Способ электрофореза всвободном потоке co смещениеми устройство для осуществленияэтого способа

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик 1 851246 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 23.04.79 (21) 2759275/18-25 (51)М. Кл.

G 0 l N 27/26 с присоединением заявки М

3Ъвударетвеикм11 кемнтат

СССР ю ююлэм нэвбрвтвкк11 и вткрмтк11 (23) Приоритет (53) УДК 543.544 (088.8) Опубликовано 3О.О6,81, Бюллетень .1тх28

Дата опубликования описания 30.07.81

А.В. Гавркшкин и И.С. Габуев

3 Ф . 6

3 3

Всесоюзный научно-исследовательский институт

/ прикладной микробиологии (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В СВОБОДНОМ ПОТОКЕ

СО СМЕЩЕНИЕМ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к технике разделения частиц, отличакп1ихся по электрофоретической подвижности, и может быть использовано для разделения биологических смесей.

Известен способ электрофореза в

S свободном потоке, заключающийся в том, что текущий слой буфера, ограниченный двумя параллельными плоскостями, с введенной в него струей разделяемой смеси подвергают воздействию постоянного электрического поля. Серповидное искажение полосы фракций, обусловленное параболическим профилем скорости вязкого течения слоя буфера и профилем электроосмотической скорости в слое буфера, компенсируют подбором дзета-потенциала двух параллельных плоскостей, ограничивающих слой буфера.

Устройство для осуществления данного способа содержит проточную прямоугольную камеру разделения, проточные электродные отделения с электродами, изолированными от камеры раз" деления полупроницаемыми мембранами, инжектор для ввода разделяемой смеси, коллектор фракций и источник постоянного электрического напряжеС „ Plj.

Однако этот способ не обеспечивает быстрой компенсации серповидного искажения для каждой фракции, так как для этого требуется подбор и смена дзета-потенциала плоскостей, ограничивающих слой, для получения максимального разрешения только одной фракции.

Известен также способ электрофореза в свободном потоке со смещением заключающийся в том, что текущий слой буфера, ограниченный двумя параллельными плоскостями, с введенной в него струей разделяемой смеси подвергают воздействию постоянного электрического поля. Добавкой в слой буфера электролита, содержащего многовалентные ионы, например, бария, лантана или

8512

46 ф ный направлению потока буфера, и регулируют направление и эффективную напряженность дополнительного электрического поля до получения минимального перекрытия пика выбранной фракции с соседними пиками других фра сций °

Для осуществления предлагаемого способа используют обычные для электрофореза в свободном потоке параметры: стандартный буфер с удельной электропроводностью 5 10 -8 10 Ом см, скорость потока буфера 0,4-1 см/с, толщина слоя 0,5-1 мм, диаметр вводимой в слой струи смеси 0,1-0,5 мм, напряженность электрического поля в слое буфера 40-100 В/см. В качестве пористой среды используют слой толщиной

5-12 мм, изготовленный спеканием порошка материала с размерами частиц

S0-1ОО мкм и дзета-потенциалом

40-100 мВ, например стекла. Эффективную величину тока, протекающего в пористой среде, заполненной буферным раствором, регулируют в пределах

30-120 мА. Разделение и анализ смесей проводят при 4-20 С.

Указанная цель достигается также тем, что в известном устройстве, содержащем проточную камеру разделения, проточные электродные отделения с электродами, изолированными от камеры разделения полупроницаемыми мембранами, инжектор для ввода разделяемой смеси, коллектор фракций, источник постоянного электрического напряжения, блок оптического сканирования фракций в камере разделения, блок фотоприемника, блок регистрации кривой распределения фракций, камера разделения снабжена емкостью с пористой мембраной, емкость соединена с торцами камеры и содержит вспомогательные электродные отделения с электродами, соединенными с отдельным источником постоянного -электрического напряжения или с источником однополярных импульсов напряжения, причем пористая мембрана состоит из актив» ной части, расположенной между вспомогательными электродами, и пассивных частей, расположенных между вспомогательными электродами и электродами камеры разделения. Кроме того, вспоMoraтельные электроды расположены параллельно электродам камеры и отделены от пористой мембраны полупроницаемыми мембранами.

3 тория, изменяют электропроводность слоя, создавая тем самым температурный градиент по толщине слоя буфера.

Изменение параболического профиля скорости течения вследствие темпера5 турного градиента компенсирует сер" повидное искажение полосы фракций, обусловленное параболическим профилем скорости вязкого течения слоя и профилем электроосмотической ско- 1б рости в слое буфера.

Устройство для осуществления известного способа содержит проточную камеру разделения, проточные электродные отделения с электродами, иэо- 15 лированными от камеры разделения полупроницаемыми мембранами, инжектор для ввода разделяемой смеси, коллектор фракций, источник постоянного электрического напряжения, блок оптического сканирования фракций в камере разделения, блок фотоприемника и блок регистрации кривой распределения фрак Н Г21

Недостатком указанного способа яв- д ляется малая разрешающая способность, так как введение в слой буфера добавок электролита, содержащего многовалентные ионы, приводит, во-первых, к

Ф уменьшению. электрофоторетической под- gp вижности частиц разделяемой смеси, во-вторых, к коагуляции частиц, обус" ловленной многовалентныьм ионами добавок, и в-третьих, к уменьшению устойчивости потока слоя буфера к теп- З5 ловой конвекции, обусловленной установлением температурного градиента по толщине слоя.

Цель изобретения — повышение разрешающей способности элЕктрофореза в 4О свободном потоке.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе, включающем воздействие на слой текущего буферного раствора с введенной в него струей 45 разделяемой. смеси постоянного электрического поля, перпендикулярного направлению потока, и сканирование в видимой или ультрафиолетовой области спектра полосы фракций, на кривой 50 распределения фракций выбирают пик отдельной фракции, в слое пористой среды с буферным раствором с помощью дополнительного постоянного электрического поля или однополярных импуль- 55 сов электрического поля создают замкнутый через текущий слой буфера электроосмотический поток, перпендикуляр246 б

- фотоприемника в электрический сигнал, который усиливают и отображают в виде кривой распределения фракций блоком

13 регистрации.

Ламинарный поток слоя буфера через камеру 1 имеет параболический профиль

ДЕГ (фиг.3) вследствие чего частицы отдельных фракций, находящиеся на разном расстоянии от стенок камеры 1, движутся с различными скоростямн и отклоняются в электрическом поле на разные углы. Начальный профиль Ю отдельной фракции трансформируется в кон" це камеры в профиль Ъ, вершина кото- . рого направлена к катоду (для отрицательно заряженных частиц}, и на кривой распределения пнк отдельной фракции имеет вид В (фиг. 3a). Под дейст.вием электрического поля в слое буфера возникает также направленный вдоль поля электроосмотическнй поток (профиль АВС на фиг. 3), который в центре зазора камеры 1 и у стенок имеет взаимно противоположное направление, вследствие чего исходный профиль С6 фракции транспортируется в конце камеры в профиль fb (фиг.Зб ), вершина которого направлена к аноду (для отрицательно заряженных частиц) ° и на кривой распределения пик отдельной фракции имеет вид В (фиг.35) ° Одновременное действие этих потоков приводит к результируницим профилям Г (фиг. ЗЬ), которыми и обусловливается наблюдаемое серповидное искажение полос фракций, вследствие чего происходит перекрывание соседних фракций и на кривой распределения отдельные фракции отображаются в виде ассиметричных пиков ВВ (фиг. ЗЬ), пологая часть которых направлена к аноду нлн катоду s зависимости от соотношения величин скорости потока буфера, скорости электроосмотического переноса ,и электрофоретической скорости частиц.

На электроды 19 подают постоянное напряжение (или однополярные импульсы напряжения) от отдепьного источника 20. В активной части пористой мембраны 16 между электродами 19 возникает электроосмотическнй поток, пропорциональный величинам эффективной напряженности электрического поля и дзета-потенциала материала пористой мембраны Этот поток посредством боковых каналов 14 замыкается через рабочий зазор 2 камеры 1 и создает в ней поперечный ламинарный поток буфе5 851

На фнг. 1 изображено предлагаемое устройство, общий внд; на фиг..2— разрез А-А на фиг.1; на фиг. 3 - профили электроосмотнческого и гидродинамического потоков жидкости через камеру разделения; на фиг. 4 — результаты расчета на ЭВИ.

Устройство содержит прямоугольную проточную камеру 1 разделения с рабочим зазором 2 между двумя плоскопа, 1о раллельными стенками 3 из диэлектрического материала, два электродных отделения 4, изолированных от камеры 1 полупроницаемыми мембранами 5, электроды 6, соединенные с нсточни- tS ком 7 постоянного напряжения, инжектор 8 дпя ввода струи разделяемой смеси частиц иколлектор 9 для отбора фракций в.пробирки 10. В нижней части камеры установлены блок 11 оптическо- 2р го.сканирования и блок 12 фотоприемника, соединенный с блоком 13 регистрации кривой распределения фракций., Через боковые каналы 14 к камере 1 присоединена прямоугольная емкость 15 2S с.пористой мембраной 16. Емкость 15 содержит два электродных отделения 17, изолированных от пористой мембраны полупроницаемыми мембранами 18, и электроды 19, параллельные электродам Зо

6. Электроды 19 присоединены к огдельиому источнику 20 постоянного напряжения (источнику однополярных импульсов напряжения). Сосуд 21 служит для подачи буфера в камеру разделения. М

Устройство работает следующим образом, Заполняют камеру 1 разделения и емкость 15 с пористой мембраной 16 через каналы 14 буфером и непрерывно 4о подают буфер из сосуда 21 в рабочий. зазор 2 камеры 1 разделения. Из инжектора 8 вводят в камеру струю смеси частиц и подают на электроды 6 постоянное напряжение от источника 457 ° В камере 1 разделения устанавли-. вается однородное электрическое поле, направленное поперек потока буфера.

Пад действием поля переносимая пото" ком струя смеси частиц разделяется HaSO ряд фракций, различающихся по электрофоретической подвижности (ЭФП) . Фракции отводят через коллектор 9 и про- бирки 10 н одновременно сканируют в камере разделения в видимой нли SS ультрафиолетовой области спектра блоком 11 ° Прошедший через камеру. световой поток преобразуют блоком .12

8512 ра К1М (фиг.З), который трансформирует серповидные профили У (фиг.3Ь ) соседних фрак 1ий, перемещая их в направлениии, против о положном зле к тр оосмотическому движению частиц. Направление и величину эффективной напряженности электрического поля в пористой мембране 16 регулируют до достижения минимального перекрытия соседних фракций на кривой распределения, 10 наблюдаемой на блоке 13 регистрации, что соответствует максимальному разрешению двух соседних фракций. Для отдельной фракции этот момент соответствует полной симметрии пика фрак- 15 ций на кривой распределения. Часть пористой мембраны между электродами

19 используют в качестве активной электроосмотической мембраны, которая участвует в активном переносе 20 буфера, а другие части, соединенные с боковыми каналами 14, применяют для уменьшения взаимного влияния источ— ников 7 и 20. Для получения равномерного электроосмотического потока по всей длине мембраны электроды 19 устанавливаются параллельно электродам 6. Электроды 19 отделены от пористой мембраны полупроницаемыми мембранами, для того чтобы исключить попадание продуктов электролиза в камеру разделения, П р и м е p . С помощью ЭВИ проводят модельный эксперимент по разделению электрофорезом в свободном по- 3S токе со смещением, смеси двух отрицательно заряженных фракций с электрофоретическими подвижностями

2 мкм.см/В.с и 2,1 MKM ° cM/Âåс при толщине слоя буфера 0,08 см, исходном 40 диаметре струи смеси 0,04 см, напряженности электрического поля 50 В/см, времени разделения 100 с, удельной электропроводности буфера 9 ° 10 Ом см

Электроосмотический перенос в порис- 4> той среде и на границах слоя принимают равным 4 мкм см/В ° с, что соответствует дэета-потенциалу 60 мВ при удельной электропроводности буфера

-1 -1

9 ° 10 Ом см, если пористая среда и плоскости, ограничивающие слой буфера> выполнены из стекла, имеющего отри; цательный заряд. При наложении электрического поля на слой буфера полосы .фракций в нижней части слоя буфера отклоняются к аноду и принимают фор" му серпов А (фиг.4) где на оси абцисссмещение фракций, а по оси ординат—

46 изменение смещения фракций по толщине слоя буфера. Расстояние между фракциями составляет 0,22 см, что достаточно для отбора фракций из слоя буфера, но серповидное искажение приво" дит к перекрыванию полос фракций и уменьшению разрешения.

Исходные профили серпов А рассчитывают по формулам, аналогичным приведенным в известных устройствах.

Электрофоретическое смещение частиц в слое буфера имеет вид

v =Eu (i- )7.ю (1)

К47 Е Кф) где К=0,33 ХЕ ° d - температурный коэф% фициент;

Х " удепьная электропроводность буфера;

U< — электрофоретическая подвижность частицы

Š— напряженность электрическогб поля в слое буфера; — среднее время нахождения частицы в поле.

Смещение частицы в слое буфера, обусловленное электроосмотическим переносом (профиль АВС на фиг. 3), имеет вил х = 1-0 E(<- —,1-ц, <

47 где EU„скорость электроосмотического переноса жидкости около стенки слоя.

Смещение частицы под действием вертикального гидродинамического потока (профиль DEF на фиг. 3) имеет внд

2 ъ л (3) Еое "г<

1Смещение частицы в поперечном потоке буфера в слое за время обуслов- ленное электроосмотическим переносом в пористой среде, имеет вид х =,— Ы (<- — )ь ъ (4) в

4 2 rn сР-) rn i гдетоl „- средняя линейная скорость поперечного потока буфера в слое.

Смещение частицы приведено для частного случая, когда электроосмотический перенос в пористой среде, замкнутый через слой буфера, осуществляют по,всей длине слоя, где проводят разделение. Тогда полное смеще9 851246 10

ice частицы имеет ннд е=Х +Х +Х -Х Устройств разДелениЯ, управляемых н после ряда преобразований получим J с помощью ЭВМ.

Х (— Ч Ю (1+ — — ) --ОЭ + — EU ь ч

5 (Ъ m Ъ

Формула изобретения

Х

4z d - (к Ь u> pz

-EQ i б — (.— х —,Г 4 Р(Р Е + g Ц ) Р е

1. Способ электвофореза в свободном (5) потоке со смещением, включающий воздействие на слой текущего буферного где Х вЂ” горизонтальное смещение час- раствора с введеной в него струей разтицы в электрическом поле. 1б деляемой смеси постоянного эйектричеСЮ

Y кого поля, перпендикулярного направ6 (S) ленню потока, и сканирование в видигде Ч - объемная скорость электроос- мой или ультрафиолетовой области сненмотического переноса; тра, отличающийся тем, S - поперечное сеченйе слоя буфе- 1> что, с целью повышения разрешающей ра. способности, в слое пористой среды с 3 E буферным раствором с помощью дополни 4=-4lvq X (7) тельного по с тоя нного электрического где 3 - ток, протекающий в пористой поля или однополярных импульсов электсреде; 20 рического поля создают замкнутый через

S - дзета-потенциал пористой сре- текущий слой буфера электроосмотичесАОР. дые кий поток, перпендикулярный направле" — вязкость среды; нию потока буфера, и регулируют нап— диэлектрическая постоянная равление и эффективную напряженность среда. дополнительного электрического поля

При этом электроосмотический перенос до получения минимального перекрытия эаьаякается через слой буфера в нап- двух соседних фракций. равлении от анода к катоду и смещает 2. Устройство для осуществления спополосы фракций А в направлении, проти- соба по п.1, содержащее проточную кавоположном электрофоретическому от- ЗО меру разделения, проточные электродклонению, и трансформирует профиль йые отделения с электродами, изолиполос при постепенном увеличении нап- рованными от камеры разделения полуряженности дополнительного электричес- проннцаеиыии мембранаии, инжектор для кого поля (профили В, С,D, Е на фиг.4). ввода разделяемой смеси в проточную

Полная компенсация искажения полос 5 камеру, коллектор фракций, источник фракций с исходным диаметром 0,04 см постоянного электрического напряже, соответствует профилям D . Величина ния, соединенный с электродами, блок тока в пористой среде при этом сос- оптического сканирования фракций в тавляет 60 мА, а линейная скорость камере разделения, блок фотоприемнив слое буфера, обусловленная электро- "О ка, блок регистрации кривой распреосмотическим переносом, — 0,015 см/с. деления фракций, о т л и ч а ю щ еПри проведении модельного эксперимен" е с я тем, что проточная камера pasта величину тока в пористой среде деления снабжена емкостью с пористой изменяют в пределах 20-80 иА. мембраной, емкость соединена с торцами камеры разделения и содержит вспомогательные электродные отделения с электродами, соединенными с отдельным регулируемым источником постоянного напряжения или с источником однополярких импульсов напряжения, причем пористая мембрана состоит из активной части, расположенной между вспомогательными электродамн, и пассивных частей, расположенных между электродами камеры разделения и вспомогательПредлагаемяй способ позволяет повысить разрешающую способность электрофреза в свободном потоке не менее чем в 2 раза по сравнению с известным. Кроме того, предлагаемый способ ииеет воэможность быстрой перестройки от получения максимальной разрешающей способности одной смеси частиц к другой простым изменением напряженности дополнительного электрического поля. Использование предлагаемого способа дает также возможность создания автоматизированных кими электродами.

3. Устройство по п.2, о т л ич а ю щ е е с я .тем, что вспомогаll

12

851246 тельные электроды расположены параллельно электродам камеры разделения.

4. Устройство по п., о т л и— ч а ю щ е е с я тем, что вспомогательные электроды отделены от пористой мембраны полупроницаемыми мембранами °

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Sthr ich1er А., Sacks T;Anna ls

of the New Jork Academy of Sciences

1973, 209, р. 497-514.

2. Патент ФРГ I 2508844, 1976 (прототип).

85! 246

17

° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° . ° е ° ° ° е

° ° е е ° ее ° ° ° ° е е ° ° ° ° ФФ ° е ° eeе е" ° ° °

° ° ° ° ° ° e ° ° ee ФЕ ° ° Е ° Е ° ° Ф ЕФ ° e ° Ф ФЕ. ° ° °

° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° Ф ° ° ° (е ° ° ее °

° Е ° ° ° ° ° Е е ° ° ° ФЕФЕ j °

° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ле e ° ФФ ° ° i ee °

° ° Ф

° e1e °

° -е ° е ° ° ее ° ° ееф е e ° eee e (° eeeе ° ° ° ° е °

° ° ° ° ° ° e Фе ° Ф ° ° ° °

° е ° ° ° Ъ е ° ° ° ° ° (° ° е ° ° ° ее ° °

° ° e ° ° e ° e ° ° ° ° ° ее ° ° ° ° ° Ф ° ° ° ее ° ° ° ° °

° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° Фе ° ° ° ° ° . ° °

Ф Е еел ° ee ° e Фе ° ° е ° °

° ° ° ° ее ° ° ° ° ° ° е ЕЕ ° ° е ° е e ° ° °

° е ° ее

° ° и ° Ф ° е ° s ° ° e, ° ° ° e °

° ° ее ° | e е ° ° е ° e e е °

Е ° ° Еее ° ° ° Е °, е ° ° ° ° °

° ° ° ° ° ° е ° e e ° ° ° ° ee ° °

° ° ° е еее ° ° ° ° ° ° ° ° е ° е ° е ° ° е ° ° ° Ф °

° e ° е е е° eel °

851246

О+ с д

ВНИИПИ Заказ 6342/61 Тираж 907 Подписное

Фнннал ППИ "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4