Способ диагностики отравлений тяжелыми металлами

 

ОПИСАНИЕ „„06

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 030278 (21) 2576496/28-13 (51)М. Кл.

А 61 В 10/00 с присоединением заявки М

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет (53) УДК 6 1 6-, 07 9 ° 3, (088 ° 8) -"--:- Опубликовано 0707.80. Бюллетень М 25

Дата опубликования описания 07.0780 (72) Автор. изобретения

Т. A. Ардавичене (71) Заявитель

Иркутский государственный медицинский институт (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТРАВЛЕНИЙ

ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ

Изобретение относится к медицине. а именно к способам диагностики от-. равлений организма.

Известны в медицинской практике способы диагностики отравлений тяжелыми металлами, например таллием, свинцом и др. путем определения в крови концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, ретикулоцитов, базофильно-пунктированных эритроцитов, а в моче — концентрации порфири,нов и g -аминолевулиновой кислоты.

Известен способ диагностики отравлений тяжелыми металлами путем определения нуклеиновых кислот в эритро- 15 цитах. Сущность этого способа заключается в том, что 0,1-0,2 мл охлажденной крови переносят в центрифужные . пробирки с охлажденным цитратом натрия, перемешивают и центрифугируют 20

6 мин при 15000 об/мин. Эритроциты два раза промывают цитратом натрия и добавляют к ним 30-кратное количество диэтилового эфира. После перемешивания и сливания эфира к остат- 25

: ку добавляют смесь диэтилового эфира, этанола и ацетона в соотношении

30:1:1, которую после перемешивания удаляют струей воздуха от водоструйного насоса. Из обработанной органи- 30 ческими растворителями пробы экстрагируют нуклеотиды обработкой ЬЪ-ным раствором трихлоруксусной кислоты.

Экстракт отделяют центрифугированием, трижды промывают охлажденным до 9 С эфиром и наносят на стартовые полоски бумаги до 0,1 мл.

После высушивания полосок бумаги с нанесенными на них пробами прово-. дят электрофорез в условиях охлаждейия при напряжении 850-950 В, при силе тока 2,5 А, падении потенциала

30 В/см и рН 3,9 в течение 2 ч. Элюирование осуществляют 0,5 мл 0 1 н. раствора соляной кислоты, Спектрофотометрируют при 260 нм $1j .

Однако, используя известные способы диагностики отравлений тяжелыми металлами, нельзя установить ранние или начальные признаки интоксикации. При помощи известных способов диагностики устанавливают наличие интоксикации, когда в системе крови развились значительные нарушения, выражающиеся в раздражении эритроидного ростка красного костного мозга. В периферической крови появляется большое количество регенеративных;клетокретикулоцитов, обнаруживаются дегенеративные формы эритроцитов — базофиль745506 нопунктированные эритроциты. Нарушается синтез гема, о чем свидетельствует повышение концентрации Ь -аминолевулиновой кислоты и появление пе р форинов в моче.

Целью изобретения является обеспечение ранней диагностики отравлений тяжелыми металлами..

Поставленная цель достигается тем

I что определяют дазоксирибонуклеинов Ъ) кислоту и при содержании ее 20,689,7 нг в млн. эритроцитов ставят диагноз отравления.

Способ осуществляется следующим .образом.

При определении ранних признаков интоксикации из последуемой крови 15 путем ее очистки и центрифугирования удаляют ядросодержащие клетки и плазму, а из оставшейся эритроцитарной массы вьщеляют дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и по ее количеству су- Щ дят об отравлении тяжелыми металлами, так как в эритроцитах крови здоровых людей дезоксирибонуклеиновая кислота отсутствует. Данная кислота появляется в эритроцитах при необходимости синтеза каких-либо веществ, способных повысить споротивляемость организма токсическому действию металлов. Так, при содержании дезоксири. бонуклеиновой кислоты 20,6-89,7 нг в млн. эритроцитов ставят диагноз отравления.

Пример. Для определения ранних признаков отравления тяжелыми металлами из эритроцитов крови исследуемого лица вьщеляют дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) методом двухволновой спектрофотометрии.

Процесс количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты(ДНК) в эритроцитах состоит из трех основных этапов.

Определяют в эритроцитарной массе суммарное количество нуклеиновых кислот (С нн), т.е. концентрацию

ДНК + PHK.

Затем ко второму диску фильтроваль- ной бумаги добавляют 2 мл смеси

40 1,2 н. раствора хлорной кислоты с

0,05 M хлористого магния и через

20-30 мин фильтруют,. выделяя таким об разом только рибонуклеиновую кислоту (Срн ) .

45 На спектрофотометре замеряют orr тическую плотность фильтрата в кюве-, те 1 см при длине волны 270 нм и

290 нм и проводят расчет концентрации рибонуклеиновой кислоты (С„„„ ) формуле

", 55

C rr,qy --C где С ®вЂ”

С дна

60 п

Определяют в эритроцитарной массе концентрацию рибонуклеиновой кис(Срщ, ) .

По разности концентрации между суммой нуклеиновых кислот (С нк) и концентрацией рибонуклеиновой кислоты (РНК) (Она- Сpw = Сдн ), судят о концентрации дезоксирибонуклеиновой кислоты (Сдн„ ) в эритроцитах.

Кровь из вены берут в охлажденные полиэтиленовые пробирки, содержащие

3,8Ъ-ный раствор цитрата натрия.

Центрифугируют при 1500 об/мин, плазму, лейкоциты и тромбоциты удаляют и еще раз промывают 3,8%-ным раствором цитрата натрия.

Затем количество отмытых эритроцитов подсчитывают в мелажерах в миллионах на один микрометр. После чего 0,09-0,11 мл эритроцитарной массы наносят на два диска фильтровальной бумаги и фиксируют в 10-15 мл смеси 0,2 н. раствора, хлорной кислоты с 0,05 М хлористого магния,в те« чение 10-15 мин при 4-5 С. Смесь сливают и процесс повторяют.

После этого к обеим пробам приливают ацетон в количестве 10-15 мл, нагревают до кипения, ацетон сливают и процесс повторяют еще раз. После того, как слили ацетон, к эритроцитам добавляют 10-15 мл смеси этилового спирта и диэтилового эфира взятых в соотношении 3:1, нагревают до кипения, смесь сливают. Процесс повторяют.

К каждому диску фильтровальной бумаги, содержащему пробы эритроцитарной массы добавляют по 4 мл 0,3 н. раствора едкого калия и проводят гидролиз 50-70;мин при. 36-37 С.

Далее, к одному из дисков прилива-. ют 2 мл 0,5 М раствора хлорной кислоты, гидролизуют 18-22 мин на кипящей водяной бане и выделяют такиМ образом суммарное количество обеих нуклеиновых кислот (С„к), т.е. рибонуклеиновую (СPH„) и дезоксирибонуклеиновую (Сц к ) кислоты, гидролизат охлаждают и фильтруют.

На спектрофотометре замеряют оптическую плотность полученного фильтрата в кювете 1 см при длине волны

270 нм и 290 нм. Проводят расчет концентрации нуклеиновых кислот (Сн ), т.е. Ср „ + Сrrg„, по известной формуле

3264,6Е о-2 уо

С„„= =нГ/млм.

3264 rr a F»

С 270- 290 нк A

w HT/ ËÍ

Срн = Hr/wxH, концентрация обеих нуклеиновых кислот; концентрация рибонуклеиновой кислоты; концентрация дезоксирибонуклеиновой кислоты; количество эритроцитов; разница оптической плотности при длине волны

270 нм и 290 нм.

745506!

Формула изобретения

Составитель Х.Соловьев

Редактор С.Тараненко Техред А. Щепанская Корректор Ю.Макаренко

Заказ 4047/2 Тираж 673 Подписное

ЦНИИПИ .Государственногб комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

У

Так,исследуя кровь человека, имеющего контакт с таллием,, выявляют, что количество эритроцитов

5,6 млн.

Контроль, Е ц> * 0,32 нм..

Еио 0,295 нм дЕ 0,32 нм. — 0,295. нм = 0,025 нм

Опыт.

Е „ 0,37 нм

Ea9o 0,265 нм ьЕ =, 0,37 нм — 0,265 нм = 0,105 нм

E = 0 105 нм - 0,025 .нм = 0,08 нм. Сн =32640,08./ 6, = 46,6 нг/млн

С 9НК С С щк =46 е б нг/млн ° -.

-14,5 нг/млн=32,,1 мг/млн

Следовательно, из эритроцитов крови человека выделяют 31,2. нг/млн. эритроцитов,дезоксирибонуклеиновой кислоты, что говорит о начале таллиевой интоксикации и требует принятия . соответствующих мер по проФилактике 20 для предупреждения нарастания интоксикации.

Таким образом, способ диагностики отравлений. тяжелыми металлами путем определения нуклеиновых кислот в эритроцитах,позволяет выявить ранние прйзнаки интоксикации металла при помощи определения количествен. ного содержания металлами, а также определения количественного содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты в эритроцитах.

Способ диагностики отравлений тяжелыми металлами путем определения нуклеиновых кислот в эритроцитах,. отличающийся тем, что, с целью ранней диагностики, оп-. ределяют дезоксирибонуклеиновую кислоту и при содержании ее 20.,6-89,7 нг в млн. эритроцитов ставят диагноз отравления., Источники янФормации принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

Р 316991, кл. 6 О1 k 33/16, 1974.