Способ выделения цитохрома @ из дрожжей

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА .С ИЗ ДРОЖЖБЯ, предусматривающий дез .йнтеррацшо клеагсв( ионообмёнсгую хроматографию на слабокислотных карбог |ксильных катионитахв три стадии и :лиофильное высушивание препарат й, ;О т л и ч а ю tq и и с я тем, что, JC целью упрощения процесса, проводят ;механическую дезинтеграцию клеток при температуре 0-8с, на первой : стадии хроматографир т дезинтеграт, перед второй и третьей стадией элюат разбавляют водой, а перед лиофильным высушиванием полученньш раствор подвергают гельфацьтрации. .

ООЮЭ СОВЕТСКИХ

00UN ЭЮ

РЕСПУБЛИК

SUÄÄ 877934

359ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОР

AO ДЕЛАМ. ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТИРЬГЬЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,(21) 2960220/28-13 (22) 22.07.80 (46) 07.07.83. Бюл:. М 25

:(72) В.М.Ушаков, Е.А.Бесстремянный, С.М.Малей,3.A.Âèåñòóðå и Б..А.Ôèõòå (71) Институт биохимии и физиологии. микроорганизмов AH СССР (53) 577.15.07.(088.8) (56) 1 . Авторское свидетельство СССР

В 275027 кл. С 12 К, 1965. (54)(57) СПОСОБ ВЬЩБЛБНИИ ЦИТОХРОМА

С ИВ ДРОЖЖЕЙ, предусматривающий.дезинтеграцию клеток, ионообменную хроматографию на слабокислотных карбо ксильных катионитах в три стадии и

:лиофильное высушивание препарата, ;отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса,. проводят механическую дезинтеграцию клеток при температуре 0-8 С, на первой .стадии хроматографируют дезинтеграт, ;перед второй и третьей стадией элюат разбавляют водой, а перед лиофильным высушиванием полученный раствор подвергают гельфильтрации. 877934

Изобретение относится к микробно логической промышленности, а именно к способам выделения цитокрома С из дрожжей.

Цитохром С может использоваться

s качестве биохимического реактива, а также как стимулятор дыхания и окис лительного фосфорилирования в бесклеточных системах. Кроме того, препарат может быть весьма перспективным дня применения егo в клинической практике.

Известен способ выделения цитохрома С из дрожжей, предусматривающий дезинтеграцию клеток, конообменную хроматограФию иа ашжбокислот- 35 ных карбоксильнык катконя, рх в три стадии и лиофклькое высушквание препарата f1).

Согласно этому способу клетки дрожжей разрушают этилацетатом и 2р выдерживают в течение 1 ч прн 10 -..

15oÑ. Ýàòåì полученную суспензию . фильтруют, осадок подвергают экстракцки (.HH+)280+ (50% оТ степени насыщения) . Экстракцкю проводят 48.ч при, 10-15,С. Белковый осадок отделяют, а фильтрат дкалкзуют и течение 36 ч. Эатем для получения цитохрома С фнльтрат пропускают через колонку с ионообменной смолой. Элюат Зр подвергают диалиэу к повторной хроматографии с последующим диалиэом.

Полученную фракцию, содержащую цитохром С, концентрируют.на колонке с конообменной смолой, элюцию проводят водньм раствором аммиака и.кон-З5 центрированный раствор цнтохрома С подвергают лиофильной сушке.

Недостатком известного способа является наличие трудоемких и дли.тельных стадий, а именно: экстракции 4р сульфатом аммония, отделения осадка, многократного диыиза. Кроме того, втилацетат - легковоспламеняющееся и токсичное вещество, что затрудняет

его применение в больших .количест- 45 вах.

Цель изобретения - упрмцение процесса., Указанная цель достигается тем, что в способе выделения цктохрома С из дрожжей, предусматривающем дезинтеграцию клеток, ионообменйую хроматографию на слабокислотных карбоксильных катионктах в три стадии и лкофильное высушиванке препарата, проводят механическую дезинтеграцию клеток при 0-8ОС на первой стадки хроматографируют дезинтеграт, передвторой и третьей стадией элюат разбавляют водой, а перед лиофильным высушкванкем раствор подвергают бр гельфильтрации. .Способ осуществляют следующим образом.

Суспензию дрожжевых клеток подвергают механической дезинтегра- б5 ций в дезинтеграторе ФУГ-1 кли экст.« рузионном деэинтеграторе ДКИ-3 при температуре 0-8 С. Полученйый дезинтеграт пропускают через колонку с иоиообменной смолой, белок элю. ируют со смолы буфером, элюат разводят водой и хроматографию пбвторяют, затем еще раэ разбавляют во« дой.и хроматографируют. Полученный раствор подвергают гельфильтрации, для которой могут быть использованы носители на основе декстрана или полиакриламида. . Разбавление элюатов перед коко« обменной хроматографией проводят для снижения ионной силы раствора, чтобы облегчить последующее связывание белка со смолой, а гельфильтрациюддя обессоливанкя раствора. После гельфильтрации раствор лиофильно высушивают. В результате получают препарат, содержание цитохрома С в котором 95%.

П р и и е р 1. К 1 кг сырой биомассы дрожжей СшМЫа vaalida ИБФИ-У

622 добавляют 1 л дистиллированйой воды, размешивают мешалкой до получения гомогенной клеточной суспен-. зик, которую подвергают дезинтеграцки в баллиСтической деэкктеграторе.

ФУГ-1. Режим деэкнтеграцкиг непре.рывная дезинтеграция в течение 1мии, объем дезинтеграцконной камеры260 мл, скорость вращения ротора3000 об/минр абразив - дивинилбен золстирольные.микрошарики (диаметром 250-300 мкй ) в количестве 150 мн насыпного объема, температуре в дезинтеграционной камере 4 С. Полученный дезинтеграт пропускают через ко» лонку (размером 22 «150 мм ), заполненную катконитом KPK-1-5п.

Препарат катнокита используют в (Н+)- форме, уравновешенной 0,125 И аммонийнофосфатным буфером рН 7 скорость пропускания дезинтеграта поддерживают на уровне 10 мн/мик.

После прохождения дезинтеграта через колонку последнюю промывают 2 л дистиллированной воды, затем проводят элюцию 0,25 М аммонкйнофосфатным буфером рН 7. Полученный элюат разбавляют в 3 раза дистиллированкой водой и такой раствор пропускают через новую колонку с катионктом

KPK-1-5п. Описанный процесс моно» обменной хроматографии повторяют.

Полученный элюат подвергают гельфильтрации на колонке(100«1000 ма) заполненной обводнения препаратом гранул акрилекса П-4, после. чего белковую фракцию; содержащую цитохром С, -подвергают лиофильному высушиванию.

Выход препарата цитохрома С составляет 280 мг ка 1 кг сырой биомассы.

87793 4

Составитель Т.Мелентьева

Редактор О.Филиппова Техред М.Кузьма Корректор И.Ватрушкина

Заказ 6368/1 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-Э5, Раушская йаб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент",. г. ужгород, ул. Проектная, 4

Чистота препарата по данным . спектрофотометрии и диск-электрофореза в полиакриламидном геле составляет 95%.

П .р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но ионообменную хроматографию проводят при 8 С, используя в качестве носителя гранулированный пористый слабокислотный карбоксильный катионит Лмберлит

1ВС-50; в качестве гельфильтрующего материала используют сефадекс 0-25.

Выход препарата цитохрома С 271.на 1 кг сырой биомассы.

Пример 3. К 1 кг сырой биомассы дрожжей Csndids valids ИВФМ-Y622 добавляют 1 л дистиллированной воды, размешивают мешалкой до получения гомогенной клеточной взвеси и такую взвесь подвергают механической дезинтеграции в экструзнонном деэинтеграторе ДКМ-З.

Параметры дезинтеграции: непрерывная дезинтеграция; производительность - 1 л в час, давление в и деэинтеграционной камере - 3200 кг/см температура в деэинтеграционной камере 0-8оС

Далее способ осуществляют, как описано в примере 1. Выход цнтохрома

С составляет .255 мг на 1 кг сырой

10 .биомассы. Чистота препарата по дан- ньм спектрофотометрии и диск-злектрофореза в полиакриламндном геле составляет 95%.

)5 Описанный способ выделения цитохрома С из дрожжей позволяет упростить процесс выделения и сократить . время его проведения более, чем в три раза При этом получают препа20: рат цитохрома С с большим выходом и высокой степенью чистоты.