Способ получения иммобилизованной целлюлозы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ путем :.овалентного связывания целлюлазы с пoJ:имepным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности получаемого продукта , в качестве полимерного носителя используют хитин, активированный п-бензохиноном, и процесс -ведут при весовом соотношении целлюлазы: носитель

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК э

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 2878954/28-1 3 (22)06.02.80 (46)28.02.84. Бюл. М 8 (72)Д.Ю. Балцере, А.K. Арен, С.Я. Перконе, Л.Н. Козловская, A.M. Безбородов и Н.А. Родионова (53)577.15.07(088.8) (56)1. Авторское свидетельство СССР

Р 709631, кл. С 07 & 7/02, 1977.

2. Патент США 9 3929574, кл. С 07 Q- 7/02, 1975.

3. Н. Takashi, G. Sumio, S.Touru, H. Humio. Получение и свойства целлюлозы, связанной с полиакрилнитрилсмолой в качестве носителя, 1976, 23, Р 2, 71-76. („)SU(») A @0 С 12 Н 9/42; С 12 Б 11/00 (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ путем .:овалентного связывания целлюлазы с полимерным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности получаемого продукта, в качестве полимерного носителя используют хитин, активированный п-бензохиноном, и процесс ведут при весовом соотношении целлюлазы: носитель (0,06-0,4):1.

925108

+ Н N — целлюлаза =хиг ий — - NH

ИИ I(Рллн)ла3д

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, в частности целлюлазы. Иммобилизованные ферменты используются в качестве биохимических реактивов, лекарственных препаратов, а также в химической, 5 микробиологической и пищевой промышленности в качестве гетерогенных биокатализаторов.

Иммобилизация целлюлазы обеспечивает создание более эффективного гид-."О ролизующего агента.

Известна стабилизация целлюлазы в растворимой форме (1) и иммобилиза. ция целлюлазы на нерастворимых носителях (2,3) .

Практическое использование таких ферментов, как целлюлаза и Р -глюкозидаза, входящих в целлюлолитический комплекс, требует получения целлюлазы в нера=.творимой форме. 20

Известен способ получения иммобилизованной целлюлазы путем связывания ее с пенополиуретаном. Однако в результате процесса происходит значительн:я инактивация фермента (2), 25

Известен также способ получения иммобилизованной целлюлазы из Азрвгgi11uз ri.äå-: путем связывания фермента с полимерным носителем-полиакрилонитрилсмолой. Активность поВ результате высокой реакционноспособности хинонов реакция ковалентного связывания фермента с носителем проходит быстро и с небольшими потерями фермента. Продол>кительность реакции связывания 1 ч. Связывается до

72Ъ от взятого количества фермента.

Это обеспечивает экономию фермента.

На данном носителе хорошо иммобилизуются все компоненты целлюлолитического комплекса. (> -1,4-Эндоглюканазы иммобилизуются с сохранением 80,9Ъ от исходной активности (по Na-КМЦ), 1>-1,4-глюканцеллобиогидролазы иммобилизуются с сохранением 60Ъ от исходной активности (по целлобиозе).

Иммобилизованные (3 -глюкозидазы показывают 37Ъ активности от активности исходных Р -глюкозидаз (по бО п-нитрофенил (Д-глюкопиранозиду) .

Пример 1.К2,5гносителя (c содер>канием 280 мкг экв хиноновых групп на 1(г носителя прибавляют рас твор 1,0 г,целлюлазного препарата в лученной иммобилизованной целлюлаэы составляет 20Ъ от исходной активности фермента 3 . Недостатком способа является низкая активность иммобилизованной целлюлазы.

Целью изобретения является повышение ферментативной активности иммобилизованной целлюлазы.

Цель достигается способом получения иммобилизованной целлюлазы, заключающимся в ковалентном связывании целлюлазы с полимерным носителем, отличительными особенностями которого являются использование в качестве полимерного носителя хитина, активированного п-бензохиноном, и ведение процесса при весовом соотношении целлюлаза : носитель (0,06- .

О, 4: 1).

Хитин, активированный п-бензохиноном, содержит 0,2-0,28 мкг. экв хиноновых групп на 1 г носителя.

Электронно-акцепторные карбонильные группы создают недостаток электронов на углеродном кольце, вследствие чего хиноны являются электрсакцепторными соединениями и легко вступают в реакцию с нуклеофильными реагентами. Схема реакции следу ощая:

10 мл 0,1 н. ацетатного буфера (рН 4,8>.

Исгользуется целл>олазный препарат из гриба Geot=iehum candidum с содержанием белка 50о и эндоглюканазной (по

Но.-КМП) активностью 11,37 мкмоль глюкозы/мг белка, целлобиазной (по целлобиозе) активностью 1,13 мкмоль глюкозы/мг белка и р --глюкозидазной (по п-нитрофенил-(-D-глюкопиранозиду) активностью 1,16 мкмоль глюкозы/мг белка,.

Выдерживают при комнатной температуре 1 ч и отфильтровывают. Промывают Зх15 мл 1 М раствора Nac1 и 2 х

10 мл ацетатного буфера. Связывается

72Ъ от взятого количества белка. Полученный препарат иммобилизованной целлюлазы содержит 43,6 мг белка на 1 r носителя.

Активность иммобилизованной целлюлазы: эндоглюканазная 9,2 мкмоль глюкозы/мг белка (80,9Ъ); целлобиазная О,р8 мкйоль глюкозы/мг белка

925108

Составитель О. Скородумова

Техред M.Òåïåð Корректор А. Тяско

Редактор Бородкина

Заказ 1162/6 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 (69,8Ц,Р -глюкозидазная 0,43 мкмоль глюкозы/мг белка (36,9Ъ) .

Пример 2. К 1 r носителя при.— бавляют раствор 0,2 г целлюлазного препарата иэ Geotrichum candidum в

3 мл 0,05 н. ацетатного буфера

5 (рН 4,8) . Выдерживают при комнатной температуре 1 ч и отфильтровывают.

Промывают 3 х 10 мл 1 М раствора

NaCI и 2 х 5 мл ацетатного буфера.

Получают препарат иммобилизованной целлюлазы с активностью: эндоглюканаэ ной 9,13 мк.моль глюкозы/мг белка (B0,2Ъ), целлобиазной 0,68 мкмоль глюкозы/мг белка (60,0Ъ,), р -глюкозидазной 0,42 мкмоль глюкозы/мг бел- 15 ка (37,1Ъ).

Пример 3. К 2 г носителя прибавляют раствор 0,3 г целлюлазного препарата в 4 мл 0,05 н, ацетатного буфера IpH 4,8) . Используется целлю- 20 лазный препарат из гриба Triсhoderma

Iignonum с содержанием белка 40-о и эндоглюконазной активностью 32 мкмоль глюкозы/мг белка, целлобиазной активностью 3,4 мкмоль глюкозы/мг белка, ) -глюкозидазной активностью

1,9,мкмоль глюкозы/мг белка. Выдерживают при 4 С в течение

20 ч.Отфильтровывают и промывают

3 х 15 мл 1 М NaCI и 1 х 10 мл ацетатного буфера. Получают препарат иммобилизованной целлюлазы с содержанием белка 43,2 мг на 1 г носителя.

Активность иммобилизоваиной целлюлазы: эндоглюканазная 25,8 мкмоль глюкозы/мг белка (80,8Ъ), целлобиазная 2,0 мкмоль глюкозы/мг белка (60 1Ъ), р -ãëþêoçèäàçная 0,7 мкмоль глюкозы/мг белка (37,0Ъ) .

Определение активностей целлюлазы:40

1. Глюканаэная (по Ка-КМЦ).

Активность определяется по количеству редуцирующих сахаров, образующихся при гидролизе 1 мл 1Ъ-ного раствора натриевой соли карбоксиметил- 45 целлюлозы (Na-КМЦ) в течение 1 ч при

50 С в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,8 ). Определение редуцирующих сахаров проводят с 3, 5-динитросалициловой кислотой. По калибровочной кривой глюкозы определяют активность в г глюкозы на 1 мл реакционной смеси и пересчитывают в мкмоль глюкозы на 1 мг связанного белка.

2. Целлобиазная (по целлобиоэе) .

Активность определяется по количеству редуцирующих сахаров, образующихся при гидролизе 1 мл 0,2Ъ-ного раствора целлобиозы в течение

0,5 ч при 40 С в 0,25 М ацетатном буфере (рН 4,7). Определение редуцирующих сахаров проводят глюкоэооксидазным методом.

3. Арил-р-глюкоэидазная ((по п-нит рофенил- -3-глюкопираноэиду) .

Активность определяется по количеству п-нитрофенола, образовавшегося при гидролизе 1 мл 0,001 М п-нитрофенил- 5 — Q --глюкопиранозида в тече1 ние 10 мин при 400С в 0,1 М ацетатном буфере (pH 4,7). После колориметрирования (3 фильтр) по калибровочной кри= вой определяют содержание п-нитрофенола, пересчитывают в мкмоль на

1 мг белка.

Преимуществами предлагаемого способа являются экономия ферментного препарата и увеличение удельной активности иммобилизованного фермента.

Высокие показатели всех активностей иммобилизованнсй целлюлазы являются предпосылкой практического использования иммобилизованного препарата.

Иммобилизованная целлобиаэа может быть применена для окончательного гидролиза олигосахаридов, получаемых в процессе ферментативного расщепления цел .юлозы ферментами, содержащими недостаточное количество целлобиазы, дс глюкозы.

Иммобилизованные р-глюконазы могут найти применение для гидуолиэаP -глюканов.

Иммобилизованная f3 --глюкозидаэа может быть использована для Получения из Р --глюкозидов агликонов, которые применяются в фармацевтической про- мышленности.