2, 4, 6-т риметил-5-ок сипиримидина в качестве средства, обладающего иммунодепрессивным действием. Были проведены исследования на мышах и морских свинках. При парентеральном введении средства обоим видам животных в дозах от 50 до 2000 мг/кг веса гибель- их отмечалась лишь начиная с дозы 1000 мг/кг.

Иммунобиологические свойства средства изучены на модели одновременного определения лимфотоксического и митостатического действия в реакции гиперчувствительности замедленного типа и реакции бласттрансформации, кроме того, изучено влияние средства на количество клеток, .ответственных за выработку антител и титры гемагглютининов при первичном и вторичном ответе.

Пример 1. Исследования митостатического и лимфотоксического действия ОПМ-Ш.

Избирательное митостатическое и лимфотокснческое действие сред10 ства изучено на экспериментальной модели для одновременного их определения, основанной на реакции "трансплантат вЂ” против хозяина" и оценено по количеству колониеобразующих

3S клеток (КОЕ) в селезенке мышей после однократного внутрибрюшинного введения препарата в дозах 50, 100, 250 и 500 мг/кг веса. Препарат

ja разводят раствором Хенкса при нагревании до 50 С, рН раствора доводят до 7,2-7,41.

Митостатический и лимфотоксический эффект средства показан в табл.1 °

933096

Таблица 1

Митостатическии эффект

Доза пре парата, мг/кг

Количество живот

Среднее чис ло эндогенных капоний на селе

Среднее число

Количество

Лимфотоксив ческий эффект (7 выживэ ндогенных ко лонний животных ных зенку после введения препарата на селеших э н» зенку мышей после догенных колонний) введения

10 лимфоцитов

26 (1 7-38)

24 (14-39)

24(16-35)

25(18-36)

22(l)-24) 3 (0-10) 40

Митостатический эффект оч сут с твует

100

250

500

Из таблицы видно, что введение препарата в дозах от 50 до 500 мг/кг не оказывает митостатического действия, т.е. не влияет на размножение эндогенных стволовых клеток.

Избиратепьное лимфотоксическое дей- ствие средства, приводящее к отмене кванинактивации стволовых клеенок, отмечается .во всех исследованных дозах. При 50 мг/кг количество выживших КОЕ составляет 277. Наибольший лимфотоксический эффект наблюдается при 250 мг/кг (46K КОЕ).

Дальнейшее увеличение дозы .;до

500 мг/кг не приводит к увеличению

КОЕ в селезенке. У. контрольных животных количество КОЕ около 10%.

Полученные результаты показывают, ! что средство в исследуемых дозах обладает выраженным лимфотоксическим действием. Митостатический эффект препарата не наблюдается, что указывает на отсутствие угнетающего действия на костный мозг.

П р и и е р 2. Влияние средства на реакцию гиперчувствительности замедленного типа.

Морских свинок (4 группы по 5 в каждой) сенсибилизируют динитрохпорбензолом ДНХБ нанесением и выбиранием в выстриженные участки кожи спины по 1 капле 57. и 50Х раствора. Средство вводят в подушечки лап в дозе 250 мг/кг по следующим схемам: 1 группа вЂ” одновременно с

7 (6-13) 40 27

8(3-16) 40 31

12(7-28) 40 46

11(7-17) 40 42 сенсибилизациеи и в последующие

2 дня однократно, 2 группа вЂ” за день, в день и через день сенсибилизации, 3 группа вЂ” за два дня, за день и в день перед разрешающей

30 дозой ДНХБ 4 группа - контрольные сенсибилизированные животные, не получающие препарат.

Спустя 21 день наносят разрешающую дозу ДНХБ (1:2500, 1:1000,1:500, .1:250) и через 18-24 ч оценивают реакцию гиперчувствительности замедленного типа РГЗТ по кожным реакциям (гиперемии инфильтрации, болезненности, шелушению кожи).

При нанесении сенсибилизирующей дозы ДНХБ в контрольной группе животных отмечалось резко положительная кожная реакция с болезненностью, отечностью, гиперемией, инфильтратами. В последующие дни появляется шелушение эпидермиса и струп в местах нанесения ДНХБ. При выделении средства кожные реакции отличаются более слабой интенсивностью (или отсутствием реакций) и спектром проявления (отсутствие болезненности, быстрее исчезала гиперемия, инфиль"траты были меньших размеров) ° Разрешающие дозы ДНХБ через 24 ч вызывают у животных контрольной груп55 пы отечность, болезненность, гиперемию при всех разведениях. У жи-. вотных получавших средство до сенсибилизации (2,группа), а также до

5 разрешающих доз ДНХБ (3 группа) только в разведении 1:250, 1:500 отмечалась .слабая гиперемия. При введении средства одновременно или . после сенсибилизации,() группа 3 реакция на разрешающие дозы ДНХБ более выражена и наблюдается даже в разведении 1:1000 и 1:2500.

Полученные данные показывают, что средство тормозит развитие РГЗТ, причем более выражено при введении препарата до сенсибилизации.

Пример 3. Влияние ОПМ-I l I на количество антителосинтезирующих клеток 4 AOK) и титры гемагглютининов на пике первичного и вторичного отв та изучено у иппей линии СВА, иммунизированных внутрибрюшинно

2 10 8 эритроцитами барана. Препарат вводят однократно в дозе 50, 100, 933096 6

250 и 500 мг/кг веса за день иммунизации, а также в дозе 250 мг(кг ,по следующим схемам: I вЂ” в день, через день, через 2 дня и через 3 дня

S после первичной иммунизации и Пза 3 дня, за 2 дня за день и в день перед второй иммунизацией, проведенной через 14 дней после ервичной. Количество АОК в селезенке ма шей определяют модифицированным методом локального гемолиэа на 3-й и 4-й дни после иммунизации. Количество зон гемолиза рассчитывают на

I 0< ядросодержащих клеток. Уровень антител оценивают н реакции гемаге- глюти нации .

В табл. 2 локаэано количество АОК в селезенке мышей при первичном и вторичном ответе после однократ20 ного введения ОПМ-I I I. !

Первичный ответ 30

250

500

Вторичный ответ 20

100

250

500

После однократного внутрибрюшии". ного введения препарата за день до первичной иммунизации юппей незначительно снижается количество

АОК в селезенке даже в дозах 250 и 500 мг/кг.

Введение препарата в день иммунизации и последующие 3 дня в дозе

250 мг/кг также оказывает слабый эффект на количество AOK при первичнбм ответе. Более выраженное дей-. ствие препарата на количество AOK

280+20,8

249+30,4

195+25;6

178+27, 4

1080+80,4

904+91,5

793+85, 5

130+29 8

109+15 3 отмечается при вторичном ответе.

Так уже при однократном парентеS0 ральном введении препарата в дозах

250 и 500 мг/кг за день до повторной иммунизации число АОК уменыпается на порядок по сравнению с контролем, Эффект препарата при вторичном ответе также выражен при многократном введении.

Титры гемагглютининов с сыворотке крови животных при первичном и вторичном ответе оценены на 4 день

933096

Первичный ответ

288+35,2

20 за день до иммунизации 25

202+28,0

За 3,2, ы 1 дни до иммунизации и в день иммунизации

280+41,8

1080+153,0

Вт ор ичный от ве т за день до имму ниэ ации 20

920+1 l 3, 2

За32и! дни до иммунизации и в день иммунизации

480+61,4

20 после иммунизации. Средство вводят однократно в дозе 250 мг/кг за

24 ч до иммунизации.

При первичном ответе введение препарата практически не снижапо количество антител (титр в контроле

1:320, в опытной группе l:1601:320), при вторичном ответе влияПроведенные ис сл едов ануя показывают, что новое средство обладает, ингибирующим действием на клеточно40 опосредованные иммунные реакции беэ супрессии образования антител.

Средство обладает лимфотоксическим эффектом во всех исследованных дозах (от 50 до 500 мг/кг1, наиболь45 ший эффект отмечается в дозе 250 мг/кг (467. выживших КОЕ). При сравнении с известными иммунодепрессантами аналогичное действие отмечено у гидрокортизона при введении 10 мг/кг (44% выживших КОЕ). При введе50 нии животным 25 мг/кг гидрокортизоиа и выше быстро нарастает цитотоксичность препарата. Введение

5 мг/кг резко снижает избирательное лимфотокснческое деиствие, т.е. гид55

Ъ рокортизон обладает малой широтой специфического лимфотоксического действия. ние препарата на гуморальный ответне отмечается, тирты гемагглютининов такие же, как в контрольной группе.

Влияние ОПИ-ill на количества

АОК в селезенке мьппей в зависимости от схемы введения показано в табл. 3.

Предлагаемое средство малотоксично (не обладает митостатическим действием в дозах от 50 до 500 мг/кг не влияет на клетки костного мозга и при этом обладает относительно высокой широтной избирательного лимфотоксического действия. Это является преимуществом перед используемыми в клинике иммунодепрессантами в том числе и глюкокортикоидами.

Препарат тормозит развитие РГЗТ при сенсибияизации морских свинок ДНХВ.

Предлагаемое средство обладает преимущественным действием на клеточно-опосредованные реакции бласттрансформации, РБГ, РНЗТ, Слимфотоксический эффект), зависящие не столько от дозы препарата, сколько от схемы введения. Наибольшее ингибирующее действие препарат оказывает при многократном введении, начатом

9 9330 до антигенного стимула (иммунизации, введения митогенов, сенсибилиэации).

Снижение количества антителопродуцирующих клеток отмечается главным образом при вторичном ответе. Титры антител при разных схемах введения препарата не снижаются по сравнению с контрольной группой. С увеличением дозы (до 500 мг/кг) иммунодепрессивный эффект не возрастает, !О а даже снижается. В исследованных дозах препарат не обладает цитотоксическим действием. Антипролиферативный эффект in vitro также выражен относительно слабо (концентра- 1S ции препарата 100 и 250 мкг/мл ин гибируют включение НЗ-тимидина в

ДНК на 7 и 18 соответственно, а

500 мкг/мл на 35, т.е. средство ока-. зывает слабое влияние на популяцию щ

Т-клеток-супрессоров). В то же время малые дозы препарата (50 мкг/мл) обладают стимулирун"» лм дейСтвием.

Полученные данные r,ðè сравнительном . изучении антипролиферативной активности глюкокортикоидов показали, что они значительно ингибируют синтез

ДНК в лимфоцитах периферической крови человека в зависимости от дозы.

96 10

Так гидрокортизон и презнизолон в концентрации 0,5 мкг/мл включение Н -тимидина s ДНК на 40-50Х по отношению к контролю, принятому за lOOX урбазон на 60-70 в концентрации 10 мкг/мл вЂ” на 50, 70 и 90 соответственно. Все препараты в концентрации 50 мкг/мл практически подавляют синтез ДНК, проявляя цитотоксический эффект.

Средство обладает малой токсичностью, оказывает избирательное действие на клеточно-опосредованные иммунные реакции без подавления гуморального иммунитета и костномозгового кроветворения. Применение

2,4,6-триметил-5-оксипиримидина в качестве иммунодепрессивного средства может быть использовано в медицине при аутоимунных заболеваниях и при трансплантации органов и тканей.

Формула изобретения

Применение 2,4,6-триметил-5-ок1 сипиримидина в качестве средства, обладающего иммунодепрессивным действием.

Составитель С.Малютина

Редактор Г.Прусова Техред З.Фанта Корректор Л.Бокшан

Заказ 4000 5 Тираж 714 Подпис но е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11 3035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ПИП Патент, г. Ужгород, ул.. Проектная 4