Средство, снижающее относительное содержание низкодифференцированных и повышающее относительное содержание высокодифференцированных клеток в инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа

Изобретение относится к области медицины и фармакологии. Предложено применение пептида формулы Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в качестве средства, повышающего относительное содержание высокодифференцированных клеток и снижающего относительное содержание низкодифференцированных в инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа человека, причем указанное снижение происходит путем трансформации клеток с повышением их дифференцировки, а не путем их разрушения. При применении Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ отсутствует цитотоксический эффект, не происходит усиления дистрофически дегенеративных изменений, а также усиления процессов апоптоза. 1 табл.

 

Проблема создания веществ, способных оказывать влияние на развитие опухолевых злокачественных новообразований и в тоже время не обладающих существенным токсическим действием на клетки организма, является весьма актуальной. В настоящее время известны описанные ниже вещества, полученные путем химического синтеза, обладающие противоопухолевой активностью.

1. Так, в качестве вещества, обладающего противоопухолевой активностью, был предложен гексапептид формулы OCH-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp (патент РФ №2064935), который можно получить методом твердофазного синтеза. Гексапептид активизирует процессы, противодействующие развитию опухоли, нейтрализует токсический эффект опухолевых клеток на функциональную активность Т-лимфоцитов и стимулирует продукцию ими эндогенных медиаторов (интерлейкина-2). Однако не известно его влияние непосредственно на клетки злокачественной опухоли.

2. Известно применение производных пептидов общей формулы X-Glu-Cys(Acm)-LysOH, где Х=Н или Glp (5-Oxoproline), Acm - ацетамидометильная группа, ингибирующих пролиферацию миелопоэтических клеток (патент РФ №2037499) и показывающих избирательную активность в отношении различных клеток костного мозга (миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов). Однако не известно его влияние на злокачественные клетки и солидные опухоли.

3. Известен фактор дифференцировки HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), выделенный из культуральной среды клеток линии HL-60 (линия клеток промиелоцитарного лейкоза человека), получение которого описано в статье «Новый фактор дифференцировки из культуральной среды клеток линии HL-60, обработанных ретиноевой кислотой. Выделение и определение первичной структуры» авторов Костанян И.А., Астаповой М.В., Старовойтовой Е.В., Драницыной С.М., Липкина В.М. (Биоорган, химия. 1995. Т.21. С. 243-248).

Данный фактор представляет собой гликозилированный белок с молекулярной массой 8,2 кДа, содержащий 54 аминокислотных остатка (а.о.), который получается при гликозилировании и протеолитическом процессинге, в результате чего от N-конца экспрессированного белка отщепляется 43 аминокислотных остатка при расщеплении связи Q43 - А44 (данный фактор еще называют «полноразмерным HLDF» в отличие от описываемого ниже его шестичленного фрагмента).

HLDF способен индуцировать дифференцировку клеток HL-60 в фенотипически зрелые гранулоциты (Костанян И.А., Астапова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М., Липкин В.М. // Биоорган, химия. 1995. Т.21. С. 243-248). Данный фактор дифференцировки обнаруживается в организме человека в норме и при патологии (Соснина А.В., Морозов Д.В., Вараксин Н.А., Вонаршенко А.В., Байдакова Л.К., Аутеншлюс А.И., Липкин В.М. Способность фактора дифференцировки HLDF регулировать цитокинпродуцирующую функцию клеток крови при аденокарциномах желудка // ДАН. 2014. Т. 454. №5. С.603-605).

Описана способность HLDF к снижению относительного содержания низкодифференцированных клеток, а также повышению относительного содержания высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы молочной железы неспецифического типа (патент РФ №2743710).

4. При изучении фактора дифференцировки HLDF был идентифицирован его фрагмент длиной 6 аминокислотных остатков, а именно: Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg (TGENHR), обладающий дифференцирующей активностью и получивший название «HLDF-6». Данный пептид был получен методом твердофазного пептидного синтеза (патент РФ №2213747).

При изучении его свойств было установлено, что пептид HLDF-6 обладает способностью индуцировать дифференциацию в культуре клеток промиелоцитарного лейкоза HL-60 и эритромиелоцитарного лейкоза К-562, а также ингибировать пролиферацию в культуре клеток промиелоцитарного лейкоза HL-60.

Данный пептид обладает способностью протекторного и нормализующего действия в отношении процессов жизнедеятельности клетки млекопитающего. Исследования, проведенные на клетках линии HL-60 и К-562 показали, что пептид формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg является неиммуногенным, нецитотоксичным соединением.

Известна нейропротективная и ноотропная активность пептида HLDF-6 (Bogachouk АР, Storozheva ZI, Solovjeva OA, Sherstnev W, Zolotarev YA, Azev VN, Rodionov IL, Surina EA, Lipkin VM. Comparative study of the neuroprotective and nootropic activities of the carboxylate and amide forms of the HLDF-6 peptide in animal models of Alzheimer's disease //J Psychopharmacol. 2016 Jan;30(l):78-92. doi: 10.1177/0269881115616393). Отмечается возможность потенциального применения HLDF-6 при нарушениях памяти, связанных с нейродегенеративными заболеваниями (Sewell RD, Gruden MA, Pache DM, Storogeva ZI, Kostanyan IA, Proshin AT, Yurasov VV, Sherstnev VV. Does the human leukaemia differentiation factor fragment HLDF6 improve memory via brain DNA and protein synthesis?//J Psychopharmacol. 2005 Nov;19(6):602-8; Богачук А.П., Сторожева З.И., Телегин Г.Б., Чернов А.С., Прошин А.Т., Шерстнев В.В., Золотарев Ю.А., Липкин В.М. Специфическая активность амидной формы пептида HLDF-6: изучение на трансгенной модели болезни Альцгеймера // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2017. Т. 9. №3 (34). С.68-74).

На модели карциномы легких Льюиса установлено, что шестичленный пептид HLDF-6 обладает антиметастатическим и иммуномодулирующим действием (Сысоева Г.М., Фадина В.А., Даниленко Е.Д. и др. Противоопухолевое и иммуномодулирующее действие фрагмента фактора дифференцировки клеточной линии HL-60 на мышах с карциномой легких Льюис//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Том: 147. Номер: 2. Год: 2009. Стр.: 190-193). При этом авторы отмечают, что пептид HLDF-6 не обладал способностью тормозить рост первичного опухолевого узла, но проявлял выраженные антиметастатические свойства. Отмечается наличие у пептида HLDF-6 иммуномодулирующей активности, которой, по мнению авторов, и объясняется антиметастатическое действие препарата.

5. В работе Батеневой А.В., Бабенко А., Даниленко Е.Д. и др. «Исследование противоопухолевых свойств липосомальной формы фрагмента фактора дифференцировки HLDF в культуре клеток» (Экспериментальная и клиническая фармакология. Том: 73. Номер: 2. Год: 2010. Стр.: 18-21) на первичной культуре клеток лимфосаркомы мышей показано, что липосомальная форма пептида HLDF6 обладает способностью ингибировать пролиферацию и усиливать гибель клеток лимфосаркомы штаммов LS и RLS.

Вместе с тем отмечается, что возможность использования пептида формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg в качестве лекарственного препарата ограничивается его быстрой биодеградацией в тканях организма (патент РФ №2682039). Ввиду данного обстоятельства был предложен пептид формулы Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ (Ac-TGENHR-NH2), являющийся ацетил-амидной формой HLDF6 и более стойкий к биодеградации. В результате проведенного исследования было установлено, что Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ обладает высокой устойчивостью к гидролизу в плазме крови.

Ac-TGENHR-NH₂ обладает противоопухолевым действием в отношении клеток миеломы линии SP2/0, заключающемся в торможении пролиферации злокачественных клеток. Торможение роста опухоли было показано in vivo на модельной опухоли миеломы линии SP2/0, которая была привита мышам-самцам линии Balb/c. Аналогичные результаты были получены при изучении противоопухолевой активности ацетил-амидной формы пептида у мышей BDF1c лимфолейкозом Р388. Кроме того, был показан эффект торможения метастазирования на модели солидной опухоли рака шейки матки РШМ5.

Таким образом, из литературы известно свойство пептида HLDF-6 и его ацетил-амидной формы ингибировать пролиферативную активность ряда культур злокачественных клеток, а также оказывать на них цитотоксическое действие.

Кроме ацетил-амидной формы, существует пептид HLDF6 с формулой Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂, обладающий анксиолитическим свойством, а также нейропротекторной и ноотропной активностью (патент РФ №2557003).

Наряду с противоопухолевым действием пептид HLDF6 и его формы обладают антиметастатическим и иммуномодулирующим действием. Вместе с тем, источников, которые свидетельствовали бы о действии пептида HLDF-6 или его ацетил-амидной формы на опухолевой процесс в молочной железе, не обнаружено. Тем более отсутствуют сведения о влиянии данного препарата на инвазивную карциному молочной железы неспецифического типа.

Несмотря на то, что ацетил-амидная форма пептида обладает противоопухолевым действием, обусловленным торможением роста опухоли, отсутствуют сведения о том, что при этом происходит изменение уровня дифференцировки злокачественных клеток.

Из выше изложенного следует, что изученные в настоящий момент эффекты, которые оказывает полноразмерный фактор дифференцировки HLDF и его формы (ацетил-амидная форма пептида Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ и амидная форма пептида Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂), не совсем идентичны. Это приводит к выводу о том, что свойства HLDF, в частности, свойство снижать относительное содержание низкодифференцированных клеток, а также повышать относительное содержание высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы молочной железы неспецифического типа, до настоящего времени не обнаруженные у HLDF-6 или его форм, в том числе и ацетил-амидной формы, нельзя считать a priori им присущими.

Раскрытие изобретения

В качестве средства, снижающего относительное содержание низкодифференцированных и повышающего относительное содержание высокодифференцированных клеток в инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа человека предлагается применение синтетического пептида Ac-TGENHR-NH₂, являющегося ацетил-амидной формой пептида HLDF-6, имеющей формулу Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ (Ac-TGENHR-NH₂) и молекулярную массу 753 Да.

Технические результаты предлагаемого изобретения:

1) снижение относительного содержания низкодифференцированных и повышение относительного содержания высокодифференцированных клеток в инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа человека;

2) снижение относительного содержания низкодифференцированных клеток происходит путем трансформации клеток с повышением их дифференцировки, а не путем их разрушения;

3) отсутствие цитотоксического эффекта в связи с тем, что механизм действия Ac-TGENHR-NH₂ связан с трансформацией клеток, что доказывается отсутствием статистически значимого различия между количеством опухолевых клеток, общим количестве митозов, количеством патологических и физиологических митозов при его применении;

4) Ac-TGENHR-NH₂ не вызывает усиления дистрофически-дегенеративных изменений, а также усиления процессов апоптоза;

5) при сравнении Ac-TGENHR-NH₂ с полноразмерным HLDF (гликопротеином, белковая часть которого имеет 54 аминокислотных основания), важно указать на следующее. Ac-TGENHR-NH₂ является синтетическим пептидом, получение которого не связано с выращиванием культуры клеток промиелоцитарной лейкемической линии клеток человека HL-60, воздействием на нее ретиноевой кислоты, получением HLDF и очисткой полученного фактора дифференцировки. Метод твердофазного синтеза пептида, состоящего из 6 аминокислотных остатков, позволяет исключить влияния неучтенных факторов, связанных с получением нативного HLDF, что позволяет добиться более высокой степени очистки вещества, а, следовательно, более точной его дозировки.

Получение Ac-TGENHR-NH₂

Схема синтеза, разработанная для получения фармацевтической субстанции, включает в себя поэтапное наращивание пептидной цепи, начиная с С-концевого остатка аргинина, закрепленного на смоле. Все аминокислотные остатки, которыми наращивается растущая пептидная цепь, имеют защитные группы на своих боковых цепях для предотвращения протекания побочных реакций. Химический синтез целевого продукта осуществляется твердофазным методом посредством Fmoc/tBu методологии на полимерной подложке Ринка, представляющей собой химически модифицированный полистирол кросс-сшитый 1,4-дивинилбензолом.

I. Первый этап синтеза - получение растворов бензотриазолиловых активированных эфиров.

1. В реактор загружают по отдельности аминокислоты (Arg, His, Glu, Asn, Gly, Thr) с Fmoc (флуоренилметильная) защитными группами (25,8 ммоль), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинфосфония гексафторфосфат (13,4 г, 25,8 ммоль), 1-гидроксибензотриазола моногидрат (3,95 г, 24,8 ммоль).

2. В реактор вводят 30 мл диметилформамида. Перемешивают до растворения.

3. В реактор при перемешивании вводят 2,8 мл N-метилморфолина.

4. Смесь перемешивают 5 минут. После чего сливают из реактора для использования на стадиях основного синтеза.

II. Синтез Fmoc-Arg(Pbf)-NH-PR (инициация цепи).

1. В реактор при перемешивании вводят раствор Fmoc- Arg(Pbf)-OBt в диметилформамиде, полученный на стадии I.

2. Перемешивают 1 час.

3. В реактор добавляют 20 мл диметилформамида.

4. Перемешивают 5 минут.

5. Сливают содержимое реактора и удаляют остатки диметилформамида с помощью насоса.

III. Синтез Arg(Pbf)-NH-PR (снятие защиты Fmoc)

1. В реактор при перемешивании вводят 40 мл 20% раствора 4-метилпиперидина в диметилформамиде.

2. Перемешивают 10 минут.

3. Сливают содержимое реактора и удаляют остатки раствора диэтиламина.

4. Повторяют операции 1-3, только перемешивают 50 минут.

5. Для промывки пептидилполимера в реактор вводят 20 мл диметилформамида. Перемешивают 5 минут.

6. Остатки диметилформамида удаляют.

7. Повторяют операции 5-7.

Далее пептидная цепь наращивается путем присоединения по одной аминокислоте с последующей стадией снятия защитной группировки.

IV. Синтез Fmoc-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (наращивание цепи)

1. В реактор вводят раствор Fmoc-His(Trt)-OBt в диметилформамиде, полученный на стадии I.

2. Перемешивают 1 час.

3. Повторяют операции 5-7, проводимые на стадии III.

V. Синтез His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (Снятие защиты Fmoc) Проводят операции 1-7 стадии III.

VI. Синтез Fmoc-Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (наращивание

цепи)

1. В реактор вводят раствор Fmoc-Asn(Trt)-OBt в диметилформамиде, полученный на стадии I.

2. Повторяют операции 2-3, проводимые на стадии IV.

VII. Синтез Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (Снятие защиты Fmoc). Проводят операции 1-7 стадии III.

VIII. Синтез Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (наращивание цепи)

1. В реактор вводят раствор Fmoc-Glu(OtBu)-OBt в диметилформамиде, полученный на стадии I.

2. Повторяют операции 2-3, проводимые на стадии IV.

IX. Синтез Glu(OtBu)-Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (снятие защиты).

1. Проводят операции 1-7 стадии III

X. Синтез Fmoc-Gly-Glu(aBu)-Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (наращивание цепи)

1. В реактор вводят раствор Fmoc-Gly-OBt в диметилформамиде, полученный на стадии I.

2. Повторяют операции 2-3, проводимые на стадии IV.

XI. Синтез Gly-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (снятие защиты).

1. Проводят операции 1-7 стадии III.

XII. Синтез Fmoc-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (наращивание цепи).

1. В реактор вводят раствор Fmoc-Thr(tBu)-OBt в диметилформамиде, полученный на стадии I.

2. Повторяют операции 2-3, проводимые на стадии IV.

XIII. Синтез Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-His(Trt)-Arg(Pbf)-NH-PR (снятие защиты).

1. Проводят операции 1-7 стадии III.

Синтез Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH2

1. В реактор помещают Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH2 диацетат.

2. В мерной пробирке отмеряют 4 мл безводного диметилсульфоксида и сливают в реактор.

3. Перемешивают до полного растворения пептида.

4. К раствору пептида добавляют ацетилбензотриазол (0,23 г).

5. Перемешивают 2 часа.

6. В реактор добавляют 10 мл изопропанола.

7. Перемешивают 10 минут.

8. Содержимое реактора фильтруют.

9. Маточный раствор сливают в отдельную емкость №1.

10. Отмеряют 7 мл смеси диметилсульфоксид-изопропанол (2 мл и 5 мл)

11. Смесь помещают в реактор и перемешивают 5 минут, после чего фильтруют

12. Маточный раствор помещают в ту же емкость №1.

13. Повторяют операции 10-12

14. 5 мл изопропанола вливают в реактор, перемешивают 5 минут, после чего суспензию из реактора фильтруют

15. Маточный раствор сливают в емкость №1.

16. Повторяют операции 14-15 еще два раза.

17. 5 мл ацетонитрила вливают в реактор. Перемешивают 5 минут.

18. Фильтруют суспензию из реактора.

19. Сливают маточный раствор в емкость №1.

20. В реактор вливают 54 мл этилацетата. Перемешивают 5 минут.

21. Фильтруют суспензию из реактора.

22. Маточный раствор помещают в емкость №1.

23. В реактор вливают 5 мл диэтилового эфира. Перемешивают 5 минут.

24. Фильтруют суспензию из реактора.

25. Маточный раствор помещают в емкость №1.

26. Повторяют операции 23-25.

27. Сушат получившийся продукт в потоке аргона в течение 1 часа. Выход 0,93 г (ок. 80%).

28. Высушенный продукт растворяют в 1М уксусной кислоте (100 мл).

29. Полученный раствор пептида замораживают в стерильных условиях в 50-мл стерильных пластиковых пробирках и подвергают процессу лиофилизациии.

30. Лиофилизация проводится при значении вакуума 0,018 мбар в течение 12 часов.

31. После высушивания пептид собирают в стерильную апирогенную пробирку, которую герметично закупоривают.

32. Пробирки с полученным пептидом хранятся при температуре -20°С.

Обоснование изобретения

Материалом исследования служили образцы опухолей 14 женщин с инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа. От каждой из пациенток три образца опухоли каждый объемом 8 мм³ помещали в 3 флакона, в первом из которых находилась только питательная среда DMEM-F12 в объеме 1 мл (1-я группа), во втором- питательная среда в таком же объеме с HLDF (предоставленным Институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) в концентрации 20 мкг/мл (2-я группа), в третьем - питательная среда в объеме 1 мл с Ас-TGENHR-NH2 в концентрации 40 мкг/мл, предоставленным Институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (3-я группа).

После инкубирования при 37°С в течение 72 ч образцы опухолей извлекали из среды и фиксировали в 10% растворе формалина. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые окрашивали гематоксилином Гаррисона и эозином. Морфометрический анализ осуществлялся на базе микроскопа «Микмед 6», цифровой камеры DCM510 и программного обеспечения ImageJ 1.42g (Национальный институт здоровья, США).

Морфометрический анализ инвазивной карциномы молочной железы неспецифического типа каждого образца (3 образца от каждого пациента) проводили по 8 микрофотографиям (площадь каждой составляла 97200 мкм).

Определение степени дифференцировки клеток проводилось на основании анализа клеточного и ядерного полиморфизма (Шабалова И.П., Джангирова Т.В., Волченко Н.Н., Пугачев К.К. Цитологический атлас: Диагностика заболеваний молочной железы. - М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2005. - 119 с; Рак молочной железы: практическое руководство для врачей / [Ю.Ю. Андреева и др.], под ред. Г.А. Франка, Л.Э. Завалишиной, К.М. Пожарисского. - М.: Практическая медицина, 2014.- 176 с). Кроме того, на микрофотографиях определялось количество опухолевых клеток, общее количество митозов, из них - количество физиологических и патологических митозов.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программного пакета для статистической обработки SPSS v 17.0 for Windows. Для сравнения зависимых групп использовали критерий Вилкоксона. Различия между значениями сравниваемых параметров расценивали как статистически значимые при р<0,05. Полученные в ходе исследования данные представлены как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q₁; Q₃).

Результаты исследования

При изучении образцов опухолей, культивирование которых осуществлялось без добавления в среду нативного (HLDF) или синтетического (Ac-TGENHR-NH₂) факторов дифференцировки, было отмечено, что инвазивная карцинома неспецифичного типа характеризовалась типичным строением с формированием гнезд, кластеров и трабекул. Участков некроза опухоли не наблюдалось, отмечались умеренные дегенеративно-дистрофические изменения клеточных элементов, апоптотические тельца отсутствовали.

При морфометрическом анализе было выявлено, что низкодифференцированные опухолевые клетки, для которых характерны крупные ядра неправильной формы, в том числе с выростами, неровными контурами, с грубым хроматином, одним или несколькими ядрышками, составляли 20,6% (9,5; 28,6) (таблица 1). Умеренно дифференцированные клетки, для которых характерно умеренное увеличение размеров клеток, умеренный клеточный и ядерный полиморфизм, составляли 69,7% (58,1; 83,3). Высокодифференцированные клетки, имеющие мелкие одноморфные ядра с дисперсным распределением хроматина без ядрышек, составили 8,2% (5,4; 12,4) от общего количества опухолевых клеток.

При изучении образцов опухолей, культивирование которых осуществлялось с добавлением в среду HLDF, было отмечено, что инвазивная карцинома неспецифичного типа характеризовалась типичной картиной, присущей этому гистологическому варианту рака молочной железы. Так же, как и при культивировании без добавления HLDF, участков некроза клеток не отмечалось, наблюдались умеренные дистрофически-дегенеративные изменения опухолевых клеток, апоптотические тельца отсутствовали. Вместе с тем обращал на себя внимание меньший клеточный и ядерный полиморфизм клеток опухоли, значительно реже выявлялись клетки, ядра которых имели укрупненные ядрышки.

При морфометрическом анализе было выявлено, что низкодифференцированные опухолевые клетки составили 7,8% (3,2; 9,4), что достоверно отличалось от аналогичного показателя образцов, которые культивировались без добавления в среду HLDF (таблица 1). Умеренно дифференцированные клетки составляли 72,9% (60,8; 77,6), что статистически значимо не отличалось от их относительного содержания при культивировании без добавления среду HLDF. Высокодифференцированные клетки составили 20,0% (15,3; 29,7) от общего количества опухолевых клеток, что было достоверно выше, чем при культивировании без добавления среду фактора дифференцировки HLDF.

При изучении образцов опухолей, культивирование которых осуществлялось с добавлением в среду Ac-TGENHR-NH2, было отмечено, что инвазивная карцинома неспецифичного типа характеризовалась типичным строением с формированием гнезд, кластеров и трабекул. Так же, как и в двух предыдущих группах, участков некроза клеток не отмечалось, выраженность дистрофически-дегенеративных изменений была умеренной, апоптотические тельца отсутствовали.

При морфометрическом анализе было выявлено, что низкодифференцированные опухолевые клетки составили 7,3% (3,5; 9,7), что достоверно отличалось от аналогичного показателя образцов, которые культивировались без добавления в среду Ac-TGENHR-NH₂ (таблица 1). Умеренно дифференцированные клетки составляли 75,9% (63,4; 78,0), что статистически значимо не отличалось от их относительного содержания при культивировании без добавления среду синтетического пептида. Высокодифференцированные клетки составили 20,7% (13,0; 27,8) от общего количества опухолевых клеток, что было достоверно выше, чем при культивировании без добавления среду Ac-TGENHR-NH₂.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что общее количество опухолевых клеток на тестируемой площади во всех трех группах статистически значимо не отличалось, что свидетельствует о том, что добавление в среду как HLDF, так и Ac-TGENHR-NH2 не оказывает цитотоксического действия на опухолевые клетки молочной железы, но влияет на соотношение клеток с различной степенью дифференцировки, приводя к снижению относительного содержания

низкодифференцированных и увеличению относительного содержания высокодифференцированных клеток.

Кроме того, общее количество митозов в поле зрения, количество физиологических и патологических митозов достоверно не различались в образцах, которые культивировались без добавления и с добавлением как HLDF, так и Ac-TGENHR-NH₂, что также свидетельствует в пользу того, что изменения относительного содержания низко- и

высокодифференцированных клеток связаны не с появлением новой популяции клеток, а обусловлены изменением соотношения между клетками с различной степенью дифференцировки.

Примечателен тот факт, что изученные морфометрические показатели опухолей, культивируемых в кондиционной среде с добавлением в нее Ас-TGENHR-NH₂ достоверно не отличаются от аналогичных морфометрических показателей опухолей, культивируемых в кондиционной среде с добавлением в нее HLDF. Это позволяет сделать вывод о тождественности влияния нативного фактора дифференцировки HLDF и синтетического пептида Ас-TGENHR-NH₂ на злокачественную опухоль молочной железы.

Таким образом, синтетический пептид Ac-TGENHR-NH₂ вызывает снижение относительного содержания низкодифференцированных клеток и повышение относительного содержания высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы молочной железы неспецифического типа, аналогичные тем, что наблюдаются при воздействии фактора дифференцировки HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor).

--->

Перечень последовательностей

<110>Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования «Новосибирский государственный

медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации (ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России);

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

"Федеральный исследовательский центр фундаментальной и

трансляционной медицины" (ФИЦ ФТМ);

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

«Институт биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова Российской академии наук» (ИБХ РАН).

<120>Средство, снижающее относительное содержание низкодифференцированных

и повышающее относительное содержание высокодифференцированных клеток

в инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа

<160>1

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>

Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂

<---

Применение пептида формулы Ac-Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH₂ в качестве средства, снижающего относительное содержание низкодифференцированных и повышающего относительное содержание высокодифференцированных клеток в инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа человека.