Способ очистки -амилазы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву— (22) Заявлено 070477 (21) 2471011/23-04 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритетр, т (=, 1 (51)М. Кл.2

C 07 G 7/02//

А 61 К 37/48

Государственный комитет

СССР по деяаи изобретений н открытий (53) УДК577.15, .07. (088.8) Опубликовано 05,11.79. Бюллетень №41

Дата опубликования описания 051179 (72) Авторы йзобретения

О,B.Âaðíàâñêàÿ, A.A.Ñåëåçíåâà, Г.В.Самсонов, И.N.Tåðåøèí н И.М.Рабинович

Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ОЧИСТКИ с(.— АМИЛАЗЫ

Изобретение относится к области физхимии, а именно к способу очистки фермента се.-амилaзы (КФ 3.2.1.1).

Высокоочищенные ферментные препараты могут найти применение в пищевой и фармацевтической промышленности и s лабораторной практике.

В литературе описан способ очистки о(.-амилазы из нативного раствора

Аврегд1ХХцв terricoIa при использовании макросетчатого карбоксильного катионита КМТ (lj. Ho этому способу нативный раствор Aspergiftus terrico-.

Ia, содержащий амилазную и протеазную активности сорбируют на катионите

КМТ в условиях полного насыщения сорбента амилазной активностью. Далее производят десорбцию ферментов с катионита. Однако по этому способу получают ферменты с небольшим выходом продукта от нативного раствора: амилазы 15-20%, протеазы 25-30%, Активные фракции ферментов содержат не более 70 Мл амилазы и 90 мл про- 25

АЕ ПЕ теазы.

С целью получения высококонцентрированных элюатов, увеличения выхода фермента и сокращения длительности процесса предлагается сорбцию .р —

-амилазы на карбоксильном макросетчатом катионите, представляющем сопоI I лимер метакриловой кислоты и диметакриламида (КМДМ), проводить в условиях неполного (на 40-60%) насыщения сорбента сорбатом.

Длительность процесса сорбции сокращается при этом в 1,5-2,0 раза.

Оптимальным является проведение процесса сорбции амилазы ионитом КМДМ до концентрации фермента на выходе из колонки, составляющей 40-60% от концентрации амилазы в исходном растворе. Выход фермента в процессе элюации при этом составляет 90100%, а концентрирование амилазы увеличивается В 2,5-3,0 раза по сравнению с полным насыщением катионита ферментом (см .таблицу) .

Процесс очистки с(;амилазы из нативного раствора AspergiIIus terri -

coIa проводят следующим образом.

1. Производят дипегментацию нативного раствора на анионите ФАФ (К наб=

1,9-2,4), не сорбирующего фермент и задерживающего окрашенные примеси.

Характеристикой процесса является экстинкция при 350 нм (длина волны, характеризующая пигменты Asp. ter=.

ricoIa) обесцвеченный раствор не должен иметь Езд„ больше 0,1.

696024

2. Производят сорбцию амилазы и протеазы иэ осветленного нативного раствора макросетчатым карбоксильным ,катионитом КМДИ при равновесном значении рН 4,0.

3. Производят десорбцию ферментов со смолы методом ступенчатой э люции. Т ступень. Десорбция амилазы

0,1 М ацетатным буферным раствором рН 5,0. Контроль за ходом процесса осуществляют измерением оптической плотности элюатов при длине волны

280 нм и определением амилолити- ческой активности. If ступень. Десорбция протеазы 0,1 M фосфатным буферным раствором рН 7 О. Контроль — из)5 мерение поглощения при 280 нм, определение протеолитической активности.

4. Высокоактивные элюаты амилазы и и протеазы подвергают лиофильной сушке.

Описываемый способ дает воэможность получйть своббдный от примесей других белков (при диск-электрофорезе и полиакриламидном геле при рН 7,5 и рН

8,9 получена одна полоса) амилолитический ферментный препарат . Кроме того, описываемый способ сокращает длительность стадии сорбции, элюция амилазы осуществляется в более мягких условиях, что важно при рабб ге с пабильными физиологически активными 30 веществами.

Пример 1. Нативный раствор с аийлолитической активностью 36 — и

АЕ ПЕ протеолитической активностью 10 в количестве 5000 мл пропускают через колонку с анионитом ФАФ в Clформе с коэффициентом набухания

2,0. Объем смолы 200 мл. Депигментация нативного раствора прОисходит без потери амилолитической и протеоли- 40 тической активностей.

Обесцвеченный нативный раствор подкисляют до рН 4,0. Выход. на этой стадии составляет 75Ъ по амилолитической и 70Ъ по протеолитической 45 активностям от исходного нативного раствора. Весь подкисленный раствор (V = 5000 мл) с активностями 27 Ае и 7, О, пропускают через колонку

ПЕ с 5 r КМДИ в смешанной натрий-водородной форме (смола уравновешена

О, 5N ацетатным буферным раствором рН 4,0) . В этих условиях имеет место

50%-ное насыщение смолы амилазой (активность на выходе из колонки„ в конце сорбции составляет 13,5 „ ).

Процент сорбированных ферментов от всего пропущенного через катионит количества равен для амилазы 90, для протеазы 85, а выход ферментов на стадии сорбции от исходного нативного раствора составляет 67,5Ъ и 60% соответственно. После сорбции смолу в колонке промывают 20 мл

0,1 М ацетатным буферным раствором рН 4, О. Первую десорбцию осуществ- 65 ляют 0,1 М ацетатным буферным раствором рН 5 О. Сначала выходит наиболее активная фракция амилазы—

105 мл с активностью 900 „„, рН

4,7, не содержащая протеазы. Эта фракция содержит 77% от сорбированной амилазы (или 70% от пропу- щенного количества).. Затем следующие

300 мл злюата имеют активность от 25 до 10 . Десорбция амилазы осуществляется с полным 100Ъ-ным выходом от сорбированной амилазы. Однако для получения препаратов ферментов используют только высокоактивные элюаты. В данном случае фракция с активностью

900 †„ составляет 84Ъ от всей десорбиАЕ рованной амилаэы и 52% от количества фермента в исходном нативном растворе (36 — A х 5000 мл) .

Вторую десорбцию — элюцию протеолитического фермента осуществляют 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,0.

Протеаза выходит, начиная с рН 6,2.

Высокоактивная фракция - 250 мл с активностью 98 вЂ, содержит 82% от сорбированной протеазы (или 70Ъ от пропущенного количества) . Всего десорбируют 91Ъ сорбированного фермента.

Выход на стадии десорбции протеаэы в активной фракции составляет 49Ъ от количества в исходном нативном растворе (10 „, х 5000 мл) .

ПЕ

При лиофилйзации элюатов ферментов потери не превышают 5,0%.

Таким образом, общий выход от нативного раствора составляет:. амилазы порядка 50%, протеазы — 46%.

Пример 2. Нативный раствор в количестве 5000 мл с активностью

35 †„ и 10 пропускают через колонAE ПЕ ку с 200 мл анионита ФАФ в Cl-форме с коэффициентом набухания 2,0. Потери ферментативной активности не наблюдается. Обесцвеченный нативный раствор подкисляют до рН 4,0. А1милолитическая активность подкисленного нативного раствора равна 25

АЕ протеолитическая - 7, Π— . Вйход

ПЕ м на стадии подкисления для амилазы составляет 71%, для протеазы 70% .

Сорбцию ферментов осуществляют на КМДМ, уравновешенном 0,5 М ацетатным буферным раствором рН 4,0, количество сорбента 5 г. КМДИ насыщается амилаэой на 45% (активность нативного раствора на выходе из колонки в конце сорбции 11,3 вЂ,) . Процент

АЕ сорбированных ферментов от пропущенного количества составляет для амилазы 85, для протеазы 85, а выход от исходного нативного раствора — 61Ъ и 59, 5% соответственно. После сорбции смолу в колонке промывают 20 мл

0,1 М ацетатным буферным раствором рН 4,0.

Десорбцию амилазы осуществляют лри рН 5,0 0,1 М ацетатньм буферным раствором. Первые 10S мл элюата имеют е 5 696024

50 29 45 30

100 67 90 57 75 40

С макс,, ед.акт-ти мл (в пике) 250 188 325 140 380 180

900 98 750 84

С макс.

С исх. (концентрирование) 33 14 30 12

100 - 90 95 90

10 25 13 20 16 30

Выход, Ъ 90 90 90 95 87 95

С вЂ” отношение концентрации фермента на выходе иэ колонки к исходной концентрации в растворе, Ъ.

Формула изобретения

Составитель A.Áî÷àpoâ

Техред С.Мигай корректор И.Михеева редактор С .Лазарева

Заказ 6700/25 Тираж 513 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r .Ужгород, ул. Проектная, 4 активность 750 Я- и содержат 74Ъ сорбированной амйлазы (или 63Ъ от ,пропущенного количества), следующие

70 мл элюата имеют активность 190 @-.

Всего десорбируют 95Ъ амилазы. Десорб,цию протеазы проводят при рН 7,0 0,1М (фосфатным буферным раствором. Активные фракции начинают выходить при рн 6,1, высокоактивная фракция.про= теаэы (250 мл) имеет активность 84

М и содержит 70Ъ от сорбированного фермента (или 60Ъ от пропущенного количества) . Всего десорбируют 90Ъ

Способ очистки аС-амилазы (КФ.

40 .3.2.1.1) из нативного раствора

AspergiIXus terricoIa посредствЬч хроматографии на макросетчатом карбоксильном катионите — сополимере метакриловой кислоты и диметакриламида, отличающийся тем, что, с целью получения высококонцентпротеазы. Так как для получения препаратов ферментов используют высокоактивные элюаты ферментов, то выход на стадии десорбции от исходного нативного раствора составляет для амилазы порядка 51Ъ, для протеазы 42Ъ.

При лиофильной сушке потери фер;ментативной активности минимальны и ъе превышают ЗЪ. Общий выход ферментов от нативного раствора составляет для амилазы порядка 50Ъ, для протеазы 40Ъ. рированных элюатов, увеличения выхода фермента, а также сокращения длительности процесса, сорбцию амилазы проводят в. условиях неполного на 40-60Ъ насыщения сорбента сорбатом.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

9465912, кл., С 07 G 7/028, 1974.