Способ очистки дрожжевой гексокиназы

 

Союз Советскик

Социалистическим

Республик (ii>874754 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлемо 011079 (21) 2825641/23-04 (51)М. Кл.з с присоединением заявки Мо. С 12 N 9 /00

С 12 М 9/12

С 12 М 1/16

Государственный комитет

СССР но делам изобретений н открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 231081 Ькзллетень ЙЯ 39

Дата опубликования описания 231081 (53) УДК 577.15..07 (088.8) В.С.Травкина, О.Ф.Суджювене, И-Г..И.Песл ффр„"„., В.С.Веса и A-С.A.Ãëåìæe,, " :4;.

» ».

f »

»" (»" 1»»,4 !

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (72) Авторы изобретеиия (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ДРОЖЖЕВОЙ ГЕКСОКИНАЗЫ

Изобретение относится к области препаративной энэимологии, а именно к способам очистки дрожжевой гексокиназы, которая используется в качестве аналитического реактива для определения содерЖания гексоз и аденоэинтрифосфата в биологических жидкостях в медицинской практике. Препараты дрожжевой гексокиназы широко используются в различных областях науки.

Наряду с классическими методами выделения и очистки дрожжевой гексокиназы, являющимися трудоемкими и многостадийными, известны .единичные 15 случаи применения методики биеспецифической хроматографии ).1) .

Однако известные способы очистки, основанные на биоспецифической.хроматографии, в большей степени демон- 20 стрируют принципиальную возможность создания биоспецифических сорбентов дрожжевой гексокинаэы, ибо практические возможности использования.аф» финных сорбентов для очистки данного 25 фермента сильно затруднены иэ-за сложности и дороговизны их синтеза и низкой рабочей стабильности.

Известен также способ очистки дрожжевой гексокиназы, включающий 39 обработку дрожжевого экстракта 0,1 М раствором (МН4)1 504, выдерживание смеси в течение 16 ч с последующим центрифугированием, пропусканием полученного экстракта через колонку с сефадексом Г-25, вымыванием,фермента буферным раствором 10 мМ малеиновой кислоты — МаОН с последующим пропусканием элюата фермента поочередно через колонки с дуолитом

A-2, КМ-целлюлозой и фосфорилметилцеллюлозой, прибавлением к элюату

0,05-кратного количества 1М триэтаноламин-НС1 буферного раствора (рН 7,5), подщелачивания 5 М NaOH до рН 7,5 с последующим пропусканием элюата через колонку с ДЭАЭ-целлюлоз- ной,десорбции фермента 150 мМ триэтаноламин-НС1 буферным раствороМ (pH 7,5)и выделением из злюата фермента 2).

Однако процесс очистки фермента является многостадийным и трудоемким, включающим многократные операции хроматографии через целый ряд . ионообменных материалов различного типа.

Основой известного способа очистки фермента является использование в качестве сорбента водонераствори874754 мых производных фосфорной кислоты, фосфат или фосфорилметилцеллюлоз.

Однако дрожжевая гексокиназа на данном сорбенте практически не задерживается как это подтверждено данными способа (3) .

Кроме того, выход очищенного фермента после всех стадий его выделения и очистки является крайне низким, так как из 10,0 кг дрожжей получают лишь 0,2 фермента с удельной активностью 300-330 ед/мг белка. Этот фактор, наряду с трудоемкостью всей схемы очистки фермента, сказывается на дороговизне получаемого фермента.

Цель изобретения — упрощение процесса очистки фермента, сокращение 15 его продолжительности и повышение выхода фермента.

Поставленная цель достигается пу-. тем хроматографии ферментсодержащего раствора на сорбенте, представляющем 20 собой комплекс фосфатцеллюлозы с ионами Сг с концентрацией последних

200-800 мкМ/г сорбента, причем сорбцию проводят с помощью 4-6 мМ сукцинатного буферного раствора с рН

5,8-6,0 или 25-50 мМ боратного буферного раствора с рН 7,5-7,7, содержащих 0,1 -0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), а десорбцию проводят соответственно градиентом хлористого натрия от 0,001-0,005 до 0,45-0,5 М в исходном сукционатном буфере или градиентом янтарной кислоты от 0,01-0,05 M до 0,045-0,05 M в исходном боратном буферном растворе.

В качестве ферментосодержащего раствора обычно используют автолизат высушенных пекарских дрожжей, или препарат фермента, полученный после автолиза пекарских дрожжей и фракцио- 40 нирования сульфатом аммония, или препарат фермента, полученный после автолиза дрожжей и хроматографии через ДЭАЭ-целлюлозу.

Существенными отличиямИ способа являются условия хроматографии фермента: природа и характеристики используемого сорбента, природа буферных растворов.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в том, что вместо многократного поочередного хроматографирования на различных типах сорбентов проводят один цикл хроматографической очистки, что значительно упрощает процесс очистки, сокращает его продолжительность и, кроме того, приводит к повышению выхода фермента.

Механизм сорбционной очистки, лежащий в основе предлагаемого способа, основан на том, что ионы Cr, вводи- ц мые в фосфатцеллюлоэу, являются эффективными сорбционными центрами фермента, способствующими достаточно ,селективному его удерживанию, что

:выражается в эффективной очистке 5 препаратов гексокиназы, включая начальные дрожжевые автолизаты и базовые препараты фермента. Степень очистки фермента за один хроматографический цикл составляет в среднем

10-15 раз с выходом активного фермента 50-90%, Для осуществления способа очистки дрожжевой гексокиназы используют лабораторную аппаратуру для получения, сорбента, хроматографические колонки, спектрофотометр СФ-16, комплектную хроматографическую аппаратуру.

В качестве материалов используют фасфатцеллюлозу (производства Олайнского завода химреактивов) с аналитической емкостью 0,7-1,1 мг-экв/г

ДЭАЭ и фосфатцеллюлозу фирмы "Ватман" (Великобритания), прессованные пекарские дрожжи ГОСТ 171-69 производства Паневежеского опытного спиртового завода, базовый препарат дрожжевой.гексокиназы удельной активностью 30-40 ед/мг фирмы "Флука" (Швейцария), Сг2(С04)3 6H 10, янтарную, уксусную и борную кислоты, натрий уксуснокислый, натрий тетраборнокислый и натрий хлористый.

Пример 1. Получение сорбента. В круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, вводят

5,0 r сульфата хрома (ill) Cr1(SO<)>x х6Н10 800 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора рН 5,6 и 10,0 r фосфатцеллюлозы(ОЗХР). Содержимое колбы перемешивают в течение 20-24 ч.

По окончании реакции сорбент отфильтровывают, промывают водой, 0,1 М раствором янтарной кислоты для удаления избыточного хрома (ill) .

Концентрацию ионов хрома (10) в сорбенте определяют из разницы его концентраций в начальном растворе и растворе после зарядки фосфатцеллюлоэы спектрофотометрически с этилендиаминотетрауксусной кислотой ЭДТА при 525 нм (4).

Пример 2. Очистка дрожжевой гексокиназы . а) 2,0 г комплекса фосфатцеллюлозы с ионами хрома (ш ) загружают в хроматографическую колонку (1x20 cM), уравновешивают 5 мМ сукцинатным буферным раствором рН 6,0, содержащим 0,5 мМ ЭДТА и наносят 4,0 мг ферментного раствора дрожжевой гексокиназы фирмы "Флука". Концентрация белка 1,45 мг/мл, удельная активность 28,0 ед/мг белка. При элюции 330 мл исходного буферного раствора рН 6,0 вымываются балластные белки. Элюирование активной гексокиназы проводят градиентом хлористого натрия от 0,005 до 0,25 М в сукци-. натном буферном растворе рН 6,0.

Удельная активность гексокинаэы после десорбции 300 ед/мг белка.

Выход по активности 90Ъ. 874754

Формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 9260/43

Тираж 531 Подписное

Филиал ППП Патент, r.Óæãîðîä, ул.Проектная,4 б) 2,0 r сорбента загружают в хрОматографическую колонку (1х20 см), уравновешивают 5 мМ сукцинатным буферным раствором рН 6,0, содержащим

0,5 мМ ЭДТА и наносят 5,0 мл ферментного препарата, полученного после ,двухчасового автолиза при 37 С суспензии 1,8 г пекарских дрожжей в 5 мл 0,2 М Ма2НРО с 0,5 мМ ЭДТА и последующего диализа против исходного буферного раствора рН 6,0. КонI центрация белка составляет 9,6 мг/мл, удельная активность 4,6 ед/мг белка.

При элюции 340 мл сукцинатного буферного раствора рН 6,0 вымываются балластные белки. Элюирование гескокиназы проводят градиентом хлористого натрия от 0,005 до 0,5 М в исходном буферном растворе рН 6,0. Удельная активность гексокиназа после десорбции 42 ед/мг белка. Выход по активности 61Ъ. 20 в) В хроматографическую колонку, заполненную сорбентогл по примерам

2(а-б), уравновешенную 50 мМ боратным буферным раствором рН 7,6, содер- жащим 0,5 мМ ЭДТА, наносят 3,5 мл 25 базового препарата дрожжевой гексокиназы, полученного после автолиза

1,6 г высушенных пекарских дрожжей в течение 2-х ч при 37 С в 5 мл 0,2 M

Йа1НР04.и хроматографической очистки 30 на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Концентрация белка, 0,98 мг/мл, удельная активность 23 ед/мг белка. При элюции

200 мл боратного буферного раствора рН 7,6 вымываются балластные белки. у5

Активная гексокиназа элюируется при повышении концентрации янтарной кисло-. ты от 0,01 до 0,05 M в исходном боратном растворе рН 7,6. Удельная активность гексокиназы 300 ед/мг белка.

Выход по активности не ниже 50%.

2) В хроматографическую колонку, как в примере 2 в, уравновешенную

50 мМ боратным буферным раствором рН

7,6, наносят 3,5 мл ферментного препарата гексокиназы фирмы "Флука". Кон- 45 центрация белка 2,0 мг/мл, удельная активность 31 ед/мг белка. При элю-. ции 50 мл исходного буферного раствора рН 7,6 вымываются балластные белки. Активная гексокиназа десорби- 50 руется градиентом янтарной кислоты от 1 до 50 мМ в исходном буферном растворе рН 7,6. Удельная активность десорбированного фермента составляет

990 ед/мг белка с выходом по актив- 55 ности 75Ъ.

Влияние ионов хрома (1и) на сорбцию дрожжевой гексокиназы определено путем сравнительной хроматографии на фосфатцеллюлозе (03XP и "Ватман" ) и ее комплексе с ионами Сг 0Н1 в идентичных хроматографических условиях.

Во всех случаях, независимо от используемого буферного раствора, дрожжевая гексокиназа на фосфатцеллюлозе фирмы "Ватман" не задерживается и выходит со свободным объемом волокон без какого-либо эффекта очистки фермента.

На фосфатцеллюлозе ОЗХР наблюдает" ся незначительное взаимодействие фермента, однако он удерживается слабо и эффект очистки фермента практически отсутствует.

1. Способ очистки дрожжевой гексокиназы путем хроматографии, ферментсодержащего раствора, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения, сокращения длительности процесса и повышения выхода целевого продукта, хроматографию ведут на сорбенте, в качестве которого используют комплекс фосфат целлюлозы с ионами

Сг+ при концентрации последних 200800 мкм/г сорбента, сорбцию осуществляют с помощью 4-6 мМ сукцинатного буферного .раствора с рН 5,8-6,0 или

25-50 мМ боратного буферного раствора с рН 7,5-7,7 содержащих 0,1-0,5мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, а десорбцию проводят соответственно градиентом хлористого натрия от 0,0010,05 до 0,45-0,5 M в исходном сукцинатном буферном растворе или градиентом янтарной кислоты от 0,0010,005 до 0,045-0,05 М в исходном боратном буферном растворе.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что, в качестве ферментсодержашего pacòâîðà используют автолизат высушенных пекарских дрожжей или препарат фермента, полученный после автолиза пекарских дрожжей и фракционирования сульфатом аммония, или препарат фермента, полученный после автолиза дрожжей и хроматографии через диэтиламиноэтилцеллюлозу..

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.С.У.Lee, L.Í.Lazarus, В.S.Kabakoff е tal., Arch. Biochem. Biophys, 1977, 178, 8.

2. Патент Японии Р 49-43155,. кл. С 07 G 7/02, 1974.(прототип).

3. 3.Takagahara, Y.Suzuki,,Т.Fuji"

ta eta1, "Success че PuriН cation

of Several Enzymes Having Afflni

ties for Phosphorie Groups of Substrafes by Affinity Chromafoqraphy on

P-Се 1lu lose", J Вiochem, 1978, 4. Коренман И.М. "Фотометрйческий анализ". M., "Химия", 1975, 260-262.