Способ высушивания иммобилизованных холинэстераз

 

Союз Советских

Социалистических Республик

< 7О3533

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 09.01.78 (21) 2566438/23 — 04 (5 3 ) M. Кд.

С 07 G 7/02/!

А 61 К 37/48 с присоединением заявки М

Гасудаустееииь 1 квинтет

СССР аа делаМ изебретеннй н етхрытнй (23) Приоритет

Опубликовано 15.12.79. Бюллетень М 46 (53) УДК 577.815, .07 (088.8) Дата опубликования описания 15.12.79 (72) Авторы изобретения

М. Э. Хага, А. Э. Ляэне и Э. В. Пеэнема

Институт кибернетики АН Эстонской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫСУШИВАНИЯ ИММОБИЛИЗОВЩНЫХ

ХОЛИНЭСТЕРАЗ

Изобретение относится к области получения" биохимических препаратов, в частности к спо- собу получения иммобилиэованных ферментов.

Иммобилизованные холинэстеразы, получае- мые различными способами, обычно хранят во влажном состоянии в холодильнике.

При длительном хранении в растворе все биологически активные вещества, в том числе и иммобилизованные ферменты, теряют свою. активность. Причиной этого являения может быть либо инактивация фермента, либо растворение поверхности носителя и вымывание первоначально иммобилизованного фермента.

Наиболее близким по технической сущности является общеизвестный способ высушивания

15 биологически активных материалов-лиофильная сушка. Лиофильная сушка заключается в испарении воды из замороженного материала в вакууме. Недостатком лиофильной сушки иммобилизованных на неорганических (пористое стекло, силикагель, окись алюминия) или органических (целлюлоза и ее производные) носителях холинэстераз (ацетил-, бутирил- и пропионилхолинэстераза) является заметное или

Полное исчезновение ферментативной активности препаратов Я .

Целью изобретения является сохранение, ферментативной активности иммобилизованных холинэстераз при их высушивании, Поставленная цель достигается дополнительной обработкой препаратов перед высушиванием. Способ высушивания иммобилиэованных холинэстераз согласно изобретению заключается в пропитывании препаратов "— 20@-ными, преимущественно 10 — 15%-ными, водными растворами альдосахаров и высушивании препаратов в вакууме. Высушиванию обычно подвергают холинэстеразы, иммобилизованные на неоргани-" ческих и целлюлоэных носителях.

Пример. Высушиванию подвергают холинэстеразы, иммобилизованные на пористом стекле, активированном фосгеном, после обработки раствором у-аминопропилтриэтоксисилана; на силикагеле, окиси алюминия в целлюлозе, активированных хлористым циануром, и на карбоксиметилцеллюлоэе, карбоксильные груп пы которой переведены в аэидные.

3 703533

Названные препараты в количестве 0,2 — 0,3 г ..вакуума (какобычно делают при лиофильной

1сушке) не является обязательным. т

IмФермент

Раствор пропитывания

Пористое стекло

Ацетилхолинэстераза

28,0

0,15 М NaCI 0

28,0

5%-ная глюкоза 9,9

° 10%-ная глюкоза 20,0

10%-ная сахароза 27,3

28,0

28,0

10%-ная арабиноза28,0

28,0

Ацетилхолинзстераза

Окись алюминия

0,15 М ЙаС1 0

18%-ная глюкоза 11,8

13,0

13,0

20%-ная сахароза 10,1

15%-ная арабиноза 7,0

130

Силикагель

Силохром 2

Бутирилхолинэстераза

15,4

0,15 М NaCI

5%-ная глюкоза 11,2

18%-ная глюкоза 15,0

20%- ная сахароза 15,7

15,4

15,4

15,4 целлюлоза

Ацетилхолинэстераэа

I5%-ная арабиноэг 12,3

15,0

0,15 М NaCI 3 3

15,0

Бутирилхолинэстераза

0,16 M NaCI 2,5

15%-ная арабиноза 7,3

8,0

8,0

15%-ная сахароза 12,0

12,0

СФ

СМ. целлюлоза

А цетилхолинэстераза

12,0

7,3

Вода

1.2,0

0 15 М NaCI 7,5

10%-лая сахароза 9,9

12,0

15%-ная арабиноза 11,4

12,0 переносят в пробирки с растворами сахаров.

Через 30 мин избыток раствора отделяют от препаратов на стеклянном фильтре и обрабо ганные таким образом препараты высушиваю в вакууме в лиофилизаторе 0E — 950 (для вь сушивания можно испольэовать любое вакуу ное сушильное устройство). Предварительное замораживание образцов перед наложением

Активная группа

1 на поверхности

Носитель носителя, через которую связывают фермент

-NC0

Результаты высушивания оценивают по активности препаратов после вымывания сахаров

0,15 М раствором NaCI. Активность определяют по скорости гидролиза ацетил- или бутирилхолина при рН 8,5. Полученные результаты приведены в таблице.

703533

Составитель Г. Коннова

Редактор Л. Емельянова Техред .MI1åòêo

Корректор О. Ковинская

Заказ 7755/26

Тираж 513 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по, делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

При применении изобретения удается высушивать иммобилизованные на неорганических материалах холинэстераэы с сохранением ферментативной активности. Активность высушенных иммобилиэованных на целлюлозе холинэстераз в случае применения изобретения сохраняются на 80 — 100%, в то время как без применения изобретения — только на 20 — 30%:

Увеличивается стабильность при хранении.

Например, при хранении препаратов при 60 С иммобилизованные холинэстеразы в мокром виде теряют свою активность полностью в течение нескольких минут, в то время как высушенные сохраняют активность в пределах 30—

80% после семи суточного хранения в этих же условиях.

Формула изобретения

1. Способ высушивания иммобилиэованных холинэстераэ в вакууме, о т л и ч а ю6 шийся тем, что, с целью сохранения ферментативной активности, иммобилизованиые холинэстеразы перед высушиванием пропитывают 2 — 20 -ными водными растворами альдоса, харон.

2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и йс.я тем, что высушиванию подвергают холинэстеразы, иммобилизованные на неорганических и целлюлозных носителях.

З.Способпоп. I, отличающийс я тем, что применяют 10 — 15%-ные водные растворы альдосахаров.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1,Х Euerk, F. Е. Stolzenback, Lyophilization in Methods in Enzymology" v. 22, s. 33 — 39, 1971 (прототип),