Способ получения сорбента для выделения и очистки сериновых протеаз
ОП ИСАНИЕ изоьеитиния
Союз Советски к
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6! ) Дсчолнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 0 1.06.77 (21) 2490497/23-04 с присоединением заявки J% (23) Приоритет Опубликовано 15.03.80. Бюллетень .% 10 Дата опубликования описания 17 p3 80 (sE)le. Кл. С 07 С 7/02// А 61 К 37/48 Всударстнвннмй комитет СССР ав данам изобретений н открытий (53) УДК 577. 15. .02.07 (088.8) (72) Авторы изобретения В. Г. Бендикене, И.— Г.И. Песлякас, В. И. Палубинскас, В. С. Веса и А-С.А. Глемжа Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энэимологии (7I ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ Изобретение относится к области микробиологической промышленности, преимушестве нно к обл асти энэи мологин, к решению важного с точки практического использования вопроса — получения . высокоочишенных и гомогенных сериновых протеаэ. Для выделения и очистки сериновых протеаз известен ряд ионообменных и аффинных сорбентов. Из ионообменных сорбентов в схемах выделения и очистки сериновых протеаз чаще всего используют ионообменные целлюлозы, которые получают после соответствующей химической модификации целлюлозы. OQHBKo сорбенты данного типа обладают рядом существенных недостатков: низкой степенью селективности по отношению к опрецеленному классу ферментов, низкой эффективностью очистки, при этом используются ферментные препараты, предварительно очищенные традиционными классическими методами 11) . Более эффективным методом вьщеления и очистки ферментов является метод аффинной хроматографии с использованием биоспецифнческих сорбентов, избиратель5 -но взаимодействующих с определенным ферментом. Однако возможность применения таких сорбентов в препаративных и промышленных масштабах ограничивается или полностью исключается 16 из-за дороговизны их получения и низкой устойчивости к механическим, химическим и микробиологическим воздействиям (2). Прототипом изобретения является способ получения сорбента для выделения и очиСтки сериновых протеаз, заключающийся в том, что природный полисахарид-сефарозу 4В, предварительно активированную бромцианом, химически связывают с ингибитором микробного происхождения $3) . Недостатками известного способа являются низкая селективность сорбции сериковых протеаз, малая доступность 3 72144 исходного сырья (сефарозы и микробные ингибиторы сериновых протеаз в Совет ском Союзе не производятся), многостадийность приготовления сорбента. Целью изобретения является увеличение .селективности сорбции сериковых протеаз. Поставленная цель достигается путем использования природного полисахарида-хитина, который после предварительного измельчения деминерализуют tO 3-6 н. НС ; и отмывают водой. Предлагается способ получения сорбента для выделения и очистки сериновых протеаз, заключающийся в том, что природный полисахарид-хитин измельчают, 15 отбирают фракцию с диаметром частиц 0,3-0,4 мм, обрабатывают 3 6 н, НС1 и промывают водой до нейтрального значения рН. Иля приготовления сорбента предЛа- 20 гаемым способом употребляют широкораспространенный природный хитин. В Советском Союзе хитин получают в больших количествах как отход производства, до настоящего веремени он не находил широкого практического применения. Полученный сорбент является стабильным как механически, так и химически. На нем можно проводить неограниченное число операций очистки сериновых протеаз. При очистке сериновых протеаз на сорбенте, приготовленном согласно изобретению, удельная протеолитическая активность сериновых протеаз иэ Вас. su Щ1в увеличивается 4-5 раза, а активность сК -химотрипсина и трипсина— в 2-2,5 раза за одну операцию сорбциидесорбции. Благоцаря легкой доступности хитина, простоте приготовления и долговечности в работе сорбента и благодаря достигаемому положительному эффекту при его использовании предлагаемый способ является перспективным, дешевым для применения в крупномасштабном производстве. Предлагаемый способ приготовления хитина позволяет повысить сорбционную емкость сериновых протеаэ, при этом удельная активность сериковых протеаз за одну стадию сорбции-десорбции повышается в 4-5 раз. Выходы по белку и активности составляют 80-100%. По сущности процесса сорбции сериковых протеаз приготовленный предлагае. мым способом хитин является аффинным сор 6ентом. 9 4 Пример 1. Обработка хитина. Хитин (ч.МРТУ 6-09-5 113-68) измельчают, просеивают через набор сит, отбирают фракции с размером частиц 0,3 мм, обрабатывают при комнатной температуре 6 í. НС9 до прекращения выделения СО„.:, перемешивая механической мешалкой. Смесь фильтруют через стеклянный фильтр, промывают 6 н. НС, а затем многократно дистиллированной водой, теплыми (50 С) 1%-ными растворами NaC(и СН СООН, дистиллированной водой. Пример 2. Выделение и очистка микробных сериновых протеаз. 6 г хитина, приготовленного, KBK описано в примере 1, загружают в колонку (1,5х20 см), уравновешенную 0,01М универсальным буфером рН 7,5, и наносят 4 мл раствора ферментного препарата протосубтилина Г10х, полученного из Вас. su>ti(is в том же буфере рН 7,5. Концентрация белка 3,0 мг/мл, общая удельная протеолитическая активность 1,3 ед/мг белка при рН 7,5 и 0,625 ед/мг белка при рН 9,5 (активность сериновых протеаз соответственно 0,24 ед/мг белка при .рН 7,5 и 0,22 ед/мг белка при рН 9,5). Протеолитическую активность во всех случаях определяют модифицированным методом Ансона; Активность сериновых протеаз ,Roc sug При элюции 100 мл указанного буфера вымываются металлопротеазы, про40 теолитически неактивные белки и красящие вещества. Сериновые протеазы элюируются при повышении ионной силы линейным градиентом х.юристого натрия от 0,0 1 до 1,ОМ (по .100 мл) в том 45 же буфере рН 7,5. Удельная протеолитическая активность сериновых протеаз после элюции — 1,28 ea/Mã белка при рН 7,5 и 1,12 едlмг белка при рН 9,5. Пример 3. Выделение и очистка сериновых протеаз животного происхождения. 2 мл раствора о(-химотрипсина (марка А, ТУ 6-09-646-7 1, Олайнский завод химреактивов) в 0,0 1 M универсальном буфере рН 7,5, содержащего 34 мгlмл белка с удельной протеолитической. активностью по казеинату натрия 1.4 ед/мг белка, наносят на колонку, 721449 6 Формула изобретения 5 описанную в примере 2. При элюции 150 мл указанного буфера вымываются протеолитически неактивные белки, K -Химотрипсин элюируется при повышении ионной силы элюирующего раствора, аналогично примеру 2 в том же буфере рН 7,5. Удельная протеолитнческая активность Ос -химотрипсина после элюции 2,7 едlмг белка. Пример 4. 4 мл раствора трип- 10 сина (марка В,,Олайнский завод химреактивов) в 0,0 1 M универсальном буфере рН 7,5 наносят на колонку, описанную в примере 2. Концентрация белка 18 мгlмл, удельная протеолитическая активность трипсина по казеинату натрия 0,9 ед/мг белка. При элюции 150 мл указанного буфера вымываются протеолитически неактивные белки. Трипсин элюируется при повышении ионной силы элюи- о рующего раствора аналогично примеру 2 в том же буфере рН 7,5. Удельная протеолитическая активность трипсина после элюции — 2,1 ед/мг белка. Способ получения сорбента для выделения и очистки сериновых протеаз на основе природного полисахарида, о т— личаюшийся тем,что,сцелью увеличения селективности сорбции; природный полисахарид — хнтин измельчают, отбирают фракцию с диаметром частиц 0,3-0,4 мм, обрабатывают 3-6 н. соляной кислотой с последующим промыванием водой до нейтрального значения рН. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент СШЛ Мв 3331751, кл. 195-62, опублик. 1967. 2 Lave С.A.,Dean Р.Э.G. Affinity сЬ о otography, Londo 134, 19 74. 3 8 Sato S.Murao Preparation of bnщоЪЖиео Рго1еаве Ь ibitor (5-М) аой сфрСiсобоп to Ensvme ouré Äôr. Biol. Cgern 39.2. 415, 1975 (пРототипg ° Составитель Г. Коннова Редактор Е. Хорина Техред О. Легеза Корректор М. Демчик Заказ 77/21 Тираж 495 Подписное ЫНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4 5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
