Способ получения пептидов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Сощиалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту— (22) ЗаявлЕно 2106,76 (21) 2373901/23-04 (23) ПРиоРитЕт — (32) 23,06 ° 75

3/52

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий (31) 8224/75 (33) Швейцари я 43/ Опубликовано 050779, Бюллетень № 25 (45) Дата опубликования описания 0807,79

64.4.

8. 8) Иностранец

Ларс Гундро Свендсен (Норвегия) (72) Автор изобретения

Pl) Заявитель

Иностранная фирма Пентафарм АГ (Швейцари я) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

Изобретение относится к способам получения пептидов, содержащих хромофорную группу. °

Известен способ связывания хромофорной группы с С-концевой аминокислотной группой (1) путем конденсации защищенной по 0 -аминогруппе аминокислоты с изоцианатом.

В пептидной хймии широко используют при конденсации пептидных фрагментов метод активированных эфиров (2) и различные способы снятия концевых N-защитных групп (3).

Целью изобретения является получение новых пептидов с хромофорной группой, которые могут найти применение в биохимии.

Предлагается способ получения пептидов ббщей формулы: (Ф вЂ” глицин-Е пролин-Е аргинин-NH — R ) ° HY (1) где R — водород, п-толуольная-,2:I

-нафталин-,метан- или бензол- сульфонильная группа или ацильная группа формулы

R3 где R — алифатический углеводородный остаток с 1-7 атомами углерода, фенилалкиловый

2 остаток с 1-3 атомами углерода в алкильном остатке, циклогексиловый или алкилокси остаток с 1-5 атомами

5 углерода в алкильном остатке;

R — 4 метокси-2-нафтиламид, п2

-нитроанилид, 2-нафтиламид;

Y — анион минеральной или орга10 . нической кислоты.

Способ заключается. в том, что соединение формулы (R" -Е-аргинин-ОН) - HY (2) гда R — блокирующая х -аминогруппу защитная группа;

Y — имеет значения, указанные ранее; подвергают взаимодействию с иэоцианатом формулы

20 О = С = N — R (3) где значения R указаны в триамиде гексаметилфосфорной кислоты в присутствии одного эквивалента третичного органического основания, при комнатной температуре в безводной среде; полученное при этом соединение формулы (R -Z-аргинин-NH R ) - HY (4) обрабатывают 2н. HBr в ледяной уксусной или во трифторуксусной или в беэ673}65

3 водной муравьиной кислоте, или газообразным хлористым водородом в диоксане,, в безводной среде, при комнатнойй температуре; полученный лри э том продукт Формулы (Н-Е-аргинин-NH-R 2HY (5) обрабатывают в диметилформамиде эквивалентным количеством третичного органического основания при комнатной температуре и полученное при этом соединение формулы (H-Z-аргинин-NH-R ) НУ (6) подвергают взаимодействию с соединением формулы

R --глицин-Z-пролин-R

6 5 % ) (7) где R — активная сложи оэ фирн ая группа; .- R — одна из групп, обозначенных

6 через R значение которой указано ранее, или алкоксик ар бонил ьн а я группа, ал кил ьный остаток которой имеет, по крайней мере, один атом водорода у -атома углерода и содержит до 10 атомов углерода, полученное при этом соединение формулы (R -глицин-Z пролин-Е-аргинин-

Б

-NH-.R ) ° HY (8) обрабатывают если R -R 2н.HBr в ледяной уксусной или трифторуксусной, или в безводной муравьиной кислоте, или газообразным хлористым водородом в диоксане в безводной среде при ком. натной температуре и получают (Н-глицин-2 пролин-Е аргинин-NH-R j 2 HY (9) последнее соединение, растворенное в диметиЛформамиде, пры обработке эквивалентным количеством третичного органического основания при комнатной температуре переводят в соединение Формулы (Н-глицин-Е пролин-Z аргинин-ЫН-R ) - HY, (10) которое подвергают взаимодействию с соединением формулы т (11)

У где значения R указаны ранее R имеет те же значения„что и R или означает хлор или бром, причем если

R xJIop HJIP. бромр то третичиое органическое основание применяют в ко.личестве, эквивалентном количеству соедннения (11), процесс ведут в ди метилформамиде при температуре от

-10 до 20 С.

Элюаты анализируют путем тонкослойной хроматографии. При этом применяют покрытые гелем двуокиси кремния Ф 254 (фирмы Мерк) стеклянные пластинки. для проявления тонкослой ных хроматограмм используют стгедующие системы растворителей:

A хлороформ-метанол (9: 1)

Б н-пропанол-этиловый эфир уксус ной кислоты-вода (7: 1: 2)

В н-бутанол-уксусная кислота-вода, (3г1:1) .

Для обнаружения хроматограмм ис- . пользуют вначале ультрафиолетовый

ríåò, потом реакцию со смесью хлор-толуидин .

В данном описании применяют следующие сокращения:

5 арг — 2-аргинин гли глицин про — Z -лролин кбо . — карбобензокси

ГМПТЛ вЂ” триамид N,N,N,N,N,N (О -гексаметилфосфорной кислоты

НА — нафтиламид

МеΠ— метокси

ОпНП вЂ” п-нитрофенокси пНЛ вЂ” п-нитроанилид

2-HA — 2-н афтиламид

Пример 1. N -кбо-гли-npock -арг-пНА HCf а) кбо-арг-пНА HCf..

B круглодониой трехгорлой колбе емкостью 250 мл растворяют 16,0 r (47,0 ммоль) высушенного иад пятиокисью фосфора кбо-apr-ОН - НС в

90 мл абсолютного ГМПТА без доступа влаги при 20 С. К полученному раствору прибавляют при комнатной температуре сначала раствор 4,74 г (47Ä0 ммоль) трнэтиламина в 10 мл

ГМПТР. и "àòåì 16,4 г (100 ммоль) п-нитрофенилизоцианата (1ООЪ-ный избыток) по порциям. После выдержки в течение. 24 z при 20 С ГМПТА болыаей частью отгоняют в вакууме. Продукт экстрагируют неоднократно ЗОВ -иой уксусцой кислотой. Остаток выбрасывают, Объединенные экстракты уксусной кислоты для дальнейшей очистки наносят на уравновешенную ЗОВ-иой уксусной кислотой колонку Сефадекс Г 15 и продукт элюируют

40 30%-ной уксусной кислотой, фракцию элюата,содержащую продукт,.который мо. жет быть расщеплен обработкой трипсином с освобождением п-нитроаниляна, подвергают с ":. ке вымораживанием. Получают 12,6 г аморфного порллка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,Ь". С 51;67; H 5,42;

N 18, 08, Cf. 7,63

50 С Н Ы,ОСг

Найдено, Ъ г С 51 29; Н 5 8:

17,92; С 7,50 . б) И + -кбо-гли-про-apr-ïHA HCf

4,65 г (10 ммоль) соединения кбо

-арг-pHA ° НСВ обрабатывают 40 мл

2 й. НВг i ледяной уксусной кислоте без доступа влаги при переме аиваиии в

1 ч при 20 С. Пептидное производное при этом растворяется с выделением

60 СО . Реакционный раствор при сильном перемеаивании прибавляют по каплям к 250 мл абсолютного эфира, в осадок выпадает (2 HBr) Н-apz ЛНА.Осадок отфильтровывают, просеивают абсолют65 ным эфиром (4х100 мл) для удаления

60 образующегося в качестве побочного продукта бензилбромида, а также избытка НВг и уксусной кислоты. Продукт сушат в вакууме над пластинками NaOH, выход количественный. Сухой (2НВг) . Н-арг-рНА растворяют в 25 мл диметилформамида. К охлажденному до

-10 С раствору прибавляют 1,40 мл (l0 ммоль) триэтиламина. Образующийся осадок триэтиламина HBr отфильтровывают; промывают небольшим КолИ1 чеством холодного диметилформамида.

Фильтрат охлаждают до -10 С и прибавляют к нему 4,70 r (11 ммоль) кбо-гли-про-ОпНП. Через несколько часов температура реакционного раствора поднимается до 20 С. Раствор вновь 15 охлаждают до -10 С и буферируют

0,35 мл (2,5 ммоль) триэтиламина.

Еще через 16 ч прибавляют 0,35 мл триэтиламина при -10 C. Спустя 24 ч реакционный раствор концентрируют в gp вакууме досуха. Остаток растворяют в

50 мл метанола. После прибавления

0,8 мп (10 ммоль) концентрированной соляной кислоты раствор упаривают досуха в вакууме при 20 С. Эту операцию повторяют три раза с целью перевода гидробромида трипептида в гидрохлорид. Сырой гидрохлорид трипептида растворяют в 50 мл метанола и предварительно очищают при помощи гель-фильтрации через уравновешенную колонку с Сефадекс IIX-20 . Для дальнейшей очистки концентрируют в вакууме ту фракцию метанола, которая содержит продукт поддающийся расщеп- 35 лению обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина. Остаток растворяют в ЗОЪ-ной уксусной кислоте. Раствор чистят гель-фильтрацией на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . 40

Фракцию элюата, содержащую продукт, поддающийся расщеплению трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 0,80 мп (10 ммоль) концентрированн ой сол ян ой кислоты под- 45 вергают сушке вымораживанием. Получают 3,64 г (58,8 Ъ от теоретического) аморфного легкого порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В., 5p

Вычислено,Ъ: С 52 38; Н 5 70;

N 18,10; Ct 5,73

С Ну И О С(.

Найдено, Ъ . "С 52, 09; Н 5, 83;

N 18, 33; C(5,75.

Анализ аминокислот дает ожидаете аминокислоты в правильном соотношении; арг 0,96; гли 1,00; про 0,96.

Пример 2. Н-Гли-про-арг-nHA ° 2HC(, 61,91 г (0,1 моль) полученного

СФ по примеру i "îåäèíåíèÿ N -кбс-, 65

-гли-про-apr-пНА ° kICC без доступа влаги обрабатывают 300 мл Зн.соляной

65 6 кислоты в Ледяной уксусной кислоте с перемешиванием в течение 2 ч нрн

35 С. Пептидное производное при этом растворяется с выделением СОд . Реакционный раствор при сильном перемешивании прибавляют. по каплям к 2 л абсолютногo a H a, B осадок выпадает

Н-гли-про-арг-пНА 2НС(в виде хлопьев. Осадок отделяют и промывают аб;солютным эфиром (4x500 мл) с целью удаления образовавшегося в качестве продукта расщепления бензилхлорида и избытка соляной и уксусной кислот. Осадок сушат в вакууме над пластинами NaOH, получают деблокировзнный продукт с количественным выходом.

Для дальнейшей очистки растворяют высушенный продукт в 900 мп ЗОЪ-ной уксусной кислоты. Раствор чистят путем гель-фильтрации на уравновешенной

ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г 15 . При этом разделяют элюат уксусной кислоты на две фракции, обе могут быть расщеплены обработкой три .сином c освобождением п-нитроанилина. Главная фракция содержит желаемый продукт, а побочная фракция — исходный материал. После прибавления 8 мл (0,1 моль) концентрированной соляной кислоты к главной фракции ее сушат вымораживанием. Получают 43 5 г (83,4 Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хромагограмме в системе растворителей В.

Вычислено,%: С 43, 77; Н,- 80 р

N 21, 49;, С1 13,60

С у Н 3о Ng Os С 1 .

Найдено, Ъ: С 43,38; Н 5,88;

21, 72; CF 13, 41

Анализ амин оки слот дает ожи да емы е аминокислоты в правильном соотношении: арг 0,95-гли 1,00-про 0,94.

Пример 3. N + -2-феннлацетил-гли-про-арг-пНА ° НСС.

2, 09 г (4 ммоль) получен 1о:о согласно примеру 2 н-гли-про-арг-пНА2нй растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10" С прибавляют 555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого

1,13 r (4,4 ммоль) и-нитрофенилового эфира фенилуксусной кислоты (т.пл. 61,5-62 C) . Реакционный продукт перерабатывают дальше, как описано в примере 1.

Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилипа, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентри рованной сол яной кислоты подвергают сушке выморажи вани ем.

Выход: 1,99 r (82,5Ъ от теоретического) аморфного порсшк:,кото -,ый

7 6 однороден в тонкослойной хроматограмме в сиСтеме растворителей В.

Вычислено, Ъ: С 53, 77; Н 5, 85;

N 18,58; Ct 5,88

Срл Ны Иэ 3e Ct

Найдено,Ъ: С 54,06; Н 5,68;

N 18,83; СЕ 5,79, Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотношении: арг 0,99 - гли 1,00 — про 0,87.

d.

Пример 4. N -3-фенилпро пионил-тли-про-арг-пНА НС1.

2,09 r (4 ммоль) полученного по примеру 2 н-тли-про-арг-пНА ° 2HCL растворяют в 25 мл диметилформамида.

После охлаждения до -10 С прибавляют

555.мкл (4 ммоль) триэтиламина и не-, посредственно после этого 1,19 г (4,4 ммоль) п-нитрофенилового эфира

3- фенил-пропионовой кислоты(т.пл .97—

98,5 С) . Продукт реакции обрабатывают дальше согласно примеру 1.

Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс. Г-15 . Гу фракцию элюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена трипсином с выделением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход:

2,06 г (83,5Ъ от теоретического) аморфного йорошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,%: С 54,50; Н 6,04;

N 18,16; Ct 5s75

С„Н„И, О,С8.

Найдено,Ъ: С 54,25; Н 5,98;

N 18,29; Ct 5,63 °

Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотношении: арг 1,02 - гли 1,0 - про 0,98 .

Пример 5. N -циклогексилкарбонил-тли-про-арг-rrHA НСС .

2,09 г (4 ммоль) полученного по примеру 2 н-гли-про-арг-пНА 2HCt растворяют в 25 мл диметилформамида.

После охлаждения до -10 С прибавляют

555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 1,10 r (4,4 ммоль) п-нитрофенилового эфира циклогексилкарбоновой кислоты (т .пл. 49-50 С) . Продукт реакции перерабатывают дальше согласно примеру 1., Очистка: гель- фильтрация на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . ФракциЮ элюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вым6раживанием.

73165 8 дукт перерабатывают дальше согласно примеру 1.

Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которая может быть. расщеплена путем обработки

25 трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 1 99 r (81 4Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хромато грамме в си с теме растворит ел ей В .

Вычислено,Ъ: С 53,06; Н 7,09;

Б 18,34; Ct. 5,80

Сjy Hq Ng О СЕ, Найдеио, Ъ: Q 52, 84; Н 7, 15;

N 18,58; С 5,73.

Анализ аминокислот дает ожидаете аминокислоты в правильном соотношении: арг 0,95 -гли 1,00 -про 0,99.

Пример 7. N -тозил-гли-про-арг-пНА. HCt.

2,09 г (4 ммоль) полученного по примеру 2 н-гли-про-арг-пНА 2НСЕ растворяют в 25 мл диметилформамида.

После охлаждения до -10 C прибавляют

555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и не"посредственно после этого 840 мг (4, 4 моль) хлорангидрида п-толуолсульфоновой кислоты (тозилхлорида) (т.пл. 67-79 С) . Продукт реакции пе55 рерабатывают дальше согласно приме ру

Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . Фракции

60 элюата, содержащую продукт, который может быть расщеплен обработкой трипсином с освобождением п-ннтроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты

Выход: 1,87 г (78,6Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,Ъ С 52р47 Н б 6

N 1B,83; Cf 5,97

C zc Hag И Од СЯ, Найдено, Ъ: С 52, 70; Н б, 72;

N 19,03; С 5,83.

Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотнсшении: арг 0,96 — тли 1,00 — про 0,96.

Пример б. N -каприлоил-гли-про-арг-пНА HCt .

2,09 г (4 ммоль) полученного по

15 примеру 2 н-тли-про-арг-пНА" 2HCt растворяют в 25 мл диметилформамида.

После охлаждения до -10 С прибавляют

555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 1,17 r (4,4 ммоль) и-нитрофенилового эфира каприловой кислоты. Реакционный про673 tб".

)0 подвергают сушке вымораживанием. Выход: 2, 17 г (84,9% от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,%: С 48,86; Н 5,52;

N 17,53; $ 5,02; С1 5,55

С Н И О ЯСГ, Найдено,Ъ: С 48,50; Н 5,61;

N 17,73; Я 5,19; С1 5,49 °

Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотниаени арг 0,99 — гли 1,00 — про 0,93.

Пример 8. N -бензолсульфонил-гли-про-арг-пНА . НС .

2,09 r (4 ммоль) полученного по примеру 2 н-гли-про-арг-пНА ° 2НСс растворяют в 25 мп диметилформамида.

После охлаждения до — 10 С прибавляют

555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и не посредственно после этого 780 мг (4,42 ммоль) хлорангидрида 6eH3oJIсульфоновой кислоты (т.пл. 16-17 С) .

Продукт реакции перерабатывают дальше согласно примеру 1.

Очистка..гель-фильтрация на уравновешенной 30 -ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс. Г-15 ° Фрак- цию элюата, содержащую продукт, который может быть расщеплен обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления

320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 1,95 г (78% от теоретического) аморфного порсмка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,Ъ: С 48,03; Н 5, 32;

N 17,93; S 5,13; О 5,67

Cg5 Иу3 И О SCP °

Найдено, Ъ: С 47,69; Н 5,40;

И 18,11у Я 5,0бу Cf 5,61.

Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотношении: арг 1,01 — гли 1,00 — про 0,96 .

Пример 9. N -метансульфоJ. нил-гли-про- ар r- AHA ° HC f.

2,09 г (4 ммоль) полученного по примеру 2 н-гли-про-арг-пНА ° 2HCP растворяют в 25 мп диметилформамида.

После охлаждения до -10 С прибавляют

555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 345 мкл (4,44 ммоль) хлорангидрида метансульфоновой кислоты. Продукт реакции перерабатывают дальше согласно примеру 1.

Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата, содержащую продукт, к оторьФ может быть расщеплен обработкой трипсичом с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты, нс g«<. ргак т сушке нымоп, жн ванн(:м„Выход:,70 г (75,59 эт теоретнчес1:.о

rо) амсэрфцого пяэошк» к 7Qp-1Й сэдно роден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,Ъ: С 42,6бу Н 5,55;

5 N 19,90, S 5,70; CP 6,30

С„Н„Н, О, СЕ.

Найдено,%: С 42,88; Н 5,63;

И,20,08; Я 5,62," С1 6,21 °

Анализ аминокислот, дает ожидаете

H, аминокислоты в правильном соотноше10 нии:

apr 0,99 — гли 1,00 - про 0(96.

Пример 10, N -2-нафталин15 сульфонил-гли-про-арг-пНА . HCP, 2, 09 r (4 ммоль) полученного по примеру 2 н-гли-про-apr-пНА ° 2HCE ,Растворяют в 25 мп диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют

20 555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 1,0 г (4,41 ммоль) хлорангидрида нафталин-2-сульфоновой кислоты (т .пл . 74—

76 С) . Продукт реакции обрабатывают дальше с гласно примеру 1.

Очистка: гель-фильтрация через уравновеаенную 30%-ной уксусной кислотой колонку с Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно Расщепить обработкой трипсином с освобождением П-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 1, 81 r (66, 8% от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,%: С 51,59; Н 5,23;

N 16,60; S 4,75; С 5,25

40 Cgq Hy Ng O SCF.

Найдено, Ъ: С 51, 88; Н 5, 19;

N 16,75; S 4,62; С1 5,12., Анализ- аминокислот дает ожидаете

:, аминокислоты в правильном соотнсые45 нии:

apr 1,02 — гли 1,00-про 0,98.

Пример 11. N -изобутилоксикарбонил-гли-про-apr-ïÍÀ ° НС1 .

2,09 r (4 ммоль) полученного по примеру 2 н-гли-про-арг-пНа 2HC - растворяют в 25 мп диметилформамида.

После охлаждения до -10 С прибавляют

555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 650 мкл (5,0 ммоля) изобутилового эфира хлормуравьин ой кислоты. Р еакци онный продукт перерабатывают дальше согласно примеру 1. .Очистка: гель-фильтрация через уравновешенную 30%-ной уксусной кислотой колонку с Сефадекс Г-15, Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена обра боткой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления

320 мкл (4 ммоль) концентрированной

11 673 соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 1, 71 г (73, 1% от т еоретичес ко го) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,%: С 49,27; Н 6,37; 5

N 19,,15; С(6,06

Сг» Н3» Ь» О»С(.

Найдено,%: С 49,06; Н 6,42;

N ).9, 33; С(5,98, Анализ аминокислот дает ожидаете аминокислоты в правильном соотношении: арг 1,01 - гли 1,00 — про 0,94.

Пример 12. N -кбо-гли-про-арг-2-HA НС( а) N -кбо-арг (NO< ) -2:ЙА, 3,53 r (10 ммоль) хорошо высушенНого кбо-apr(NOg ) -ОН беэ доступа влаги растворяют в 150 мл смеси тетрагидрофурана и диметилформамида (3; 1) . 20

После охлаждения до -10 С к раствору прибавляют 1,39 мл (10 ммоль) триэтиламина и потом по каплям в течение 15 мин раствор 1,35 г (10 ммоль) изобутилового эфира хлормуравьиной 25 кислоты в 20 мп тетрагидрофурана, температуру поддерживают при -10—

-5 С. К полученному раствору прибав ляют по каплям раствор 1 72 г (12 ммоль) Я -нафтиламина в 15 мл QP тетрагидрофурана, причем соблюдают указанную температуру. Реакционную смесь оставляют стоять в течение

24 ч при комнатной температуре. Пос- . ле отгонки растворителя .в вакууме 35 остаток обрабатывают: три раза подряд дистиллированной водой, три раза

5%-ным раствором едкого натра и " опять три раза дистиллированной водой. После сушки в вакууме растворяют сырой продукт в метаноле и раствор хроматографируют через уравновешенную метанолом колонку с Сефадекс ЛХ-20 . Из одной, фракции элюата получают 3,75 r кристаллического соединения N -кбо-арг (МО ) -2-HA (78, 4% от теоретического), т. пл. 173-174, 5 С, которое. однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей

Аи Б.

Вычислено,%:. С 60,24; Н 5,48;

N 16,72.

С,(» Н»» Б» О

Найдено,%! С 60,82; Н 5,63;

1 1 17, 48 б) Н-арг-2-HA-НС(.

957 мг (2 ммоль) N -кбо-apr(НОр)-2НА помещают в реакционный сосуд аппарата Сакакйбара, куда когйдгенсируют 15 мл высушенного газообразного фтористого водорода. Смесь перемешивают 1 ч при О С, при этом отщепляют

IINTposавйтную "группу"аргрйуйа и "кар= "" бобензоксигруппу. Сконденсированный газообразный фтористый водород отгоняют в вакууме из реакционной смеси !.

165 12 и остаток растворяют в диметилформамиде,Дпя перевода производного аминокислоты в солянокислую соль прибавляют 0,5 мл (примерно б ммоль) концентрированной соляной кислоты и раствор упаривают досуха ° После двухкратного повторения этой процедуры остаток растворяют в 50 w. 40%-ной уксу сн ой кислоты. Раствор вносят в уравновешенную 30%-ной уксусной кислотой колонку с Сефадекс Г-15 и продукт элюируют 30%-ной уксусной кислотой. Ту фракцию элюата, которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты, подвергают сушке вымораживанием. Выход: 473 мг (63,5% от теоретического) аморфного порсыка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,%: С 51,62; Н 6,23;

N 18, 81; С6 19,05

С,» Нг» N»OC(g

Найдено.,%: С 51,82; Н 6,18;

N 17,08; С(18,75

N -кбо-гли-про-арг-2-HA ° НС t.

372 мг (1ммоль) Н-арг-2НА НС(согласно примеру 1 подвергают взаимодействию с 470 мг (1,1 ммоль) кбо-гли-про-ОпНП, получая соединение (12) . Очистка: гель-Фильтрация на уравновешенной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата, которая может быть расщеплена обработкой трипсйном с освобождением,6 -нафтиламина, после прибавления 80 мкл (1 Ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанйем. Выход: 425 мг (68, 1% от теоретичес1сого) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматогРамме в системе растворителей В.

Вычислено, %: С 59, 65 (11 6, 1 4;

N .15,71; Сс 5,68

С„н, Н,О,С<

Найдено,%: С 60, 11; Н б, 25;

N 16,07; Сс 5,59

Анализ амйнокислот дает ожидаете аминокислоты "в правильном соотношении: арг 0,98 - гли 1,00 — про 0,97.

Пример 13. N* -тознл-гли-про-арг-2-HA ° НС(.

625 мг (1 ммоль) соединения (пример 12) деблокируют согласно примеру

2 и растворяют в 8 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют 140 мкл (1 ммоль). триэтиламина и непосредственно после этого

210 мг (1,1 ммоль) хлорангидрида и--толуолсульфоновой кислоты (т.пл.б7-69 С) . Реакционный продукт перераба"тывают дальше по примеру 1.

Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . ) у Фрак673165

14 (1, 1 ммоль) кбо-гли-про-ОпНП, получая соединение N -кбо-гли-про-арге -4-Ме0-2-HA ° НСЕ . Очистка: гельфильтрация на уравновешенной 30%-ной т уксусной кислотой колонке с "Сефа-. декс Г-15 . Ту фракцию злюата уксус5 ной кислоты, которая может быть расщеплена трипсииом с освобождением 4-метокси-2-нафтиламина, после прибавления 80 мкл (1ммоль) концентрированной соляной кислоты сушат вымораживаIO кием. Выход: 493 мг (75,4% от теоретического) аморфного порошка, котоРый однороден в тоикослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Вычислено,Ъ! С 58,75; Н 6,16; !

5 Ы 14,90; СЕ 5,72

C>z Нцо Nq 0e СЕ

Найдено,%: С 59 01; Н 6,10;

N 15, 19," СЕ 5, 35.

Анализ аминокислот дает ожидаете аминокислоты в правильном соотнсшении! арг. 1,02 - гли 1,00 - про 0,95.

Пример 15. N" -тозил-гли-про-apr-4-МеО-2-HA ПСЕ .

655 мг (1 ммоль) полученного по примеру 14 соединения ХХЧ деблокируют согласно примеру 2 и растворяют ,в 8 мл диметилформамида..После охлаждения до -10 С прибавляют 140 мкл (1 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 210 мг (1,! ммаль) хлорангидрида п-толуолсульфоново;" кислоты. Продукт реакции перерабатывают дальше согласно примеру 1, Очистка: гель-фильтрация через Уравновешенную ЗОВ-ной уксусной кислсioé колонку с Сефадекс Г-15 . Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую .можно расщепить трипсином с о.-вобождением 4-метокси-2-нафтиламнH.з, flo»ле прибавления 80 мкл (1 ммоль) концентрированной соляной кислоты, сушат вымораживанием. Выход: 465 мг (69,0% от теоретического) аморфного порсшка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе paстворителей В.

Формула изобретения цию злюата уксусной кислоты, которую можно расщепить отработкой трипсином с освобождением р -нафтнламина, посл прибавления 80 мкл (1 ммоль) концент рированной соляной кислоты подвергаю сушке вымораживанием. Выход: 500 мг (77,6% от теоретического) аморфного порсхака, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе раст ворителей В.

Вычислено,%: С 55,93; Н 5,95;

N 15,22; S 4,98; Cf 5,50

C„,Н ы,а,все

Найдено,Ъ: С 56,73; Н 5,86;

N 15,48; S 5,07; Ct 5,39.

Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотисмении: арг 0,95 — гли 1,00 — про 0,96.

Пример 14. N -кбо-гли-про-apr-4-МеО-2-НА HCF а) N -кбо-арг (NO> ) -4-МеО-2-HA

3,53 r (10 ммоль) кбо-apr(NO@ ) -ОН соггасно примеру 12, а, подвергают взаимодействию с 2,17 г (12,5 ммоль)

4-метокси-2-нафтиламина и перерабатывают, как там указано. Очистка: гель-фильтрация на уравнозешенной метанолом колонке с Сефадекс ЛХ 20

Из одной фракции элюата попучают

3,35 г (65,9В от теоретического) отчасти кристаллического соединения

N -кбо-арг (N0< ) -4-Ие0-2-HA., которое однородно в тонкослойной хроматограм ме в системах растворителей А и Б.

Вычислено,Ъ: С 59,05; Н 5,55;

К 16,23;

Сы Hz® N< О

Найдено, Ъ: С 59, 18; Н 5,43;

N 16,49 б) Н-арг-4-МеО-2-HA - 2HCf .

1,02 г (2 ммоль) соединения N

-кбо-apr- (NO< ) -4 -Ne0-2-НА согласно примеру 12,б подвергают взаимодействию, получая соединение Н-арг-4-ИеО-2-HA . 2НСЕ, Очистка: гель-Фильтрация иа уравновешенной ЗОВ-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г-15 . Ty фракцию элюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением 4-метокси- .

-2-нафтиламина, после прибавлени я

320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 570 мг (71,0% от теоретического) аморфного порсшка, котоРый однороден в тонкослойной хро- 55 матограмме в системе растворителей В.

Вычислено,й: С 50,88; Н 6,03)

N 17,45;.Се 17,67

Ci H;«, N,,0,СЕд

Найдено, З: С 51,08Ä 5,98;

N 17, 75; СЕ 17,55 ° в) N" -кбо-гли-про-apr-4-ИеО-2-НА НСЕ .

402 мг (1 ммоль) соединения Н -арг-4,-Ме0-2-HA - 2НСЕ согласно примеру

1,б, подвергают. взаимодействию с 470мг 65

Вычислено,Ъ: С 55,22; Н 5,98;

0 14,54; В 4,76; се 5, 26

Су Н„„1, О, Ct

Найдено,Ъ: С 55,75; Н 6,01;

N 14,89; $ 4,59; Cf 5,16

Анализ аминокислот дает ожидаемые аьжнокислоты в правильном соотнсянении арг 0,98 — гли 1,00 - про 0,96.

Способ получения пептидов общей формулы (Н -глицин-Е-пролин-7,-аргинин-NH 81 j- HY () где R — водород, п-толуольная-,2-нафталин-, метан- или бензм1-сул ь .;ж415

Составитель В. Волкова

Редактор Т. Орловская Техред О. Андрейко Корректор С. Шекмар

Тираж 512 Подпи сн ое

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,, Раушская наб., д, 4/5

Заказ 3733/55 Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Фили ал ППП

6 нильная группа или ацильная группа

Формулы

3- .— R R— C (O)где R — алифатический углеводородный остаток с 1-7 атомами

t углерода, фенилалкиловый остаток с 1-3 атомами углерода в алкильном остатке, циклогексиловый илн алкил-: окси остаток с 1-5 атомами углерода в алкильном остат-. е ке,  — 4-метокси-2-нафтиламид, п-нитроанилид, 2-нафтиламид, Y — анион минеральной или органической кислот, о т л ичающийся тем,что соединение формулы (R -Z аргннин-ОН) ° HY, (2) где R — блокирующая (-аминогруппу защитная группа, X . имеет значения, указанные ранее подвергают взаимодействию с изоцианатом формулы

O=C=N-R (3) где значения R4 указаны в триамиде гексаметилфосфорной кислоты в присутствии одного эквивалента третичйого органического основания, при комнатной температуре, в безводной средеу полученное при этом соединение формулы (R -2 аргинин-NH-В ) ° HY (4) . обрабатывают 2н. HBr в ледяной уксусной или во трифторуксусной, или в безводной муравьиной кислоте, или газообразным хлористым Водородом в дибксане, в безводной среде при комнатной температуре; полученный при этом продукт Формулы (Н-Z аргинин-NH-R ) ° 2HY {5) обрабатывают в диметилформамиде эквивалентный коютичеством третичного ор ганического основания при комнатной температуре и полученное при этом соединение формулы (Н -2 аргинин-NH-R ) НУ (6) подвергают взаимодействию с соединением формулы

R -глицин-Е-пролин-R, 73165 где R — активная сложноэфирная

Х группа;

R — имеет значения R, указанные ранее, или алкоксикарбонильная группа, алкильный остаток которой имеет, по

5 крайней мере, один атом во"дорода у -атома углерода и содержит до 10 атомов углерода, полученное при этом

С соединение формулы

f0 (R -глицин Е-пролин-Z-аргинин

-NH-R ) - HY (8) обрабатывают, если R =В"; 2н.HBt в ледяной уксусной или трифторуксусной, или в безводной муравьиной кислоте, или газообразным хлористым водородом в диоксане в безводной среде при комнатной температуре, и полученное соединение е (Н -глицин-Z пролин-Z аргинин-NH-R ) ° 2HY, (9) растворенное в диметилформамиде, при обработке эквивалентным количеством третичнбго органического основания при комнатной температуре переводят а соединение Формулы (Н -глицин-Z пролин-Z аргинин-NH-R ) ° HY, (10) которое подвергают взаимодействию с соединением Формулы

30 R -R ф

Ч (11) где значения R указаны ранее; R имеет те же значения, что и R, или означает хлор или бром, причем, если

R — хлор или бром, то третичное op f ганическое основание прменяют в количестве, эквивалентном количеству соединения (11), процесс ведут в диметилформамиде при температуре от -10 до 20 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. М. Bodanrki, М.A. Ondetti. Peptide Synthesis, Jntersc1ence

45 .РцЬ11shers, 1966, с. 110.

2. Там же, с. 163.

3. Э. Шредер, К. Любке. Пептиды, ч. 1,М.р Мир, 1967, с. 112.