Способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ИТИЛЬСТВУ

< 744004 I

Союз Советских °

Социалистических

Республик

1 (б1) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 07.0478 (21) 2600952/23-04 (я)м. к,,>

С 07 Н 21/00ф

A 61 К 31/70 с присоединением заявки Мо

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открыти и (23) Приоритет (53) УДК 547.963. .32.07(088.8) Опубликовано 300680. Бюллетень М 24

Дата опубликования описания 3006.80

»с 3 Л с .» l

H.Ý. Баумане, И.A. Шмите, С.Э. Ънсберга и И::И--.=Расса

Ц в„ (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЬИ

ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ г

Изобретение относится к усовершенствованному способу Получения высокомолекулярных полинуклеотидов, шиРоко применяемых в генетике и ме-. 5 дицине .

Известен способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов, заключающийся в реакции полнмериэации ! нуклеоэид-5 -дифосфатов полинукле- )Q отидфосфорилаэой при температуре 3037 С и РН 8,0-8,1,отделении белка добавлением Фенола, осаждении смеси полинуклеотндов спиртом и в последующем разделении полученной смеси гель-Фильтрацией на сефадексе G-100 на целевой продукт и ниэкомолекулярную фракцию. Выход полинуклеотидов

55%. Состав полинуклеотидной фракции

80% высокомолекулярных полинуклеоти- 2О дов, 20% ниэкомолекулярных полинуклеотидов (1) ."

Известный способ имеет следующие недостатки: сравнительно низкий выход высоко- 25 молекулярной полинуклеотидной фракции, что составляет 80% из всех полученных полинуклеотидов; высокий расход дорогостоящего и дефицитного сырья, так как непро- О реагировавшие рибонуклеМид-5 -диФосфаты и низкомолекулярные 1поли" нуклеотиды (20% от полученных полинуклеотндов) далее неjиспользуются.

Целью изобретения является увеличение выхода высокомолекулярных полинуклеотидов и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем что полученную после осаждения спиртом смесь полинуклеотидов предварительно освобождают !от низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией н последующее разделение гель-фильтрацией осуществляют на геле ЕД-10, что. позволяет улучшить разделение полинуклеотидной смеси, увеличить выход высокомолекулярных соединений на 15% и повторно испольэовать выделенные нуклеозид-5 -дифосфат и ниэкомолекулярные полинуклеотиды.

Предлагаемый способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов заключается в реакции полимеризации нуклеозид-5 -дифосфатов олинуклеотидфосфорилаэой при температуре 3037 С и рН 8,0-8,1, в отделении белка органическим .реагентом, предпочтительно смесью, хлороформа и изоамило744004

4 (Формула изобретения

1. Способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов путем реакции

65 полимериэации нуклеоэид-5 -дифосфаI вого спирта в соотношении 2 5 1, в оеаждении смеси поли нуклеотидов спиртом, в предварительном освобождении полученной после осаждения спир- . том смеси от ниэкомолекулярных примесей ультрафильтрацией и в последующем разделении гельфильтрацией на геле ЕД-10.

Выход полинуклеотидной фракции

55%.

Состав полинуклеотидной фракции:

95% высокомолекулярных полинуклеотидов, 5% низкомолекулярных полинукле«

Оксидов.

Непрореагиров авшие нуклеозид-5

-дифосфат и ниэкомолекулярные полинуклеотиды возвращаются в процессе биосинтеза.

Пример 1. 100 мг натриевой соли аденозин-5 -дифосфата раство-

l ряют в 1,0 мм 1 М трис-НСВ буфера, 20 рН 8,0, прибавляют 1,0 мл 0,05 М раствора ацетата магния и 3-5 мл фер мента (в зависимости от активности, иэ расчета 5-6 ед., активности на

100 мкм И субстрата) . Добавляют ди- 25 стиллированной воды до 10 мл и смесь инкубируют в термостате при 37"С.

Через каждый час отбирают пробу по

0,2 мл для определения неорганического фосфора, выделенного в реакции.

Реакцию останавливают выдерживанием смеси при 100 С 3-5 мин, когда наступает значительное снижение скорости выделения ортофосфата. Выпавший осадок отцентрифугируют 10 мин при

2500 об/мин и +4 С и отбрасывают. К центрифугату добавляют 2,5 мл хлороформа и 1,0 мл изоамилового спирта и 15 мл встряхивают. Полученную смесь центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин и +4 C. Полиадениловую кислоту (по- 40 ли-A) высаживают из водного слоя двухкратным объемом этилового спирта с кристалликами хлористого натрия.

Полученный осадок растворяют в дистил- . лированной воде. Для освобождения 45 раствора от низкомолекулярных примесей раствЬр пропускают через ультрафильтрат (размеры пор 5000-10000 Х).

Получают две фракции: низкомолекулярную и высокомолекулярную. 50

Высокомолекулярную фракцию пропускают через колонку с гелем ЕД-10 (размеры колонки 60 2). Получают поли-А с мол .весом 70000-100000. Выход 49 мг.

Ниэкомолекулярные нуклеотиды (5В) используют вновь для синтеза полинуклеотидов. Низкомолекулярную фракцйю проЩ скайт через колонку с гелем ЕД-1 (размеры колонки 60 2). Получают непрореагировавший аденоэин- 60

-5 -дифосфат-20 мг. Колонки проьывают и злюируют с 0,1 М раствором хлористого натрия. Препарат выпаривают и сушат на ротационном выпарителе.

Аденоэин-5 -дифосфат используют в нов ь для си нтеэ а полин уклеотидов, Выход 55% ° (Состав полинуклеотидной Фракции: 95% высокомолекулярных и 5% ниэкомолекулярных нуклеотидов) .

Пример, 2. 125 мл натриевой соли уридина-5 -дифосфата растворяют. в 1,0 мл 1 М трис-HCE буфера(рН 8,0), прибавляют 1,0 мл 0,05 М раствора ацетата магния и 3,5 мл раствора фермен-: та (в зависимости от активности из расчета 15-20 ед. активности на

100 мкм М субстрата) . Добавляют дистиллированную воду до 10 мл и смесь инкубируют в термостате при 37 С. Через каждый час отбирают пробу по

0,2 мл 40%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для определения неорганического Фосфата, выделенного в реакции. Реакцию останавливают выдерживанием смеси при 100 С 3-5 мин, когда наступает значительное снижение скорости выделения ортофосфата.

В реакции выпавший осадок отцентрйфугируют 10 мин при 2500 об/мин и

4 С и отбрасйвают. К центрифугату добавляют 2,5 мл хлороформа и 1,0 мл иэ амилового спирта н встряхивают

30 мин прн 6000 об/мин и 4 С. Полиадениловую кислоту высаживают иэ водного слоя двухкратными объемами этилового спирта и кристалликами хлористого натрия..

Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде. Получают поли-A с мол.весом 100000.

Для освобождения раствора от ниэкомолекулярных примесей раствор пропускают .через ультрафильтрат (разме-, ры пор, 5000-10000 А). Получают две

Фракции: низкомолекулярную и высокомолекулярную.

Высокомолекулярную фракцию пропускают через колонку с гелем ЕД-10 (размеры колонки 60"2). Получают поли-А с мол.весом 70000-100000. Выход

25 мг. Низкомолекулярные полинуклеотиды (5Ъ) используют вновь для синтеза полинуклеотидов. Ниэкомолекулярную

Фракцию пропускают через колонку с гелем ЕД-1 (размеры колонки 60 2), 3

Получают непрореегируюший уридин-5 -дифосфат, 40 мг. Колонки промывают и элюируют 0,1 М раствором хлористого натрия. Раствор выпаривают и сушат на ротационном выпарнтеле.

Аденозин-5 -дифосфат используют вновь для синтеза полинуклеотидов.

Выход 55% (состав полинуклеотидной фракции: 95% высокомолекулярных и 5% ниэкомолекулярных нуклеотидов).

744004

Составитель Л. Никулина

Редактор T. Никольская Техред М. Петко. Корректор М. Демчик

Тираж 495 Подписи ое

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по. делам изобретений и открытий.

113035, Москва,. Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3642/1

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тов полинуклеотидфосфорилазой при температуре 30-37 С и рН 8,0-8,1, отделения белка добавлением органического реагента, .осаждения смеси полинуклеотидов спиртом и последующего разделения полученной смеси гельфильтрацией, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения процесса, полученную после осаждения спиртом смесь предварительно освобождают от. низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией и последующее разделение гельфильтрацией осуществляют на ,геле ЕД-10.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем,.что в качестве органического реагента для осаждения белка используют;смесь хлороформа и изо-. амилового спирта в соотношении 2,5:1, 1

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. 3. Stahl und W. Heumann A

procedure for the production of Iongchained poIynucIeotides using, polynucIeotide phosphoryIase from М1сroccus Iysodeictiaes, Acta BioI.

MeoI.. Ger. 14 (2) 108-113, 1965 (прототип) .