывать ErbB2 человека, сравнимые с исходными антителами В16 и трастузумаб.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

110 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

120 Рекомбинантный Fab scFv на основе нейтрализующего антитела

против интерферона бета-1а человека и антитела против рецептора

ErbB2 человека

<160> 4

<210> SEQ ID NO:1

<211> 508

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asp Trp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Pro Ser Gly Pro

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

225 230 235 240

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

245 250 255

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val

260 265 270

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

275 280 285

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

290 295 300

Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

305 310 315 320

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

325 330 335

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser

340 345 350

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

355 360 365

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

385 390 395 400

Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln

405 410 415

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn

420 425 430

Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

435 440 445

Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

450 455 460

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly

465 470 475 480

Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

485 490 495

Ser Ala Ser Thr Lys Gly His His His His His His

500 505

<210> SEQ ID NO:2

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> SEQ ID NO:3

<211> 1527

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggt ttagtgcagc ctggagggtc 50

cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcact agctatacca 100

tgtcttgggt tcgccagact ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatac 150

attagtaatg gtggtggtag cacctactat ccagacactg taaagggccg 200

attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga 250

gcagtctgaa gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagactggac 300

tgggtgtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc 350

cagcacgaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca 00

cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 45

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca 00

caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg 55

tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 00

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa 65

atcttgtgaa ccatctggtc ccgggggtgg cgggtctggt ggtggaggca 00

gcggtggtgg gggatccgac atccagatga cccagtctcc atcctccctg 75

tccgcctccg tgggcgaccg agtgaccatc acatgcaggg cctcccagga 00

cgtgaacacc gccgtggcat ggtatcaaca gaagcccggc aaagctccca 85

aactgctgat ctactctgca agcttcctgt actccggcgt gccctccagg 00

ttctctggct ccaggagtgg aaccgacttc accctgacca tctcctctct 95

gcagcccgaa gactttgcca cctactactg ccagcagcac tacaccaccc 1000

ctcccacctt cggacaaggg accaaagtcg agatcaaacg gggtggcgga 105

gggtctggag gcggaggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggaggttc 1100

aggaggtggc gggtccggcg gtggagggtc ggaggtgcag ctggtggagt 115

ctggaggagg cctggtgcag cccggcggct ccctgaggct gtcctgcgcc 1200

gcttccggct tcaacatcaa ggacacctac atccactggg tgaggcaggc 125

ccctggcaag ggtctcgaat gggtcgcaag gatctacccc accaacggct 300

acaccaggta cgccgactcc gtgaagggca ggttcaccat ctctgctgac 1350

acctccaaga acaccgccta cctgcagatg aactccctga gggccgagga 140

cacagcagtt tactactgct caagatgggg cggcgacggc ttctacgcca 145

tggactactg gggccaaggc accctggtga ccgtgtcctc agccagcacg 1500

aagggccatc accatcacca tcactaa 1527

<210> SEQ ID NO:4

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga 50

cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag 100

cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg 150

gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc 200

tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct gaagacttgg 250

cagattattt ctgtctgcaa tatagcagct ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat 350

cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt 400

gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 450

gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga 500

cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag 550

cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<---

1. Рекомбинантное биспецифическое Fab-scFv антитело, селективно связывающее интерферон бета-1а человека и способное нейтрализовать его биологическую активность и связывающее рецептор ErbB2 человека, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а легкая цепь указанного антитела содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.

2. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 антитела по п. 1, состоящую из Fab-варианта тяжелой цепи нейтрализующего антитела к интерферону бета-1а человека и одноцепочечного варианта scFv антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 ErbB2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.

3. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь антитела по п. 1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.

4. Антигенсвязывающий фрагмент рекомбинантного биспецифического антитела по п. 1, селективно связывающий интерферон бета-1а человека и рецептор ErbB2 человека, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2.