Способ получения -галактозидазы

 

О П И С А Н И Е 01,У18447

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 09.08.78 (21) 2658201/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет (43) Опубликовано 28.02.80. Бюллетень № 8 (45) Дата опубликования описания 28.02.80 (51) М.К .

С 0?G 7/02//

//А 61К 37/48

Государственный комитет (53) УДК 577.15.0? (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

Г. Г. Колтушкина, E. Д. Ермолаев и Ю. П. Вейнберг (71) Заявитель (54) CIIOCOli IIOJI3" EHH 8-ГАЛАКГОЗИДАЗЫ

CXI3

Изобретение относится к способу получения р-галактозидазы (P-D-галактозид— галактогидролаза, К. Ф, 3.2. 1. 23), фермента, катализирующего гидролиз дисахарида лактозы до моносахаридов — глюкозы и га- 5 лактозы. Фермент является весьма перспективным для практического применения в хлебопечении, при приготовлении концентратов молока, диетических безлактозных продуктов, в медицине — для целей заме- 10 стительной терапии при лечении лактазной недостаточности, в сельском хозяйстве— для получения противоящурного иммунолактона.

Известны способы получения р-галакто- 10 зидазы из микробиологического сырья, например из культуральной жидкости гриба

Curvularia inaegualis, р-галактозидазу выделяют осаждением органическими растворителями. Получают препарат с удельной 20 активностью 0,8 ед/м г преп ар ата или

Зед/мг белка (1).

Наиболее близок по технической сущности к изобретению способ получения Р-галактозидазы из клеток дрожжей Saccharo- 25

myces fragilis, заключающийся в экстракции фермента буферным раствором рН 6,9 и осаждении I(2)

Из клеток дрожжей Saccharomyces fragilis фермент экстрагируют 0,001 н. фосфат- 30 ным буфером рН 6,9. Экстракцию обычно проводят при 5 С в течение 20 ч или при

30 С в течение 4 — 6 ч. Осаждение р-галактозидазы обычно осуществляют органическими растворителями — этиловым спиртом (4 объема) или ацетоном (1,4 объема) при температуре — 6 С. Выход ферментного препарата — 28 — 30%, удельная активность

0,7 ед/мг белка (после осаждения этиловым спиртом) и 1,2 ед/мг белка (после осаждения ацетоном).

Недостатками известного способа являются незначительный выход и низкая удельная активность выделенного препарата вследствие значительных потерь активности.

Цель изобретения — увеличение выхода и удел ьпой а ктив ности Р-гал актоз идазы.

Указанная цель достигается тем, что экстракцию и осаждение фермента проводят в присутствии 8-меркаптохинолина с концентрацией (2,5 — 5) 10 — 4 моль/л.

8-Меркаптохинолин представляет собой тиолсодержащее соединение, обладающее также хелатными свойствами, формулы

718447

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Техред А. Камышникова Корректор Т. Трушкина

Редактор А. Соловьева

Заказ 132/16 Изд. № 186 Тираж 497 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр, Сапунова, 2

Мехайизм активации и стабилизации структуры Р-галактозидазы 8-меркаптохинолином закл1очается в защите сульфгид рильных цистеиновых групп активного центра фермента ог окисления благодаря наличию SH-группы в молекуле 8-меркаптохинолина.

Хелатные свойства 8-меркаптохинолина одновременно обеспечивают предотвращение инактивации фермента ионами тяжелых металлов, которые связываются 8-меркаптохинолином с образованием комплексной соли.

Согласно изобретению описывается способ получения р-галактозидазы из клеток дрожжей Saccharomyces fragilis путем экстракции фермента буферным раствором рН

6,9 и осаждения, которые осуществляют в присутствии 8-меркаптохинолина при концентрации (2,5 — 5) 10 — 4 моль/л.

Описываемый способ обеспечивает выход галактозидазы 74 — 88% и с удельной активностью 7,4 — 11,3 ед/мг белка.

Пример 1. 100 r дрожжей Sacch. fragilis суспендируют в 1 л 0,001 н. фосфатного буфера рН 6,9 с добавлением 8-меркаптохинолина 2,5.10 — 4 моль/л. Экстракцию проводят в течение 6 ч при 30 С, Затем суспензию центр и фуги руют, р-галактозидазу из осветленного экстракта осаждают сульфатом аммония (40 — 60% насыщения) .

Осадок суспендируют в 50 мл того же буфера и добавляют глицерин (50%). Препарат хранят в виде суспензии в глицерине.

Активность 7,4 ед/мг белка. Выход 74%.

Пример 2, Экстракт приготавливают по примеру 1. Концентрация 8-меркаптохинолина в буфере — 3,0 10 — 4 моль/л. р-Галактозидазу из осветленного экстракта осаждают 4 объемами этилового спирта при — 6 С. Осадок суспендируют в 100 мл того же буфера, содержащего 8-меркапъохинолин с концентрацией 3.10 — 4 моль/л. Хранят в 50%-ном растворе глицерина. Активность

8,1 ед/мг белка. Выход 84%.

Пр им ер 3. Приготовление экстракта и осаждение ведут аналогично примеру 2, концентрация 8-меркаптохинолина 5 10-4 моль/л. Активность 9,3 ед./мг белка. Выход

87%.

Пример 4. Приготовление экстракта и осаждение осуществляют аналогично примеру 2, концентрация 8-меркаптохинолина — 2,5.10 — 4 моль/л. Активность 8,2 ед/мг

10 белка. Выход 79%.

П р и м ер 5. 100 г дрожжей Sacch. fragi1is экстрагируют в присутствии 1 л фосфатного буфера рН 6,9 с добавлением 2,5.

° 10 — 4 моль/л меркаптохинолина в течение

15 20 ч при 5 С. Экстракт центрифугируют, недостаточную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной ячейке через ацетатцеллюлозные мембраны УАМ-200 в

10 раз (давление — 3 атм, температура—

4 — 5 С) 100 мл концентрата промывают

3 раза по 1 объему того же буфера с меркаптохинолином (2,5 10 4/л) . Активность

11,3 ед/мг белка. Выход 75%. Хранят в

50%-ном глицерине.

Способ получения Р-галактозидазы из клеток дрожжей Saccharomyces fragilis, включающий экстракцию фермента буферным раствором рН 6,9 и осаждение, отл ич а ю щи "! с я тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевого продукта, экстракцию и осаждение проводят в присутствии 8-меркаптохинолина при концентрации (2,5 — 5) 10 — 4 моль/л.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 480759, кл. С 12D 13/10, 1972.

2. Фениксова P. В. и др. Получение препаратов Р-галактозидазы из дрожжей

Sacchar. fragilis. — «Прикладная биохимия и микробиология», т. 7, вып, I, 1971, с. 34, 45 (прототип) .