Деления легоглобина

 

О П И С А Н-И Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советски»

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

За висимое от аэт. свидетельства №

Заявлено 26.II.1970 (№ 1408921/23-4) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 15.Ч.1972. Бюллетень № 16

Дата опубликования описания 8.VI.1972

М. Кл. С 07g 7/00

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 547.963.4(088.8) Авторы изобретения

В. Л. Кретович, С. С. Мелик-Саркисян и В. В. Яровенко

Институт биохимии им. А. H. Баха

Заявитель

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛЕГОГЛОБИНА

Изобретение относится к получению гемоглобина корневых клубеньков высших растений — легоглобина. Этот гемопротеид является, вероятно, функциональным аналогом гемоглобина. Кроме того, этот белок непосредственно связан с эффективностью фиксации азота в клубеньках бобовых растений. В виде препарата сохраняющего свои свойства при хранении этот белок никогда не получали.

Известны способы выделения легоглобина из клубеньков растений который заключаются в том, что клубеньки после разрушения экстрагируют водой или буферными растворами (при кислых значениях рН 5,6) центрифугируют и высаливают сульфатом аммония.

Исследования проводят с растворами полученного осадка легоглобина после удаления сульфата аммония путем диализа.

Однако препараты, полученные известным способом, окисляются природными окислителями в момент выделения, в результате чего не сохраняют своих нативных свойств.

С целью получения устройчивого препарата предлагается применять инертный по отношению к легоглобину адсор бент полимерной природы — капрон. Клубеньки срезают с участком корня, затем разрушают их (получают гомогенат) в присутствии порошка капрона.

Полученную массу помещают в буферный раствор,рН 7,0 для экстракции легоглобина. Затем центрифугируют. Белки, содержащиеся в центрифугате, высаливают сульфатом аммония.

Легоглобин, осажденный сульфатом аммония, очищают фракционированием на колонке, заполненной био-гелем P-IО, уравновешенным

0,01 М Трис-НС1 буфером с рН 7,0.

Прп этом легоглобин очищается от нпзкомолекулярных примесей и негеминовых белков.

10 После фр акционирования белок лиофилизируют и получают сухие препараты легоглобина красного цвета, сохраняющие свойства исходного белка и хорошую растворимость в водных буферных растворах в широком диа-.

15 пазоне рН.

Все операции по выделению и очистке белка проводят при рН 7,0, что очень важно, поскольку величина рН, 7, как берется в известных способах, является оптимальной для дей2О ствия,растительных фенолоксидаз и способствует окислению железа в составе гема легоглобина.

Пример. Способ получения препаратов легоглобина из клубеньков люпина. Клубень25 ки срезают с участком корня во избежание окисления легоглобина на поверхности раны.

Гомогенат получают в кофейной мельнице с пластмассовым резервуаром типа Км-2. Разрушают клубеньки в течение 10 — 15 сек в при30 сутствии порошка капрона, который добав338524

Составитель A. Акимова

Техред Л. Богданова

Редактор Е. Левина

Корректор T. Китаева

Заказ 1692/15 Изд. № 737 Тираж 448 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушскаи»aá., д. 475

Типографии, пр. Сапунова, 2 ляют в количестве 25 — 80о/о от веса клубеньков. Полученную массу быстро перекладывают в раствор 0,02 М Трис-НС1 буфера с рН 7,0 для экстракции легоглобина. Через

20 мин гомогенат отжимают через полотно и экстракт центрифугируют 25 мин при

23000 g.

Белки, содержащиеся в центрифугате, высаживают сульфатом аммония. При этом фракцию, полученную при насыщении сульфатом аммония от 0 до 55 /о, отбрасывают. Фракцию с 55 — 80 /о насыщения растворяют в небольшом количестве воды и наносят на колонку с био-гелем Р-10, уравновешенным 0,01 М

Трис-НС1 буфером до рН 7,0.

При фракционировании на био-геле P-10 отделяется значительная по количеству белка фракция, .не содержашая легоглобин. Легоглобин элюируют с колонки количественно в составе фракции II и проявляют его спектрофотометрически. Последнюю фракцию собирают, быстро замораживают и лиофилизируют.

Выход легоглобина количественный.

Растворы легоглобина обнаруживают полосы поглощения характерные для гемоглобинов в видимой области спектра при 412, 543, 572 мик и слабую полосу при 630 ммк. При переводе легоглобина в пиридингемохром в спектре обнаруживают полосы поглощения при 558 и 526 ммк. Для С0-производных наблюдают полосы поглощения при 542 и

567 ммк.

В препар ате легоглобина найдено 0,33% железа и 3,8о/о гема.

Негаминовое железо не обнаружено.

При пропускании через раствор легоглобина чистого кислорода, а также при стоянии на воздухе легоглобин оксигенируется.

10 Предлагаемый способ получения легоглобина прост и эффективен, так как позволяет получать значительное количество легоглобина, не потерявшего своих основных свойств после лиофилизации. Получение лиофилизированных, хорошо сохраняющихся препаратов легоглобина позволяет проводить исследования независимо от вегетационного сезона.

Предмет изобретения

Способ выделения легоглобина из клубеньков бобовых растений путем разрушения их, экстрагирования буферным раствором, центрифугирования и высаливания сульфатом ам25 мония, отличающийся тем, что, с целью получения устойчивого препарата, разрушение клубеньков проводят в присутствии капрона, г.олученный высаливанием целевой продукт счищают на био-геле P-10, и ведут процесс

30 при рН 7,0.