Способ выделения целлюлазы

 

(72) Авторы нзобретення

И.Л. Рабинович, A.A. Клесов, И. В. Березин и В.А. Мартьянов ягких

«", (.-; (. люции

ый .

Московский ордена Ленина, орден Октябрьс и ордена Трудового Красного Знамени госуд университет им. M.Â. Ломоносова (71) Заявнтель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛОЛАЗЫ

Изобретение относится к способам выделения ферментных препаратов микробного происхождения и может быть, в частности, использовано для получения высокоактивных препаратов целлюла/ зы, применяемых в пищевой промышленности, виноделии и медицине.

Известен способ выделения ферментов, в том числе целлюлаз, из растворов, предусматривающий осаждение о сульфатом аммония из сконцентрирован-, ного упариванием раствора (1 1.

Недостатками этого способа являются сложность регенерации осаждающего агента и низкое содержание целлюлаз в получаемых препаратах, поскольку вместе с целлюлазами происходит осаждение посторонних белков, углеводов, компонентов питательной среды . го и других примесей.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо-, му результату является способ выделе-. ния целлюлазы иэ содержащих ее раст- воров, предусматривающий адсорбцию .фермента из охлажденного до 5-15 С раствора с рН 3-6 на сорбент, представляющий собой измельченную целлюлозу (обычно с размером частиц 10100 мкм, взятую в количестве 0,1-10 г на 50 ед. активности фермента), последующее фильтрование,суспензии и сушку отделенного сорбата f 2J.

Недостатками известного clloc008 являются невозможность получения препаратов, содержащих более 500 ед, целлюлазы на 1 r, и низкая начальная активность получаемых препаратов при использовании для переработки твердых видов растительного сырья, поскольку при добавлении их к сырью первоначально происходит гидролиз сор" бента, на который осаждались целлю" лазы, и лишь затем возможен гидролиз самого перерабатываемого сырья.

975796

Цель изобретения - повышение активности целлюлазы.

Поставленная цель достигается спо" собом выделения целлюлазы, предусматривающим адсорбцию фермента на целлюлозе при рН 3-6, причем адсорбированный фермент элюируют водой или буферным раствором с рН 4,5-7,5 и ионной силой 0,0001-0,01 M с последующей сушкой полученного элюата. .1О

Обычно используют культуральную жидкость продуцента целлюлазы или экстракт поверхностной культуры, или раствор технического препарата целлюлазы. l5

В качестве адсорбента обычно использует хлопковый линт или некондиционный хлопок.

Перед элюцией фермента с целлюлозы обычно осуществляют отмывку адсорбированных примесей буферным раствором с рН 3,5-4,5 и ионной силой 0,01-2 M.

Обычно процесс ведут при 1-25оС

Использование воды или водного раствора с малой ионной силой для смывания адсорбированной целлюлаэы явля" ется неочевидным, поскольку уменьше" ние прочности адсорбции ферментов, как правило, вызывается повышением, а не понижением ионной силы, поэтому поведение целлюлаз в данном случае является исключением.

Близкие результаты, достигаемые при использовании истой воды и водных растворов с ионной силой 0,0001"

0,01 И, объясняются тем, что вода обладает большей способностью к смыванию целлюлаз, но при ее использовании сильно увеличивается гидродинамическое сопротивление целлюлозы, что может приводить к уменьшению скорости элюирования почти до нуля еще до то" го, как весь фермент десорбируется с целлюлозы. Это может приводить к снижению выхода целлюлазы при исполь- 5 зовании в качестве адсорбента порошковых форм целлюлозы типа микрокристаллической. Водные растворы с ионной силой 0,0001-0,01 М, хотя и обладают несколько меньшей способностью к смы- 5О ванию целлюлаз при пропускании равного объема, однако в меньшей степени повышают гидродинамическое сопротивление порошковых форм целлюлозы, благодаря чему элюцию ими можно прово" 55 дить до полного отмывания целлюлаз.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед выделением фермента рН ферментного раствора доводят кислотой, например уксусной, до 3-6, а ионную силу - подходящей солью, например цитратом натрия, ацетатом натрия, хлоридом калия и т.п. - до 0,00010,01 М. Раствор фермента пропускают через охлажденную до 1-25 C колонку, заполненную целлюлозой, со скоростью

0,1-5 свободных объемов в час. По окончании пропускания раствора фер" мента пропускают буферный раствор с рН 3,5-4,5 и ионной силой 0,01-2,0 И (1-10 объемов), а затем - воду или водный раствор с рН 4,5-7,5 и ионной силой 0,0001-0,01 М. Водную фракцию (1-3 свободных объема колонки) собирают и при необходимости (наличии осадка или сильной опалесценции) фильтруют или центрифугируют для удаления осаждающихся примесей, а затем сушат лиофильно.

Полученный препарат целлюлаэы содержит 1000-10000 ед. фермента на грамм и почти не содержит пигмента, балластных белков, протеаз, солей и других примесей. В качестве примеси он содержит небольшие количества растворимых сахаров (глюкозы и целлобиоэы), стабилизирующих фермент при хранении. Ферментный препарат легко гидролиэует растворимые производные целлюлозы, а также природную целлюлозу (хлопок, отходы древесины и т.д.). Выход по ферменту составляет 80"1003.

Колонку с целлюлозой можно использовать для выделения целлюлаэ 10 и более раз беэ ухудшения ее сорбционных свойств, пополняя периодически целлюлозой взамен прогидролизованной ферментом. В качестве сорбента можно использовать микрокристаллическую целлюлозу для хроматографии, измельченный и неизмельченный коротковолокнистый хлопок (линт), отходы производства бумаги, отходы вискозной промышленности.

Пример 1. 2 г технического препарата целловиридина ГЗх (продуцент Trichoderma viride) с активностью 30 ед/г (по КИ-целлюлозе) растворяют в 20 мл О,1 M ацетатного буфера с рН 3,5 и ионной силой 0,01 И при перемешивании в течение 20 мин, затем удаляют центрифугированием нерастворившиеся примеси. В колонку объемом 10 мл (150410 мм) с водяной

7579Ь 4

Пример 3. Готовят 104" ную водную вытяжку поверхностной культуры 5

Trichoderma koningii(npenapax целлоконингин Пх, удельная активность

l0 ед/г), как описано в примере 1.

Добавляют в нее i:Í РО до рН 6 и ионной силы 2 М. B колонку, использованную в примере 1, термостатируемую при 25 С, вносят 8 г неизмельченного некондиционного хлопка, промывают

2 М раствором КН РО, затем пропускают 80 мл целлюйазного раствора, а

55 затем воду. В первых 20". мл водной фракции фермента почти нет. Их отбрасывают. и собирают следующие 20 мл, которые сушат лиофильно. Выход фер5 9 руоашкои, охлажденной до 15 С, вносят 4 r микрокристаллической целлюлозы для колоночной хроматографии(производство "Chemapot ЧССР) и уравновешивают упомянутым буфером. Лдсорбцию целлюлазы проводят пропусканием

20 мл 104-ного раствора целлюлаэного препарата через колонку со скоростью

10 мл/ч. Раствор, не содержащий фермента, удаляют из колонки вытеснением упомянутым ацетатным буфером. После пропускания 100 мл буфера его заменяют на водный раствор одноэамещенного фосфата натрия с ионной силой 0,001 И и рН 7, собирают выходящую фракцию объемом 10 мл и сушат ее лиофильно. Выход фермента составляет

804. Получают 16 мг препарата с активностью 3000 ед/r.

Пример 2. Готовят 1О ь-рый раствор технического препарата целлобронина Г10х с удельной активностью

100 ед/г (продуцент Trichoderma longibrachiatum) в 0,1 И ацетатном буфере (рН.,4,5, ионная сида 0,04,И), как описано в примере 1. В колонку (700425 ми, объем 300 мл) с водяной рубашкой, охлажденной до 1 С, вносят

100 r хлопкового линта, измельченного в течение 5 мин на лабораторной виброиельнице, и уравновешивают упо= мянутым буфером. Пропускают 350 мл раствора целлобронина, затем 400 ил ацетатного буфера, 200 мл 0,1 И фосфатного буфера (рН 7,5, ионная сила

0,2 И) и, наконец, воду со скоростью

50 мл/ч. Собирают водную фракцию объемом 120 мл, центрифугируют для удаления выпавших в осадок примесей и сушат лиофильно. Выход фермента

1003. Получают 600 мг препарата с ак" тивностью 6000 ед/г.

И

j0

35 мента 804 или 60 мг препарата с ак" тивностью l000 ед/r.

ll р и м е р 4. В культуральную жидкость продуцента Tr1choderma lignorum с активностью 0,4 ед/мл добавляют концентрированную уксусную кислоту и ацетат натрия из расчета 0,1 И ацетатного буфера (рН 4,5). Для выделения целлюлаэы иэ культуральной жидкости повторно используют колонку с измельченным линтом из примера 2, отмытую водой и уравновешенную ацетатным буфером. На колонку наносят

1 л культуральной жидкости, далее поступают, как в примере 2. Выход фермента 95 или 95 мг с активностью

4000 ед/г.

Пример 5. В 100 мл 13-ного раствора прейарата целлокандина

Г10х (продуцент Geotrichum candidum) с удельной активностью 100 ед/г в

0,1 И ацетатном буфере с рН 4,5, использованного для гидролиза растворимой Ktt-целлюлозы и содержащего продукты гидролиэа, вносят при перемешивании и охлаждении до 5 С 15 r порошковой целлюлозы с размером частиц

150-250 мкм. Перемешивают 20 мин, . затем раствор, не содержаший фермента, удаляют фильтрованием на стеклянном фильтре, а оставшуюся целлюлозу промывают двуия порциями воды по

20 ил. Водные вытяжки объединяют.и сушат. Выход фермента 804 или 40 мл препарата с удельной активностью

2500 ед/г.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том, что способ позволяет лолучить препараты целлюлазы с содержанием фермента 1000-10000 ед/г, обладающие высокой активностью по отношению к растворимым и нерастворимым формам целлюлозы. Получение препарата не требует значительных затрат, так как позволяет многократно использовать сорбент, а в качестве сорбента использовать отходы хлопковой, целлюлознобумажной, вискозной промышленности.

Для смывания фермента пригодна обычная вода. В ходе выделения целлюлазы происходит отделение балластных белков, пигмента, компонентов средыкультивирования, а также концентрирование в 2-5 раз и обессоливание. Это позволяет исключить процедуры концентрирования разбавленных растворов целлюлазы, культуральных жидкостей и формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Редактор Н. Егорова Техред А.Бабинец Корректор А. Гриценко

Заказ 8936/43 Тиран 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, М-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4

9757 экстрактов при выделении из них фермента, а также их обессоливание.!. Способ выделения целлюлазы из содержащего ее раствора, предусматривающий адсорбцию фермента на целлюлсзе при рН 3-6, о т л и ч а ишийся тем, что, с целью повышения активности фермента, адсорбированный фермент элюируют водой или буферным солевым раствором с рН 4,57,5 и ионной силой 0,0001-0,01 И с последующей сушкой полученного элюаTB.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют культуральную жидкость продуцента цел- 29 люлазы или экстракт поверхностной

96 8

Мультуры, или раствор технического препарата целлюлазы.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что в качестве адсорбемта используют хлопковый линт или некондиционный хлопок.

4. Способ по пп. 1-3, о т л ич а ю шийся тем, что перед элюцией фермента с целлюлозы осуществляют отмывку адсорбированных примесей буферным раствором с рН 3,5-4,5 и ионной силой 0,01-2 M.

5. Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю шийся тем, что процесс ведут при 1-25+C.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Авторское свидетельство СССР

И 495347, кл. С 12 0 13/10 1973 °

2. Авторское свидетельство СССР

N 590957, кл. C 12 N 9/42, 1975.