Способ получения иммобилизованных ферментов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик ()744ОО2

К АВТОРСКОМУ СИИ ИТИЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ау (22) Заявлено 290977 (21) 2527891/23-04 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет—

Опубликовано 300680„ Бюллетень ¹ 24

Дата опубликования описания 30,06,80 (51)М. Кл.

С 07 6! 7/02//

A 61 К 37/48

Государственный комитет

СССР

bio делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15. .07(088.8) A. ß. Озолиньш, М.О. Мандель, К.Э. Паппель и A.È. Кестнер

/ (72) Авторы изобретения таллинский политехнический институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПО))УЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к областй биотехнологии и, в частности, к спо- собу получения иммобилизованных ферментов, которые сохраняют общие свойства ферментов и могут быть использованы в качестве гетерогенных катализаторов в реакциях превращения органических соединений и биохимических препаратов как в периодическом, (() так и непрерывном процессе катализа, в химической, микробиологической, медицинской и пищевой промышленйости.

Известные в настоящее время способы получения иммобилиэованных ферментов методами ковалентного свяэы1 вания ферментного белка на водонерастворимЫе носители основываются на применении бифункциональных реагентов, которые способны реагировать с водонерастворимым носителем и с ферментным белком (1) . Общим недостатком большинства известных способов можно считать относительно низкую термическую стабильность получаемых препаратов.

Известен также способ получения иммобилиэованных ферментов посредством ковалентного связывания ферментов с водонерастворимыми носителями, Ьктивированными бифункциональным реагентом — 1,4-бензохиноном (2). Согласно известному способу иммобилизованные ферменты (например, трипоин, пенициллинамидаза) или другие протеи- ны получают путем ковалентного связывания их с полисахаридными носителями при помощи 1,4-бензохинона или

:1,2-нафгохинона. Гели (например, АП- Sepharose 4В) подвергают инкубации при перемешивании в фосфатном буфере (рН 7,4) в присутствии 1,4-беи-! эохииона при комнатной температуре в

:течение 20 ч. После удаления иепро- реагировавшего бенэохинона промывайием геля добавляют фермент и проводят реакцию при 20С в течение 24 ч.

Иммобилизованный фермент промывают ,многократно буфером, а затем 1 М раствором хлористого натрия. Отмечается, что активность препарата сохраняется при температуре 4 С в течение

3 месяцев °

Этот способ прост. Однако в этой способе не устраняется. указанный недостаток, присущий другим известным способам иммобилизации, а именно низкая термостабильность получаемых препаратов.

744002

Целью иэобретения является увели чение термостабильности препаратов щммобилиэованных Ферментов. укаэанная цель достигается эа счет того, что иммобилиэованные ферменты дополнительно обрабатывают глутаровым альдегидом в количестве 0,5—

3 мта/экв . на 1 г носителя при 4-40 С э течение 1-24 ч.

Согласно изобретению описывается способ получения иммобилизованных ферментов с повышенной стабильностью арепаратов путем ковалентного связывания ферментов с водонерастворимыми носителями, предварительно активированными 1,4-бенэохиноном, с последующей обработкой препаратов глутаровым альдегидом B количестве 0,5-3 мл экв, на 1 г носителя при 4-40ОC в течение

1-24 ч.

Реакция связывания фермента с 1,4-бензохиноном осущеотвляется через 20 аминогруппы белка и носителя. С целью увеличения количества аминогрупп на йосйтепе его можно предварительно обрабатывать 3-аминопропилтриэтоксйСиланом. После нуклеофильного присоеди- 25 нения 1,4-бенэохинона носителем и ферментным белком на поверхности носителя образуется оболочка иэ ферментного белка, которая вследствие диссоциации легко удаляется и тем самым уменьшает стабильность иммобилиэованного Фермента.

После реакции свободных остатков аминогрупп с.такой оболочкой образуются прочные дополнительные связи

Между отдельными молекулами Ферментного белка и глутарового альдегида.

Таким образом, образуется препарат иммобилизованного фермента, который обладает более высокой термической стабилЬностью. Следовательно, соче- 4О таяне двух самостоятельно протекйо - щих реакций в присутствии реакциойноспособных бифункциональных реагентов приводит к повышению доли стабильной фракции иммобилизованного фермента в препарате от 30 до 55Ъ, а скорость термической йнактивации стабильной фракции фермента уменьшается в 4 раза при температуре 70 С.

Пример 1. Взвешивают 10 r силанизированного 3-аминопропилтри этоксиланом силохрома СХ-2 с разме рами частиц 0,25-0,5 мм и содержанием активных аминогрупп на поверхностй носителя 190 мл экв/г. Добавляйт 1,5 г кристаллического 1,4-бенэохинона и 40 мп технического этанола. После контактирования суспензии в течение 1 ч при комнатной температуре полученный продукт промывают техническим этанолом до полного исчезновения темно-коричневого цвета в промывных водах (всего 500 мл/г), а затем дистиллированной водой (всего

200 мп/г) для удаления следов этанола.

Получают 22,3 г влажного материала.

Для проведения иммобилизации пенициллинамидазы 10 г материала смешивают с 50 мл ферментного раствора с пенициллинамидаэной активностью

20000 E/мл. За единицу действия пенициллинамидазы принято такое ее количество, которое гидролизует К-соль бенэилпенициллина в 17 мл раствора при 40 С и РН 7,0 в присутствии

0,1 М КСС с образованием одного мкмоль фенилуксусной кислоты в 1 ч.

После инкубации смеси при комнатной температуре в течение 10 ч готовый материал промывали сначала дистиллированной водой (всего 1000 мл), а затем 1 и растэором ИаС3 для удаления непрореагировавшего фермента.

Получают 9,9 г иммобилизованной пенициллинамидазы, которая обладает активностью 5200 E/ã сухого препарата.

Для увеЛичения стабильности полученного препарата его обрабатывают при помощи водного раствора глутарового апьдегида: на 8,5 r иммобилиэованной пенициллинамидазы добавляют

90 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0 и 10 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида (1,5 мл.экв. на 1 r влажного материала). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч.

После обработки препарат промывают для удаления следов глутарового альдегида дистиллированной водой (всего 500 мл) .

Для определения стабильности препарата инкубируют его при температуре 40 С в 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,5), в течение 800-1000 ч. Скорость термической инактивации иммобилиэованной пенициллинамидазы равняется 0.,000333 ч-1 .

Сравнительные данные по стабильности препаратов пенициллинамидазы, обработанной глутаровым альдегидом и беэ него, приведены в табл. 1.

744002

Таблица l

Стабильность препаратов иммобилизованной пеннциллинамидазы, полученной ковалентным связыванием фермента 1,2-бенэохиноном и обработанных глутаровым альдегидом и беэ него

1 Исходная

100

5200

100

4846

4207

3692

3297

3266

85,3

63,7

5l,5

39,3

27,8

25,6

97,3

4436

2 18,5

3 142

93,2

3312

80,9

2678

4 263

5 401

2044

71,1 б 592 1446 63,4

7 635 1331

Таким образом, применение глута- !примере 1. Применяют 0,24 мл 25%-нороаого альдегида приводит к увеличе- щ ro раствора глутарового альдегида на нию работоспособности иммобилиэован- . 1 r сухого носителя;в 10 мл дистиллиной пенициллинамидазы (активность не рованной воды. Обработка продолжаетниже 3000 E/г) не меньще, чем в 3 - ;ся в течение 2,5 ч. Готовый препарат, 4 раза.,промывают 0,1 М ацетатным буфером

Пример 2. Получение активи- j();pH 4,5, рованного носителя осуществляют так же, как описано в примере 1. С целью . Термостабильность иммобилиэованполучения препарата с fh-галактозидаэ- ной P -галактоэидаэы изучают инкубиНо . активностью составляют смесь из . рованием препарата в 5%-ном растворе фермента и носителя (5 мл ферментно- лактозы (рН 4,5) при температуре го раствора активностью 48 E/мл на З5. 700С в течение 180 мин. установлено, 1 г носителя) . После инкубации a Te- что препарат ийактивируется в две " чение 5 ч при комнатной температуре стадии: за первой стадией (т ° н. негранулы промывают 0,1 М ацетатным стабильная фракция фермента, всебуфером рН 4,5 и 1 M раствором ИаСЕ. го 42%), следует вторая стадия с

Получают препарат с активностью "0, стабильной фракцией фермента

201,8 E/ã сухого материала. . (58%). Скорость инактивации стаЗа единицу действия р-галактоэида- бильной фракции фермента 0,0095 мий зы принято такое ее количество, кото- Пример ы 3- б. Эти примеры рое осуществляет гидролиэ синтетнчес- описывают обработку глутаровым алького субстрата О-нитрофенил-p-D-ra- 45 дегидом препаратов иммобилизованной лактопиранозида при температуре 30 С пенициллинамидазы в различных услов 0,1 M ацетатном буфере рН 4,2 с, виях. образованием мкмоль О-нитрофенола в . Условия проведения обработки и течение 1 мин. Обработку глутаровым результаты по стабильности препаратов альдегндом проводят, как описано в 5Q приведены в табл. 2.

IT а.б л и ц а 2.

Условия проведения обработки иммобилизов анной пенициллинамидазы глутаровым альдегидом и стабильность полученных препаратов

800

1,0 22

1 0 22

3,33

3, 7-5

1,50

0,77

1117

0,64

744002

Продолжение табл.2

1,0 22

1,0 35

3,0

0 18

3,26

4 б

1,8, 2,25

1,24

0,94

920

0,99

0,75

«Стабильность определяют после инкубации препарата в 0,1 M фосфатном буфере при рН 7,5 и температуре 40 С.

Hp и м е р 7. Получают активироваиный 1,4-бензохиноном носитель слеДующим образом.

Взвешивают 10 г силохрома СХ-2 с размерами частиц 0,25-0,5 мм, добавляют 20 мл дистиллированной воды и

1,0 мл 3-аминопропилтризтоксисилана (содержание аминогрупп в силане

3800 мк:зкв/мл) перемешивают и оставляют при комнатной температуре. Чераэ 3 ч гранулы фильтруют и нагревают при температуре 120 С в течение 1 ч.

Рранулы промывают многократно (5 раз по 300 мл дистиллированной водой) до исчезновения в промывных водах следов силана (обнаруживают хиноном).

Содержание активных аминогрупп на поверхности носителя 180 мк ° зкв/г сухого материала. на 10 r обработанного силаном силохрома добавляют 1,5 г кристаллического ),4- бенэохинона и 40 мл технического зтанола. После контактирования суспензия в течение 1 ч при ком» натной температуре полученный темнокоричневый продукт промывают техническим этанолом, дистиллированной водой и 0;05 М ацетатным буфером рН 4,7.

Дпя получения иммобилизованной иввертазы применяют дрожжевую инвертазу марки A Олайнеского завода химреактивов. 7,5 г порошка инвертазы растворяют в 50 мл 0,05 М ацетатного буфера РН 4,7, активность

15400 Е/мл (всего 770000 Е). Активность инвертазы выражают в микромолях сахаровы,которая расщепляется при действии фермента в 7%-ном растворе сахарозы в 0,05 М ацетатном буфере

РН 4,7 при температуре 40 С. 50 мл раствора инвертазы приливают к 50 г гранул влажного активированного силохрома. Полученную суспензию (после тщательного перемешивания) оставляют в холодильнике. Реакция носителя с ферментом продолжается 17,5 ч,фильт-рацией удаляют 48 мл ферментного раствора с активностью 3120 E/Më(все

ro 149760 Е, 19,4%)..Препарат иммобилизованной инвертазы промывают ацетатным буфером (т.е. удаляют еще

81000 Е, 10,5%) и дополнительно 1 М раствором КС8 (т.е. удаляют еще

18800 Е, 2,2%) . Активность препарата иммобилизованной инвертазы — 4500 Е/г влажного носителя (всего 225000 Е, 29,2%).

Для увеличения стабильности полученного препарата его обрабатывают при помощи водного раствора глутарового альдегида: на 50 г иммобилизованной инвертазы добавляют 480 мл .

0,05 М ацетатного буфера рН 4,7 и

20 мл 25%-ного раствора глутарового (). альдегида (О 5 мл экв. íà 1 г влажного материала) . Смесь выдерживают при комйатной температуре в течение

1 ч. После обработки препарат промывают для удаления следов глутарового

45 альдегида 0,05 М ацетатным буфером.

Активность полученного препарата

4430 Е/r (всего 221500 Е, 28,8%) .

Для проверки работоспособности данного препарата 49,8 r гранул им-, $Q мобилизованной инвертазы помещают в терморегулируемую при 50 С колонку, а через нее пропускают раствор сахарозы с концентрацией 700 мг/мл со скоростью 14 мл/мин. Содержание редуу цирующих сахаров в продукте 690 мг/мл, степень конверсии 98,6%.

Сравнительные данные по термостабильности препаратов иммобилизованной инвертазы, обработанной глутаровым

6О альдегидом и без него, приведены в табл. 3.

744002

Таблица 3

Стабильность препйратов иммобилиэованйой инвертаэы, полученной ковалентным связыванием фермента с 1, 4-бензохнноном и обработанной глутаровым альдегидом и без него (стабильность определяют хранениеМ препаратов при 60 С в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7) ) 4430

1 Исходная

2 10

100

100

4500

96,3

93,7

86,3

79,0

77, 5

66,1

46,8

88,2

79,8

69,3

62,3

53,6

45,3

24,8

4266,1

4150,9

3823

3969

3 20

4 40

5 60

3591

3118,5

2803,5

2412

3499,7

3433,2

2928,2

-2073,2 6 80

7 100

8 180

2038,5

1116,0

Время полужизни иммобилизованной Ç0 инвертаэы равняется для препарата, обработанного глутаровым альдегидом и без него, 160 и 86 мин соответственно..Скорость термоинактивации препарата увеличивается до 2,раз; 35

П р н м е р 8. Получение активированного носителя для иммобилизации глюкоамилазы осуществляют так же, как описано в йрймере 7. В работе применяют- глюкоамилаэу фйрмы Hoao (да- 40

: . ния) из Аар. niger активностью ,500 Е/мл и с содержанием белка

300 мг/мл. Активность фермента выра жается цо способности образовывать иэ 0,5Ъ-ного растворимого крахмала в течение 1 мин при температуре 20 С и рН 4,7 (0,05 M ацетатный буФер)

1 мкмоль глюксзы. Концентрацию белка определяют по поглощению ферментного раствора при 280 нм. 50

На 11,0 г активированного силаном и 1,4-бензохиноном силохрома добав ляют 25 мп Ферментного раствора глюкоамилазы с активностью 500 Е/мп (нСего 12500,E) и контактируют суспензию 55 в течение 114 ч при комнатной тЕмпературе. Маточный раствор содержит после реакции белка 117,5 мг/мл (всего

2938, мг, 39,2%) и имеет активность

480 .Й/мл (всего .12000 Й, 96%). Препа-.60 рат иммобилизованной глюкоамилазы име-. ет активность по 0,5% крахмалу

3093 Е/r влажного препарата. для увеличения Стабильности пОлученного препарата его обрабатывают при помощи водного раствора глутаро вого альдегида: на 11,.0 г иммобилизованной глюкоамилазы добавЛяЮт 91 Мп, 0,05 М ацетатного буфера рН 4,7 и

8,6 мп 25Ъ-ного раствора глутарового альдегида (1,0 мп" Экв. на 1 г влаж-, ного материала). Смесь выдерживают при комнатной температуре "в течение

3 ч. После обработки препарат промывают 0,05 М ацетатным буфером для удаления следов глутарового альдегида. с

AKTHBBocTs ïîëó÷åéíoãî препарата

30,2 Е/г.

Для проверки работоспособности иммобилизованной глюкоамилазы 10,94 г препарата помещают в термостатируемый реактор с перемешиванием и добавляют 35%-ный раствор мальтодекстрина (фирма Иайзен, исходный декстроэный эквивалент 17,5) в 0,05 N ацетатном буфере рН 4,7. Гидролиз мальтодекстрина проводят при температуре

60 С. После 10 мин гидролиза содержание редуцирующих сахаров .(определяемых по Бернфельду динитросалициловой кислотой) 50 мг/мл, через

40 мин — 240 мг/мл, 120 мин —

280 мг/мл.

Сравнительные данные по 11термоста" бильности препарата иммобилизованной глюкоамилазы, обработанной глутарО» вым альдегидом и без него, приведены в табл. 4.

744002

Таблица 4

Стабильность препаратов иммобнлиэованной глюкоамнлазы, полученной ковалентным связыванием фермента с 1,4-бензохиноном и обработанной глутаровык альдегидом и беэ него (стабильность определяли хранением преларатов при 60 С и в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7)

500 100

1 Исходные

2 10

30, 3 100

30,2 100

441

381,5

88,2

76,3

3 20

4 30

30 3 100

30,2 100.60,6

51,1

51 1

3 03

255,5

25,6

84,7 28,6

94,8

255,5

76,1 26,1

23,0

86,3

42,6

3,8,0

34,6

3 2, 5

213

: 173

162,5

21,2

21,0

20,7

23,9

70,2

70,0

67,5

79,2

77,0

76,3

23,3

23,0

1:

1 . 4

Таким образом, активность препара - л и ч à ro itt и и с я тем, что, с та, обработанного глутаро4вым альдеги- - целью увеличения термостабильности

"дом, йадает до 76% в течеййе 180 м4ин, целевых продуктов, иммобилизованные в то время как актйвность препарата . Фа@менты дополнительно обрабатывают беэ обработкй глутаровым альдегидой . "" :глутаровым альдегидом в количестве сиимается до 76% уме в течение" 90:минф© 0,5-3 мл.экв. на 1 r носителя при т.е. в, 2 раза быстрйе. . :-: " .: : : 4-40"С в течение 1-24 ч.

Источники информации, Форйула изо4бре4тен4ия4: ;:: ...: :, . : принятые во в4ним4анйе при экспертизе

1. Иммобилиэов4анные ферменты. сб.

СПОСОб ПОЛУ4ЧЕН4ИЯ ИЬВЮбИЛИ4ЭОВ44аННых. 45 под ред. Березина И.B ., Антонова В.K„ .ферййитов путем ковалентного связы- Мартинека К.,т. 1. М., изд-во МГУ, ванин ферМентов с водонерастворимы- 1976. ми йоситарями, предварительно акти- 2. патент сшА и 2615349, вированными 1,4-бенэохиноном, о т - кл. С 07 G 7/00, 1976 (прототнп) .:

Составитель A. Бочаров

Редактор Г. Никольская Техред,О. Андрейко Корректор С., Шекмар

Заказ 3642/1

Филиал ППП Патент, г,. Ужгород, ул, Проектная, 4

5 40 б 60

7 80

8 90

9 100

10 120

11 150

12 180

Тираж 495 Подписное

ЦНИИПИ Росударственного комитета СССР по делай изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5