Способ иммобилизации протеолитических ферментов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

r»1 53047 9

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт, свид-ву (22) Заявлено 13.03.74 (21) 2010121/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 15.04.76. Бюллетень № 14 (51) М. Кл.- С 07С 7/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) Дата опубликования описания 09.06.76 (72) Авторы изобретения

Л. Ф. Матяш, С, В. Беляев, В. М. Степанов, T. Д. Хохлова, Ю. С. Никитин и А, В. Киселев (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к области производства ферментов и может быть использовано в пищевой, медицинской и микробиологической промышленности.

В настоящее время используются способы иммобилизации протеолитических ферментов на носителях органического и неорганического происхождения, таких, как производные целлюлозы, полиакриламида, декстрапов и других, а также бентонит, BîëëàñòîHèò, си1икагель, окиси алюминия и никеля, гидрокисапатит и пористые стекла, при этом неорганические носители более устойчивы к действию микроорганизмов, щелочей, кислот, температуры, не набухают и не изменяют своего объема в зависимости от рН среды и ионной силы растворов.

Известен способ иммобилизации протеолитических ферментов путем смешивания при кислом значении рН фермента, активатора и кремнеземсодержащего носителя, предварительно обработанного производным ами оалкилсилана, с последующим отделением и промывкой иммобилизованного фермента.

С целью улучшения качества ферментов по предлагаемому способу в качестве кремнеземсодержащего носителя используют силохром, а смешивание ведут при рН 4,5 — 5,5 и порционном добавлении активатора.

Способ осуществляют следующим образом.

Протеолитический фермент, например пепсин, вводят в контакт с водорастворимым активатором карбоксильных групп фермента— кгрбодиимидом и предварительно обработанным производным ампноалкилсилана кремнеземсодержащнм носителем — снлохромом.

Смешивание вед> T B 3l icTH;I. II I>OIIBIIIIoÉ де при рН 4,5 — 5,5 и порц!.о»ном добавлении активатора. После око»чаня i реакции вод10 ный раствор удаляют декантацпей, а иммоб»лизованный фермент промывают последовательно растворами cîëÿlloé кислоты, хлорн стого натрия и ацетатного буфера при рН

5,0 для снятия с носителя адсорбированного

15 за счет полного обмена фермента.

Пример, 50 мг пепсина, 22 мг водорастворимото и-толуолсульфоната - 1 - циклогексил - 3 - (2 - морфоминоэтил)-карбодиимида и

0,5 г .предварительно обраоотанного произ20 водным аминоалкилсилана силохрома смешивают в дистиллированной воде в течение одного часа при 20 С, поддерживая рН смеси

4,5 — 5,5.

Затем к смеси вторично добавляют 22 мг

25 карбодиимида и продолжают перемешивание в течение двух часов прн 20 С и рН 4,5 — 5,5.

Далее водный раствор удаляют декантацией, а иммобилизованный пепсин промывают последовательно растворами 0,01 М HCI

30 1,0 М NaCI и 0,1 М ацетатного буфера прп

510479

Составитель А. Бражникова

Редактор Г. Мозжечкова Текред Т. Зимина Корректор Е. Хмелева

Заказ 1211/15 Изд. Мз 1267 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 рН 5,0 для снятия с носителя адсорбированного за счет полного обмена фермента.

Количество ковалентно присоединенного к носителю фермента определяют путем гидролиза иммобилизованного фермента в присутствии 5,7 М НС1 при 105 C в течение 24 ч в вакумме, при этом установлено, что к 1 г силохрома,ковалентно присоединяется 40—

50 мг фермента. Активность иммобилизованного пепсина определяют по высокомолекулярному субстрату гемоглобина.

Установлено, что активность препарата, полученного по предложенному способу, при хранении его BO влажном состоянии при рН

5,0 не меняется в течение нескольких месяцев, а иммобилизованный фермент практически полностью сохраняет активность исходного нативного пепсина.

Формула изобретения

5 Способ иммобилизации протеолитических ферментов путем смешивания при кислом значении рН фермента, активатора и кремнеземсодержащего носителя, предварительно обработанного производным аминоалкилсилана, 10 с последующим отделением и промывкой иммобилизованного фермента, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью улучшения качества ферментов, в качестве кремнеземсодержащего носителя используют силохром, а смешивание

15 ведут при рН 4,5 — 5,5 и порционном добавлении активатора.