Способ получения макроглобулина

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик р)961695 (61) Дополнительное и авт. сеид-ву— (22) Заявлено 13.06.80 (21) 2942182/28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

15 АМ К з

А 61 К 35/16

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 300982. Бюллетень ¹ 36

153) УДК 612. 398. .132(088,8) Дата опубликования описания 30.09.82 (72) Авторы изобретения

В.A.Áóðëåâ и В.Ф.Учайкин (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский инстит акушерства и гинекологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ .МАКРОГЛОБУЛИНА

Изобретение относится к медицинь и может быть использовано для получения препарата макроглобулина, используемого в диагностических целях и иммуннохимических тестах.

Известен способ получения макроглобулина путем изобретательного высаливания сыворотки крови, диализа концентрата, гель-Фильтрации диализата с последующей ионообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продукта f.1j .

Однако макроглобулин, полученный . известным способом, не обла;.ает способностью подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизации животных и реагировать с антителами в иммуннотоксических реакциях.

Цель изобретения — придание макроглобулину свойств подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизации животных и реагировать с антителами в иммунохимических реакциях.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получейия макроглобулина путем избирательного высаливания сыворотки крови, диализа концентрата, гель-фильтрации диализата с последующей ионообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продукта, сыворотку крови больных острым вирусным гепатитом избирательно высаливают сульфатом аммония .с концентрацией 40-44%, гель-фильтрации подвергают диализируемый экстракт на геле типа сефадекс G-200, выделяют фракцию с параметрами элюции Ко-0,1-0,2, полученную Фракцию концентрируют и диализуют против 0,005-0,01 М фосфатного буфера при рН 6,5-6,8, далее диализат центрифугируют, полученный супернатант подвергают ионообменной и аффинной хроматографии и элюат стабилизируют аминометилольным прс изводным формальдегида и

20 E-лейцина.

Пример . Способ пблучения печеночного макроглобулина.

В качестве источника для получения печеночного макроглобулина (ПМ) предпочтительно использовать сыворотку больного острым вирусным гепатитом в период наибольшей активности воспалительного процесса в печени.

К смеси сывороток при активном

З0 перемешивании вносится насыщенный

961695 раствор сульфата аммония до концентрации 44В. Осадок формируется в течение 16-18 ч при 4 С. Выпавший белок отделяется центрифугнрованнем при 6-8 тыс об/мин в течение 30 мий.

Полученный осадок растворяется на магнитной мешалке в дистиллированной воде в объеме, составляющем 1/10 часть от.исходного. Если растворение осадка не производится, то он устойчив к хранению при 4 С с сохранением активности ПМ в течение 2-3 месяцев (срок наблюдения).

Подготовленный раствор белка диализируется против 0,15 М:раствора хлористого натрия pH=7,2 в течение

24-48 ч при 4 С. Диализованный экстракт подвергается гель-фильтрации через сефадекс G-200 нли ультрагель

АсА 34. Используется колонка размером 3,0 100,0 см, предварительно заполненная гелем и эквилибрированная

0,15 М раствором хлористого натрия

РН=7,2. Гель-фильтрация направлена на получение первого макроглобулярного пика, выходящего в свободном объеме геля. Фракции объединяют и концентрируют активным диализом или инфильтрацией.

По окончании предыдущего этапа препарат наносится на колонку, заполненную сефарозой 6В или ультрагелем АсА 22 и эквилибрированную

0,15 М раствором хлористого натрия рй=7,2 . Эта хроматография направлена на получение активных .фракций, содержащих печеночный макроглобулин, т.е.способных тормозить миграцию лейкоцитов в гемокультуре.

При использовании сефарозы 6В или ультрагеля. АсА 22 печеночный макроглобулин выявляется во фракциях непосредственно следующих за первым белковым пиком в свободном объеме геля. Активные фракции объединяются, концентрируются и диализуются против 0,005 М фосфатного буфера

pH=6,5 в течение 24 ч при 4 С. Выпавшие хлопья белка в процессе диализа удаляются центрифугнрованием при 6-8 тыс.об/мин в течение

30 мин.

На подготовленный ДЭАЕ сефадекс

A-50, уравновешенный 0,005 М фосфатным буфером РН=ф,5, наносится диализованный препарат почечного макроглобулина. Не прореагировавший с ионообменником белок элюируется

0,005 М фосфатным буфером РН=6,5 °

Скорость протекания элюирующего раствора через колонку 10-20 мл в час.

Соотношение анионит.: белок 5:1.

Элюирование веществ с ионообменника проводится линейным градиентом

5 хлористого натрия от 0,01 до 1,0 М в фосфатном буфере РН=6,5. Активные фракции, элюированные 0,2-0,4 M хпористого натрия, объединяются, концентрируются и диалиэуются против 0,1 М

10 трис-HCC буфера, РН= 7,2. На подготовленную колонку, заполненную сефарозой СВ -4B и коньюгированную специфическими антителами к печеночному макроглобину, наносится диализованный препарат. ПМ. Скорость протекания 1-2 мл в час. По окончании движення всего раствора через колонку она промывается 0,1 М трис

НС1 буфером, pH=7,2 до нулевых пока20 эаний поглощения света при Е о .

Элюирование печеночного макроглобулина с колонки осуществляется

0,2 М глицин-HCC буфером, pH=2,2.

По мере получения раствора белка величина рН раствора доводится до

7,2. Выделенный белок концентрируют и диализуют против 0,15 М раствора хлористого натрия.

Учитывая, .что выделение печеноч30 ного макроглобулина производится из потенциально инфицированного сырья сыворотки крови человека, больного острым вирусным гепатитом, конечный препарат обрабатывается фор35 мальдегидом в присутствии Е-лейцина.

Этот прием позволяет сохранить антигенную активность IIN, ñíèçèòü инфекционйость и достичь стабильности препарата.

К раствору белка печеночного макроглобулина в соотношении 1:1 добавляется 0,132 М Е-лейцина и

0,0066 И формальдегида. Полученная смесь выдерживается при 32-374С в

45 течение 72 ч, после чего препарат может храниться при 4 С в течение одного года (срок наблюдения) без изменения антигенной активности и сохранением стерильности раствора.

50 В случае радиоактивной метки ПМ используется формальдегид, радиоактив ный по С . Для удаления не прореагировавшего аминометилольного соединения препарат подвергается гель.55 фильтрации через сельфадекс 6-50.

В таблице приведены характеристики печеночного макроглобулина.

961695

Свойства Характер реакции

1В

Физико-химические: молекулярная масса изоэлектрическая точка электрофоретическая подвижность в агаре и агарозе

Иммунохимические: окрашивание линий преципитации на белок на гликопротеиды на липопротеиды реакция иммунологической неидентичности реакция иммунологической неидентичности с. нормальными белками крови человека

Биологические: а локализация и место образования обнаружение в экстрактах тканей плодов и взрослых выведение из организма

Печень, гепатоцит влияние на миграцию лейкоцитов влияние на прижизненную проницаемость мембраны лимфоцитов человека для хлортетрациклина

Тормоз и т миг рацию

Н арушает проницаемость. влияние на процессы дыхания печеночных митохондрий крысы

Ингибирует дыхание наибольшая частота встречаемости длительность выявления у больных острым вирусным гепатитом (A и B) обнаружение среди здорового населения и серологических реакциях для диаг ностики поражений печени °

Формула изобретения

Способ получения макроглобулина путем избирательного высаливания сы45 воротки крови, диализа концентрата, Клиническая. характеристика:

Предлагаемым способом выделяют белковую фракцию более 200000дальтон °

Полученная белковая фракция обладает способностью тормозить миграцию лейкоцитов в гемокультурах. При иммунизации животных этим фактором удается получить антисыворотку, которую используют В иммунологических

600.000т200.000 дальтон рН. = 4,5 0,3

Аналогично а -глобулину т

Окрашивание

Окрашивание

Окрашивания нет

В -протеин, НВ6-антиген, тканевой в -глобулин, трофобластический фак- „ тор

Преальбумин, альбумин, фибриноген, тромбнн, перулоплазмин, трансферин, а-в липопротеины, а-в гликопротеины, а-в макроглобулины, иммуноглобулины А, И, G, D, E

Не обнаружен

Обнаружен в макрофагах дермального слоя кожи

Больные с гепатотропными заболеваниями

От 2 до 20 дня от начала клинических проявлений заболевания

Не обнаружен

961695

Составитель М.Ковалевская

Техред A. Бабинец Корректор Ю.Макаренко

Редактор И.Тыкей

Заказ 7350/7 Тираж 714 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r Ужгород, ул. Проектная, 4 гель-фильтрации диализата с последующей ионоообменной хроматографией элюата и стабилизацией целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й,с я тем, что, с целью придания макроглобулину свойств подавлять миграцию лейкоцитов, вызывать образование специфических антител при иммунизации животных и реагировать с антителами в иммунохимических реакциях, сыворот ку крови больных острым вирусным гепатитом избирательно высаливают 4044% - ным сульфатом аммония, гельфильтрации подвергают диализируемый экстракт на геле типа сефадекс G-200, выделяют фракцию с параметрами элюции Кд-0, 1-0,2, полученную фракцию концентрируют и диализуют против 0,005-0,01 М фосфатного буфера при рН 6,5-6,8, далее диализат центрифугируют, полученный супернатант подвергают ионообменной и аффинной хроматографии и элюат стабилизуют аминометилольным производным формальдегида и

Е-лейцина.

Источники информации, принятые во внимание дри экспертизе

1. Фримель Х. Иммоннологические методы. М., Мир, 1979.