Способ получения фруктозы из глюкозы

 

(i)) 582284

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт, свид-ву (22) Заявлено 25.07.74 (21) 2047880/13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.11.77. Бюллетень № 44 (45) Дата опубликования описания 06,01.78 (51) М. Кл. С 13К 11/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений н открытий (53) УДК 664.1(088.8) (72) Автор изобретения

Иностранец

Ральф Аллан Мессинг (США) Иностранная фирма

«Корнинг Гласс Воркс» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРУКТОЗЫ ИЗ ГЛЮКОЗЪ|

Изобретение относится к способам ферментативного гидролиза глюкозы.

Известен способ получения фруктозы из глюкозы (1J согласно которому раствор глюкозы, содержащий от 5 до 90 вес. % глюкозы, выдерживают с ферментом — глюкозоизомеразой, полученной из микроорганизмов Streptomyces и стабилизированной на носителе, при рН от 6 до 9 и температуре от 20 до 80 С.

Согласно известному способу носитель представляет собой клетки, причем закрепляется глюкозоизомераза на них путем нагрева смеси клеток и фермента при низкой температуре.

Однако такой способ недостаточно эффективен — степень перехода глюкозы во фруктозу составляет 45%.

С целью повышения эффективности процес- са и ускорения его в предлагаемом способе предусмотрено в качестве ферментного препарата использовать глюкозоизомеразу, адсорбированную частицами окиси алюминия, имео ющими поры диаметром от 100 до 1000А, В предпочтительном варианте этот носитель имеет размеры частиц в пределах от 25 до

80 меш (по стандарту сит США).

Полученный по предлагаемому способу ферментный препарат помещают в проточную колонку, через которую непрерывно пропускают в условиях изомеризации содержащий глюкозу раствор. Оптимальная температура выдерживания раствора глюкозы с ферментным пре5 паратом от 50 до 70 С при рН от 7,2 до 8,2 (предпочтительно при 7,4 — 7,8). Этот ферментный препарат имеет щелочность в тех пределах рН, при которых связанная с носителем глюкозоизомераза обладает оптимальной ак10 тивностью.

Нижний предел (100 А) диаметра пор частиц окиси алюминия, используемой для ад15 сорбции глюкоизомеразы, подобран, исходя из наибольшего размера молекул этого фермено та, составляющего также 100А. Благодаря этому молекулы могут входить в поры, что обеспечивает использование большой поверхностной площади для загрузки фермента. о

Если средний размер пор больше 1000А, поверхностная площадь для адсорбирования уменьшается и, следовательно, уменьшается поверхностная площадь для загрузки фермента. При этом возможно отделение фермента и выход из пор носителя. Оптимальный размер о пор носителя от 140 до 220 А.

582284

Выбор буферной системы зависит от степени кислотности в растворе субстрата, создаваемой самим раствором при наличии активных ионов, которые могут быть введены в субстрат и во внутрь пор, например ионов кобальта или магния. В этом случае кислотного действия этих ионов можно избежать путем добавления сульфитных солей.

Для приготовления ферментного препарата согласно описываемому способу желательно, чтобы носитель, используемый для адсорбирования глюкозоизомеразы, обладал следующими свойствами:

Размер пор, А: средний 175 минимальный 140 максимальный 220

Поверхностная площадь, мг/г 100

Объем пор, см /г 0,6

Пористость, о/о 62,5

Размер частиц, меш 25 — 60

Пример 1. Около 5 г состава, содержащего — 444 г глюкозоизомеразы, полученной из микроорганизма Streptomyces, добавляют к

28,7 мл 0,1М раствора ацетата магния в стакане емкостью 50 мл. Содержимое стакана перемешивают 25 мин при комнатной температуре, а затем фильтруют через фильтровальную бумагу. Остаток на бумаге несколько раз промывают и промывные воды собирают непосредственно в фильтре для отделения фермента. Общий объем фильтрата составляет 50 мл. Затем 500 мг частиц пористого алюминия вводят в сосуд с круглым дном емкостью 50 мл, добавляют 10 мл указанного раствора глюкозоизомеразы. Сосуд помещают во вращающийся испаритель, в котором создают вакуум, и вращают в бане при 30 — 45 С с интервалом в 25 мин. Затем в сосуд добавляют

10 мл раствора глюкоизомеразы и, спустя

35 мин, при тех же условиях подвергают содержимое сосуда испарению.

При тех же условиях добавляют раствор глюкозоизомеразы с последующим испарением в течение 4 ч. Процедуру повторяют два и более раз с отделением 10 мл раствора глюкозоизомеразы. Затем в сосуд вносят еще 7 мл раствора глюкозоизомеразы и продолжают испарение 1 ч и 10 мин при 45 С. После этого сосуд извлекают из испарителя и охлаждают его содержимое в течение двух дней.

Общее количество раствора глюкозоизомеразы, добавленное к пористому алюминию, составляет 47 мл. К полученной композиции добавляют 50 мл 0,1 М буферного раствора малеинового натрия (при рН 6,8 — 6,9), содержащего 0,005М раствор хлористого кобальта и 0,001М раствор сульфата магния. В течение часа при комнатной температуре берут пробы.

Экстракт объемом 50 мл анализируют. После этого композицию промывают 20 мл воды и

10 мл 0,5М раствора хлористого натрия, затем окончательную промывку проводят в воронке из пористого стекла 50 мл воды.

З0

Композицию переносят в коническую колбу объемом 50 мл и хранят в буферной смеси при комнатной температуре с периодическими анализами общей пробы через 106-дневные интервалы.

Получают следующие результаты:

Пробы ферментного 39,8 международных экстракта (50 мл) единиц (МЕ) глюкозоизомеразы на 1 мл

Средний объем пробы 130 МЕ глюкозоизокомпозиции меразы на 500 мг пробы

Средний объем за- 260 МЕ глюкозоизогрузки меразы на 1 г

Пример 2. Носитель, аналогичный носителю, применяемому в примере 1, предварительно обрабатывают. Для этого 11 r частиц окиси алюминия помещают в стеклянный цилиндр с притертой пробкой, куда добавляют 100 мл

0,05М раствора ацетата магния и 0,01М раствор ацетата кобальта при рН 7,6. Закрывают пробку, перемешивают содержимое путем переворачивания цилиндра, после чего его помещают в водяную баню с температурой 60 С.

Спустя 15 мин композицию декантируют, добавляют в цилиндр 100 мл свежего ацетата магния — кобальта, перемешивают переворачиванием и оставляют в покое на 2 ч и 30 мин при комнатной температуре.

Сырой раствор глюкозоизомеразы, содержащий 590 ME глюкоизомеразы на 1 мл в 0,6М насыщенном растворе сульфата аммония, очищают для реакции с алюминием. С этой целью к 40 мл раствора глюкозоизомеразы добавляют 1,4 г сульфата аммония для осаждения фермента. Шлам перемешивают 20 мин. Затем путем центрифугирования жидкость удаляют, а к осадку добавляют 12 мл раствора ацетата магния — кобальта, и смесь перемешивают.

После этого к раствору фермента добавляют

3 мл 0,5М раствора бикарбоната натрия и перемешивают для растворения фермента. Полученный раствор помещают на 15 мин в BO дяную баню с температурой 60 С. После бани раствор центрифугируют 15 мин при скорости

16000 об/мин и температуре 2 С. Светлый раствор фермента отделяют, а осадок удаляют.

Полученный раствор фермента (28 мл) имеет рН 7,5. Если во время очистки активность не изменяется, то раствор содержит 23600 МЕ глюкозоизомеразы.

Затем приготовляют ферментный препарат.

Для этого раствор ацетата магния — кобальта после переворачивания цилиндра декантируют от частиц пористого алюминия, К последнему в цилиндре добавляют 28 мл раствора фермента, закрывают цилиндр пробкой, перемешивают содержимое путем переворачивания и помещают в водяную баню с температурой

60 С. В течение 2 ч и 30 мин цилиндр переворачивают каждые 15 мин. Затем его извлекают из бани и оставляют при комнатной температуре еще на 2 ч, переворачивая каждые

30 мин, после этого оставляют в покое на ночь.

582284

Формула изобретения

Составитель М. Андреева

Техред Н. Рыбкина Корректор Л Котова

Редактор Н. Хубларова

Подписное

Заказ 124/16 Изд. Ма 110 Тираж 484

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Получают 28,5 мл (рН 7,1) раствора фермента, который декантируют, а затем анализируют. Композицию промывают 60 мл дистиллированной воды, затем 40 мл 0,5М раствора хлористого натрия и 40 мл раствора ацетата магния †кобаль.

Из цилиндра отбирают 3 пробы общим весом 1 г для анализа. Оставшиеся 10 г помещают в колонну с температурой нагрева 60 С.

В колонну подают раствор, содержащий 50о/о глюкозы и 0,5М раствор сульфата магния с буферным раствором сульфата натрия для доведения рН до 7,7 — 8,0.

В течение первых 26 ч в композицию, пропускаемую через колонну, вводят 0,001 М раствор хлористого кобальта, затем кобальт вводить прекращают, и при дальнейшей работе колонны роль активатора играют только ионы магния.

Исходная объемная скорость потока в колонне 190 мл/ч. Объем получаемой фруктозы составляет 80 — 85о/о от теоретического и поддерживается путем снижения объемной скорости потока через различные интервалы времени. Колонна работает 31 день. К концу работы в результате уменьшения подачи она подсыхает и высыхает полностью через 15 ч, Период изомерного полуперехода перед использованием показывает, что он имеет загрузку в 381 МЕ глюкозоизомеразы. Это свидетельствует о восстановлении 17,8% активности от всего количества глюкозоизомера5 зы (в МЕ), адсорбированной в носителе.

Анализ прореагировавшего ферментного раствора (28,5 мл) показывает, что он содержит 161 МЕ глюкозоизомеразы, а восстановление активности в этом прореагировавшем

10 растворе составляет 19,4 /о.

Величина рН колонны поддерживается в пределах 7,4 — 7,8 путем соответствующего регулирования подачи материала. Общая загрузка колонны 3810 МЕ.

Способ получения фруктозы из глюкозы путем выдержки раствора глюкозы с фермент20 ным препаратом, отл ич а ющи и ся тем, что, с целью повышения эффективности процесса и ускорения его, в качестве ферментного препарата используют глюкозоизомеразу, адсорбированную частицами окиси алюминия, име25 ющими поры диаметром 100 — 1000А.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США № 3694314, кл. 195-31, 1972.