Способ получения сорбента

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 23 ° 03. 81 (21) 3267925/28-13 (511 М. Кт1.з с присоединением заявки HP (23) Приоритет

С 07 F 7/18

//G 01 N 33/48

С 12 N 9/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 07.1282. Бюллетень Но 45

Дата опубликования описания 07. 12. 82 (53) УДК 543.54 (088. 8) О.Ф.Суджювене, A N Ãóìàóñêàéòå, С.С.Флаксайте

И.-Г.И.Песлякас, И.И.Кюдулас и В.И.Лауцюс (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт " -прикладной 9H3HMoJIoI (71) Заявитель (5,4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ COP BEHTA

Изобретение относится к области энэимологии и предназначается для получения сорбента для выделения и очистки кофактор-зависимых .ферментов — оксидо-редуказ, кинаэ и др.

Для выделения и очистки кофакторзависимых ферментов наряду с классическими методами широкое распространение получила и методика биоспецифической хроматографии с использованием групповых сорбентов на основе иммобилизованных производных

:кофакторов..

Однако сорбенты данного типа несмотря на их высокую специфичность обладают существенными недостатками: дороговизной, которую определяет дороговизна используемых для синтеза сорбентов носителей и кофакторов, сложность методов активирования и модифицирования кофакто- . ров, низкая химическая стабильность получаемых сорбентов, что в совокупности исключает возможность использования сорбентов для препаративного выделения и очистки кофактор-зависимых ферментов.

Более перспективными для препаративного выделения и очистки кофактор-зависимых ферментов являются сорбенты, содержащие в качестве лиганда красители, структурные аналоги коферментов, и в первую оче5 редь активный краситель цибакрон голубой РзСЛ. Так, известен способ получения сорбента на основе агароэной матрицы с присоединенным красителем цибакрон голубым Р СА (1 ).

Однако воэможность препаративного использования сорбентов со связанными красителями несмотря на химическую стабильность последних ограничена недостатками используемой для синтеза сорбентов агарозной матрицы (дороговизна, низкая химическая, микробиологическая и механическая стабильность).

Наиболее близким по технической сущности является способ получения сорбента на основе красителя цибакрон голубого F>GA и микросферического пористого сйликагеля SG 120, включающий активирование носителя ,f -àìèíoïðîïHëòðHýòîêñèñèëàíîì, отдеЛьное от носителя активирование водорастворимого декстрана g-40 с

BrCN в среде бикарбоната йатрия при рН 9,0 в соотношении 50 мг BrCN на

200 мг декстрана и модифицирование носителя BrCN-активированным декстра-

979354 ном при рН 9,0 в колонке в соотношении 200 мг декстрана на 1,0 r носителя путем рециркуляции активированного декстрана через колонку в течение 24 ч, промывку модифицированного носителя, присоединение красителя цибакрон голубого F GA и промывку полученного сорбента водой. Обычно промывку модифицированного носителя осуществляют IM раствором ИаСГ и водой (2 j.

Однако данный способ получения сорбента имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, процесс модифицирования активированного неор-. ганического носителя является нетех- 15 нологичным и осложняется использованием для присоединения декстрана

Т40 к носителю BrCN, который является дорогостоящим, ядовитым и опасным веществом при использовании его в препаративных целях, во-вторых, при использовании для модифицирования неорганического носителя декстрана, активированного BrCN, образующаяся связь между носителем и декст- 25 раном является химически нестабильной 3), что приводит к потере присоединяемого красителя при длительном использовании сорбента и, следовательно, снижению емкости сорбента; в-третьих, существующий метод модифицирования неорганического носителя обеспечивает возможность введения в сорбент 5-10 мкМ красителя на 1 r сорбента и ограничивает тем самым возможность его использования для выделения и очистки тех кофактор-зависимых ферментов, которые обладают низким средством к красителю.

С другой стороны, сравнительно невысокая концентрация вводимого кра- 40 сителя влияет и на степень сорбционной емкости сорбента в целом по отношению выделяемых с его помощью белков.

Цель изобретения — упрощение процесса получения сорбента (путем снижения числа стадий, общей трудоемкости процесса, а также исключения ис.пользования ядовитых веществ) и по- 50 вышение сорбционной емкости сорбента., Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента,включающему обработку неоргани- 55 ческого кремнеэемсодержащего материала -аминопропилтриэтоксисиланом и модифицирование полученного производного с последующей промывкой и присоединением активного красителя 60 цибакрон голубого F+GA, модифицирование производного проводят в течение 1-2 ч 25-50-кратным избытком глутаральдегида в отношении NH -групп обрабатываемого продукта. 65

Активный краситель цибакрон голубой Гэ GA используют в количестве 20100 мкМ/г. обрабатываемого продукта.

В качестве неорганического кремнеэемсодержащего материала используют .пористое стекло или силохром со средним радиусом пор 300-800 A.

Промывку модифицированного продукта перед присоединением красителя осуществляют водой, 10-20 объемами

0,09-0.,15 N pacтворà NaНСО, содержащего 0,2-0,3% боргидрида натрия в течение 2-3 ч.

Способ обеспечивает возможность введения в сорбент 10-40 мкМ красителя на 1 r сорбента, т.е. позволяет повысить его сорбционную емкость.

Модифицирование носителя, содержащего аминогруппы, проводят глутаральдегидом с последующим восстановителем, что способствует образованию стабиль4 ной связи между ним и носителем и образованию стабильной связи между присоединяемым красителем и модифицированным носителем. Метод модифици рования глутаральдегидом является доступным, простым в технологическом оформлении, так как не требует использования труднодоступных и ядовитых веществ, и позволяет подбором соотношения реагирующих веществ регулировать концентрацию вводимого в сорбент красителя и соответственно сорбционную емкость сорбента в широком интервале значений. Способ является более технологичным и простым по сравнению с известным.

Неорганическая матрица может быть использована как в виде силохромов и пористых стекол с последующим аминированием f"аминопропилтриэтоксисиланом, так и в виде готовых

МН -содержащих производных, выпускаемйх зарубежными фирмами и НПО Виохим-реактив . Оптимальное содержание NH -групп 100-448 мкМ/г.

Пример 1. Получение сорбента на основе силохрома С-80. 10 г силохрома С-80 заливают 10 г абсолютного ацетона, вводят 10 г -аминопропилтриэтоксисилана H реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при температуре кипения смеси. Продукт реакции отфильтровывают, промывают

4-5 раз ацетоном (по 50 мл) и высушивают. Получают 9,4 г аминопроиэводного силохрома С-80. 2,3 г силанизированного . силохрома С-80 (концентрация NH -групп 120 мкМ/1г) заливают 5,8 мл 25%-ного глутарового диальдегида и 2,6 мл воды, перемешивают 1 ч при комнатной температуре, промывают на фильтре водой, затем небольшими порциями (15-20 мл)

0,1 М NaHCO> (200 мл),,содержащего

0,2-0,3Ъ йаВН4в течение 2 ч и опять промывают водой. К влажному глута979354 ральдегидом модифицированйому сило- та, полученного по примеру 1 при исхрому С-80 прибавляют 3 мл воды и пользовании 25-кратного избытка глупри перемешивании при 60 С вводят таральдегида с концентрацией красипо каплям раствор 252,5 мг (234;8 мкМ) теля 15 мкМ/г сорбента. Сорбент цибакрон голубого ЕьОА в 14,0 мл уравновешивают 10 мМ трис-HCLt буфеводы. Перемешивание продолжают еще ром РН 6,5, содержащим 5 мМ MgCP 6Н О

0,5 ч прибавляют 2,25 г NaC8, пере- и 0,5 мМ ЭДТА, и наносят 1,5 мл мешивают 1 ч, затем температуру повы- раствора фермента в исходном буфере. шают до 80 С, прибавляют 200 мг Концентрация белка 6,0 мг/мл, удельNa CO> и перемешивают 2 ч. Полученный ная активность 19,8 ед/мг белка, При сорбент отмывают холодной и горячей элюировании с 50 мл исходного буводой 60-90 С до тех пор, пока про- фера вымываются- балластные белки. мывные воды становятся бесцветными. . Элюирование гексокинаэы проводят граКонцентрацию красителя на сорбенте диентом хлористого натрия от 0-1,0 М определяют по разнице Между взятым в исходном буфере. Удельная активего количеством и найденным в про- 15 ность гексокинаэы после десорбции мывных водах, используя теоретичес- в среднем 72 ед/мг. Выход по активкий коэффициент экстинции E=13600 М ности 98-100%. Емкость сорбента .см (Л ..ц, = 610 нм) . Концентрация .140 ед/мл. цибакрон голУбого F GA 37,0 мкМ/г Пример За. B хроматографическую колонку (как в примере 3) загруПример 2. Получение группо- жают 1,0 мл сорбента, полученного вого сорбента на основе пористого . по примеру 1 при использовании 25стекла CPG 550, кратного избытка глутаральдегида с б 7 r силанизированного стекла

В

25 концентрацией красителя 40,6 мкМ/г

CPG 550 (концентрация ИН -групп сорбента. Сорбент уравновешивают

100 мкМ/г) заливают 6,7 мл 25%-ного буфером (как в примере 3) и наноглутаральдегида, прибавляют 23,3 мл сят 2,0 мл раствора фермента в ис воды и перемешивают 1 ч при комнат- ходком буфере. Концентрация белка ной температуре, промывают на фильт- 8,8 мг/мл, удельная активность ре водой, затем 400 мл 0,1 М ИаНСОЗ 30 16,5 ед/мг белка. При элюции 100 мл (порциями по 30-50 мл), содержаще- исходного буферного раствора вымыго 0,2-0,3% ИаВН4,в течение 2 ч водой. вают балластные белки; Активная гекK влажному модифицированному стеклу сокиназа десорбируется линейным граприбавляют 10 мл воды и при пере- диентом хлористого натрия от 0мешивании при 60 С вводят по каплям 35 1,0 М в исходном буфере. Удельная акраствор 660, 1 мг (613,9 мкМ) ци- тивность гексокинаэы после десорбции бакрон голубого F> GA. Далее реакцию 82,0 ед/мг белка, выход по активноспроводят по примеру 1, но количество . ти 100%. Емкость сорбента 225ед/мл. прибавляе" х Йа 6 и СОЗр" П р н м е р зб. В хроматографивенно 5,5 г и 493 мг. о ц р ц ческую колонку (как в примере 3) эаон гол бого 25 мкМ/г сухого гружают 1,0 мл сорбента, полученного сорбента. по примеру 1 при использовании 50п е елеиия пригодности соркратного избытка глутаральдегида с бентов для очистки кофактор эави концентрацией красителя 15 мкМ/г сорбента, уравновешивают исходным бументов используют базовый фером и наносят 1 мл раствора гексот ожжевой гексокиназы, полученный после автолиз р сле автолиза пекарских киназы с концентрацией белка

8,8 мг/мл и удельной активностью ниЯ двухкратног Фракц Р 16,4 ед/мг белка. При элюировании с сУльфатом аммониЯ, диализа лиоф 50 80 мл исходного буфера вымываются ной сушки, согласно нача н гласно начальным стабалластные белки. Активная гексокидиям схемы очистки фермента по меназа десорбируется линейным гради тодике (4 ) и базовый препарат дрож- ентом Naca от 0-1,0 N в исходном жевой алкогольдегидр оль еги огеназы, полуб фере. Удельная активность гексоки55 назы после десорбции в среднем втолиэа д ожжей, тер- У е

80 ед/мг белка, выход по активност аботки фракционирования . сульфатом аммония, д ония диалиэа и лиофиль100%. Емкость сорбента 142 ед/мл. ной сушки согласно н гласно начальным стадиям

П и м е Зв. В хроматографит ике (5 ). Удельная активность Р и м е р по методике (). д ческую колонку (как в примере 3) эадля 60 гружают l мл сорбента, полученного ментов в среднем 10-25 ед/мг для гексокиназы окинавы и 5-10 ед/мг белка для по пРимеру 1 при использовании 50алкогольдегидрогеназы.

П и м е р 3. Очистка дрожжевой кратного избытка глутаральдегида с

Пример . чис концентрацией красителя 37jO мкМ/г

Ф ую колонку сорбента, уравновешивают исходным

В хроматографическую колонк (1,0 5,0 см) загружают 1 0 мл сорбен- 65 буфером и наносят 1,5 мл раствора

979354 гексокиназы с концентрацией белка

8,5 мг/мл и удельной активностью

21,1 ед,/мг белка. При проведении хроматографии в условиях идентичных примеру 3 удельная активность фермента 69 ед/мг белка с выходом активности 72%. Емкость сорбента

2-24,5 ед/мл.

Пример Зг. В хроматографическую колонку (как в примере 3) загружают 2,8 мл сорбента, полученного на основе пористого стекла (как в примере 2) с использованием

50-кратного избытка глутаральдегида и концентрацией красителя 15 мкМ/1г сорбента. После уравновешивания сорбента исходным буфером наносят 3 мл раствора гексокиназы с концентрацией белка 9,6 мг/мл и удельной активностью 33 ед/мг белка. При проведении хроматографии в условиях идентичных примеру 3 удельная активность десорбированного фермента достигает

150 ед/мг белка с выходбм активности 80%. Емкость сорбента 333 ед/мл.

П р и м -е р 4. Очистка дрожжевой алкогольдегидрогеназы.

В хроматографическую колонку (1,5 ° 3,0 см), заполненную 2,0 мл сорбента, синтезированного (как в примере 2) с использованием 25-кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г сорбента, и уравновешенную 10 мМ трисНСВ буфером рН 6,5, содержащим .

5 мм М СЕ -6Н О,. 0,,5 мМ ЭдтА и 0,05 мм меркаптоэтаньля, наносят 3,0 мл ферментного раствора алкогольдегидро генаэы. Концентрация белка 14,7 мг/мл, удельная активность 7,9 ед/мг белка.

При промывании колонки исходным буфером (140 мл) вымываются балластные белки. Элюирование фермента осуществляют специфически линейным градиентом НАД от 0-10 мМ (50 МЛ) в иеходном буфере. Активная алкогольдегидрогенаэа десорбируется при 3 мМ НАД с удельной активносгью 120 ед/мг белка и выходом активности 47%. Сорбционная емкость сорбента 140 ед/мл сорбента.

П р и м е.р 4 . В хроматографическую колонку (как в примере 4), заполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в, примере 1) с использованием 25-кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 15 мкМ/г, урав- 5 новешенную исходным буфером, наносят

2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью 7,6 ед/мг .белка и концентрацией белка 10,6 мг/мл.

При промывании 60 мл исходного буфе- 6 ра вымываются балластные белки. Элюирование алкогольдегидрогенаэы проводят линейным градиентом НАД от

0-10 мМ в исходном буфере. Активный фермент десорбировался при 5 мМ НАД с удельной активностью 55 ед/мг белка и выходом активности 48%.Емкость сор бента 120 ед/мл сорбента.

П р и м,е р 48. В хроматографическую колонку (как в примере 4), заполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в примере 1) с использованием 25кратного избытка глутаральдегида с концентрацией красителя 40,6 мкМ/г, уравновешенную исходным буфером, наносят 2,0 мл раствора алкогольдегидрогеназы с концентрацией белка

11,6 мг/мл и удельной активностью

8,3 ед/мг белка. После промывания

60 мл исходного буфера вымываются балластные белки. Элюирование алкогольдегидрогеназы проводят линейным градиентом НАД от 0-10 мМ в исходном буфере, Активная алкогольдегидро20 геназа десорбируется при 5 мМ НАД с удельной активностью 140 ед/мг белка. Сорбционная емкость сорбента

130 ед/мл сорбента.

Пример 48. В хроматографи25 ческую колонку (как в примере 4), заполненную 1 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в примере 1) с использованием

50-кратного избытка глутаральдеги30 да с концентрацией красителя

15 мкМ/г, уравновешенную исходным буфером, наносят 2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью 7,6 ед/мг белка и кон35 центрацией белка 10,6 мг/мл. После вымывания балластных белков с 60 мл исходного буфера активная алкогольдегидрогеназа десорбируется линейным градиентом НАД от 1-10 мМ в исходном

40 буфере ° Удельная активность фермента, десорбируемого с 4 мМ НАД 110 ед/мг белка с выходом активности 43%. Ем,кость сорбента 90 ед/мл сорбента.

Пример 4 . В хроматографи45 ческую колонку (как в примере 4), заполненную 1,0 мл сорбента, полученного на основе силохрома С-80 (как в примере 1) с использованием

50-кратного избытка глутаральдегида .с концентрацией красителя 37 мкМ/г, наносят 2 мл раствора алкогольдегидрогеназы с удельной активностью

7,6 ед/мг белка и концентрацией белка 10,6 мг/мл. При проведении хроматографии аналогично примеру 4-48 алкогольдегидрогеназа десорбируется при 5 мМ НАД с удельной активностью

115 ед/мг белка и выходом активности 41%. Емкость сорбента 112 ед/мл.

Предлагаемый способ получения группового сорбента на основе модифицированного неорганического носителя и красителя цибакрон голубого

Рд GA обеспечивает по сравнению с известными способами получения сор65 бентов следующие преимущества. Вы979354

Формула изобретения

Составитель О.Скородумова

Редактор О.Колесникова Техред А.Ач Корректор В.Прохненко

Заказ 9270/2 Тираж 388 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 сокую эффективность сорбента по отношению кофактор-зависимых ферментов, т.е. возможность повышения удель ной активности очищаемых ферментов за одну стадию сорбции - десорбции в среднем 4-15 раэ с сохранением активности фермента на 40-100%. Сорбент, получаемый по предлагаемому способу, обладает высокой объемной сорбционной емкостью ферментов, составляющей 90-330 ед. активности/мл сорбента. Доступность исходных веществ, необходимых для получения осмента, простота и доступность метода. получения сорбента обеспечивают воэможность внедрения техноло- !5 гии синтеза в производство для выпуска укрупненных партий сорбента.

Совокупность перечисленных преимуществ определяет эффективность ис- 20 пользования предлагаемого способа получения сорбента для его промышленного производства и использования в технологии получения высокоочищенных кофактор-зависимых ферментов.

1. Способ получения сорбента, ЗО включающий обработку неорганического кремнеземсодержащего материала -аминопропилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного производного с последующей пРомывкой и.присоединением активного красителя цибакрон голубого F GA, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения про-, цесса и повышения сорбционной емкости сорбента, модифицирование осуществляют в течение 1-2 ч глутаровым альдегидом, взятым в 25- 50-кратном избытке по отношению к содержанию

NH -групп обрабатываемого продукта.

2. Способ по п.l, о т л и ч а ющ н и с я тем, что активный краситель цибакрон голубой F>GA используют в количестве 20-100 мкМ/г обрабатываемого продукта.

3. Способ по пп.l и 2, о т л ич а ю шийся тем, что в качестве неорганического кремйеземсодержащего материала используют пористое стекло или силохром со средним радиусом пор 300-800 A.

4. Способ по пп.1-3, о т л ич а ю шийся тем, что промывку модифицированного продукта перед присоединением красителя осуществляют водой, 10-20 объемами 0,09-0,15 М раствора NaHCO содержащего 0,20,3% боргидрида натрия в течение

2-3 ч.. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Burgett М.И., Greenfey L.×.

"Amer. Lab.", 1977, 9.78.

2. Anderson Р.A., Jervis Ь.

Affinity purification of ma6ate

dehydrogenase and lactate dehydrogenase from fish muscle on microsphericaf porous ceramic adsorbents". — "Biochem.Soc.Trans.", 1977, 5, .

728.

3. Turkova Y. Leakage of coupled абайinant, — "J.Chromatography", 1978, 12, 189.

4. "Arch.Biochem.Biophys. 1973, 158, 451-457.

5. Кочетов Г.A Практическое руководство no sHsHMozorHH N., 1Высшая школа, 1978, 128 °