Способ выделения аминокислот из белковых гидролизатов

 

III) 447033

Социалистических

Ревпублик

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24.02.72 (21) 1752083/23-4 с присоединением заявки ¹

f0cÓÞÐâòâåííbIé комитет (2Я) Приоритет

Совета Министров СССР ел б . Опубликовано 15.01.76. Бюллетень 2 (51) Ъ1 Кq, С 07С 99/12 (53) УДК 547.965.07 (088.8) и открытий

Дата опуоликования описания 09.06.76 (72) Авторы изобретения

С. В. Рогожин, Ю. А. Давидович и С. М, Андреев

Институт элементоорганических соединени" AH СССР (71) Заявитель (51) СПОСОБ ВЪ|ДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ ИЗ БЕЛКОВЫХ

ГИДРОЛ ИЗАТОВ

Изобретение относится к усовершенствованному способу выделения и очистки аминокислот из белковых гидролизатов.

Известен способ выделения аминокислот из различных смесей, содержащих аминокислоты, ионообменной хроматографией. Сорбция и элюирование аминокислот с сорбента длительны, так как для полного выделения всей суммы аминокислот с хорошим выходом и высокой степенью чистоты необходимо применять несколько типов сорбентов и соответствующих растворителей.

С целью упрощения процесса и повышения степени чистоты предлагается выделять аминокислоты из любых белковых гидролизатов в виде их силоксановых соединений.

Способ основан на превращении всей суммы аминокислот, содержащихся в гидролизатах, в смесь соответствующих гексаалкилдисилильных производных обгцей формулы

R Si — HN-CR |1 -С-0— - -R

В . -т? где R — низший алкил — метил,; R и

R" — водород или любой другой к-заместитель аминокислот природного происхождения, а также аминокислот, полученных химическим путем.

Получение производных аминокислот такого

5 типа легко и просто осуществляется при взаимодействии аминокислот с силазанами, доступными промышленными продуктами, в безводных условиях. Из-за высокого экранирующего влияния триалкилсилильных группн1о ровок, связанных с амино- и карбоксильной группами аминокислот, полученные производные обладают, вероятно, наивысшей летучестью из всех производных аминокислот и хорошей растворимостью в большом числе не15 полярных растворителей.

Благодаря высокой чувствительности к гидролизу в сочетании с указанными свойствами дисилильные производные крайне ценны при

20 использовании для выделения и очистки аминокислот.

На индивидуальных аминокислотах найдено, что реакции силилирования и гидролиза полученных производных идут с количествен25 ными выходами, с полным сохранением оптической чистоты взятой для силилирования аминокислоты. Для силилирования можно использовать ряд силазанов, таких как гексаметилдисилазан (СН ) 3 SI — HN -- SI (CH ), 30 триметилсилилдиэтиламин (СН;) q — Si

447033

N — (С,Н ) z, бис- (триметилсилил) ацетамид

СН3 С 0 Ь1 (ьНЗ

il

N- ((H7 /3 и т. д.

Количественное замещение атомов водорода в обеих функциональных группах аминокислот происходит при использовании триметилсилилдиэтиламина и бис- (триметилсилил)ацетамида, в случае гексаметилдисилазана реакция, в основном, заканчивается после силилирования одной карбоксильной группы.

Исходные силазаны получают с высоким выходом при взаимодействии триалкилхлорсилана с диэтиламином или ацетамидом.

В случае триметилсилилдиэтиламина силилирование аминокислот идет с выделением диэтиламина, что обеспечивает простой контроль за ходом реакции. Очистка полученных дисилильных производных аминокислот от примесей достаточно просто осуществляется фракционной дистилляцией или экстракцией неполярными растворителями полученной после силилирования реакционной смеси.

Превращение выделенных дисилильных производных в смесь аминокислот легко осуществляется гидролизом водой или спиртом при добавлении их к раствору производных в органических растворителях. Образующиеся в результате гидролиза аминокислоты выпадают и легко отделяются от растворителя, а второй продукт гидролиза — дисилоксан — остается в растворе. Дисилоксан представляет собой целевой продукт в синтезе кремнийорганических соединений и может быть достаточно просто превращен обратно в исходный силаз ан.

Возможность регенерации исходных силазанов позволяет создать замкнутый цикл использования вспомогательных веществ, что увеличивает экономичность предлагаемого метода выделения и очистки аминокислот из белковых гидролизатов.

Предлагаемым способом извлекают все аминокислоты из любых белковых гидролизатов и ферментолизатов практически с количественным выходом. Используя точную фрак ционную дистилляцию полученных производных, получают конечный продукт с высокой степенью чистоты.

Способ выделения и очистки аминокислот заключается в следующем, Сухой гидролизат или ферментолизат белоксодержащих материалов обрабатывают силазаном, например триметилдиэтиламином, при нагревании до 80—

120 С в течение 1 — 2 час. Температура реакционной смеси устанавливается несколько выше температуры кипения выделяющегося диэтиламина, чтобы при кипении диэтиламина происходило достаточное перемешивание ре5

45 аукционной массы. По мере завершения реакции температура смеси постепенно повышается в указанных пределах и реакция заканчивается с прекращением выделения диэтиламина. При этом часть силазана расходуется на силилирование функциональных групп примесей, содержащих подвижные атомы водорода.

Однако различная летучесть и растворимость образующихся производных аминокислот и сопутствующих примесей позволяет выделит аминокислотную фракцию, как показано в приведенных ниже примерах.

Пример 1. Суспензию 3 r 1 -валина в

9,65 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при 120 С (температура бани) в течение 1 час до прекращения отгонки диэтиламина. После стояния в течение ночи реакционную массу фракционировали в инертной атмосфере. Собирали фракцию с т. кип. 91 — 93 Ci10 мм рт. ст. Выход 5,41 г (81 / ). Полученное:производное крайне легко гидролизуется в парах влагой воздуха. При гидролизе к 1,15 r дисилильного производного добавляли 0,08 мл воды в 1,5 мл эфира.

После встряхивания выпавший 1 -валин огфильтровывали и промывали два раза по 5 мл эфира. Выход 0,49 г (95 / ). Угол вращения исходного 1 -валина (m)g равен +6,42 (С=1 в воде), угол вращения выделенного после гидролиза 1-валина (а) „6 = +6,86 (С=0,5 в воде), что указывает на полное отсутствие р ацемизации.

Пример 2. Суспензию 3,33 г 1-аспарагиновой кислоты в 14,2 r триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере в течение 1 час. При 135 — 145 С (температура бани) отгоняли 7,3 мл диэтиламина. Из реакционной смеси фракционной перегонкой в инертной атмосфере выделили 6,24 r силилпроизводного аспарагиновой кислоты с т. кип. 80—

90 С/1 мм рт. ст. В результате гидролиза с

97 / -ным выходом получена аспарагиновая кислота. Угол вращения исходной аспарагиновой кислоты (а) " равен +25,25 (С == 1 в воде), для кислоты, полученной после гидролиза, (а) р4 = 26,52 (С = 1 в воде).

Пример 3. Суспензию 1,32 r L-триптофана в 2,4 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере. При достижении температуры бани (120 С) наблюдалось быстрое растворение триптофана, закончившееся в течение 5 — 10 мин, отогнано 1,6 мл летучих. Разгонку реакционной смеси проводили при остаточном давлении 10-з мм рт. ст, Отбирали 1,72 г фракции с т. кип. 135

140 С. После гидролиза выделили триптофан с выходом 95 / с углом вращения (а)" равным +10,93 С = 0,4 в 1 н. НС1). Угол вращения исходного триптофана (а) „ = +10,93 (С = 0,4 в 1 н. НС1).

Пример 4. 3 г ферментолизата дрожжей нагревали в инертной атмосфере с 11,45 г три447033

Формула изобретения

11 В

Составитель П. Сидякин

Текрсд Т. Курилко корректор E. Хмелева

Редактор E. Хорина

Заказ 1026, 9 Изд. _#_o !030 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

5 метилсилилдиэтиламина 2 час при 100—

105 С при перемешивании, при этом отгонялся весь диэтиламин. После окончания реакции избыток триметилсилилдиэтиламина отгоняли при 50 С/20 мм рт. ст. Смесь разбавляли

40 мл сухого эфира и центрифугировали при

3000 об/мин. Осадок промывали в 40 мл серного эфира. К объединенному раствору производных аминокислот в эфире добавляли 8 мл воды при перемешивании. Выпавший осадок аминокислот промывали эфиром и бензолом.

Промытый осадок суспендировали в бензоле и лиофилизовали. Выход 2,34 г (76 /о).

Пример 5. Суспензию 2,04 r сухого ферментолизата в 7,67 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при

100 — 105 С 2 час при перемешивании. После отгонки избытка триметилсилилдиэтиламина (50 С/20 мм рт. ст.) реакционную смесь перегоняли в вакууме 10- мм рт. ст. Получили

4,73 г светлого прозрачного продукта, который смешивали с 50 мл эфира и гидролизовали добавлением 6 мл воды. Выпавший белый осадок смеси аминокислот обрабатывали аналогично примеру 4. Выход 1,07 г.

Способ выделения аминокислот из белковых гидролизатов, отлич а ющий ся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения степени чистоты целевого продукта, указанный

10 гидролизат подвергают взаимодействию с силазаном общей формулы где R — низший алкил, и полученные при этом гексаалкилдисилиль20 ные производные очищают путем фракционной дистилляции или экстракции неполярными растворителями и гидролизуют добавлением воды или спирта в резкционнуlo;ìåñü.