Способ получения нейраминидазы вибрионов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик 973613 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 17.11.80 (21) 1д994т/28 1З с присоединением заявки № (23) Приоритет (52)М. Кл.

С 12 N 9/00

Гоаударотвкнный комитет

СССР (53) УДК 615.7 79. .94 (088.8) но делам изобретений н открытий

Опубликовано 15.11.82. Бюллетень № 42

Дата опубликования описания 15.11.82

В. М. Лавровская, 3. Е. Таранюк, Н. М. Юртаева. и Ю. П. Комаров

l (72) Авторы изобретения (7l ) Заявитель

Горьковский научно-исследовательский инстит1ут эпидемиологии и микробиологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ ВИБРИОНОВ

1

Изобретение относится к микробиологий и касается производства ферментов.

Известен способ получения нейраминидазы вибрионов путем выращивания продуцента в питательной среде в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта (11.

Однако известный способ не обеспечивает высокой активности целевого продукта (активность 50 ед/мл).

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Цель достигается тем, что согласно способу получения нейраминидазы . вибрионов путем выращивания продуцента в питательной среде в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм нехолерного водного НАà — вибриона 59041, выращи-20 ванне ведут при 27 — 29 С, скорости аэрации

2 — 1 и/л среды и перемешивания 500 — 200 об/мин в течение 6 — 8 ч, затем добавляют раствор СаС1т до конечной концентрации 0,4 — 0,6% и 20 %-ный раствор уксусной кислоты до установления рН 5,5 — 6,0.

При этом 20 a-ный раствор уксусной кислоты вводят одновременно с раствором СаС1> или через 1 — 2 ч после добавления этого раствора.

Способ осуществляют следующим образом.

Ферментсодержащую культуральную среду получают путем культивирования продуцента нейраминидазы на бульоне из ферментативного гидролизата казеина в реакторе при непрерывной подаче воздуха и перемешивании без дополнительного введения углеводного питания.

Основные параметры: температура (27 — 29 ), рН среды (6,9 — 7,0), степень аэрации (воздух от 2,0 до 1 л/л среды, перемешивание от 500 до 200 об/мин) регистрируют с помощью электронного пульта управления. Время выращивания 8 ч, после чего производят активацию фермента в два этапа, путем добавления хлоз ристого кальция до конечной концентрации 0,5% и подкисления культуральной взвеси уксусной кислотой до рН 5,5 — 6,0 через 1 — 2 ч. При этом в качестве продуцента нейраминипазы исполь973613

ВНИИПИ Заказ 8617/29 Тираж 505 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4

3 зуют штамм нехолерного водного НА виб риона 59041.

Выделение иэ культуральной среды очищенного фермента проводят методом ионообменной хроматографии.

Пример 1. В 35-литровый реактор загружают 20 л бульона из казеинового гидролизата с содержанием НН = 180 мг %, пептона 0,5%, рН 6,8 — 7,0. Плотность посевного материала — смыв 18-часовой агаровой культуры штамма нехолерного водного НАГ-вибриона

59041 составляет 100 млн микробных клеток

/мл среды. Выращивание в течение 8 ч ведут при +28 С в условиях регулируемой аэрации воздухом (от 2,0 до 1 л/л среды) и перемешивания (от 500 до 200 об/мин). Активность полученного ферментсодержащего фильтрата

2 тыс. РДЕ, что в 2 — 4 раза превышает активность культуральной среды, полученной при культивировании того же штамма в колбах на качалке (512 — 1 тыс. РДЕ). При активации фермента ионами кальция, проведенной добавле. кием раствора СаС1 до конечной концентрации

-.0,5% с одновременным подкислением культурыьной взвеси 20% уксусной кислотой до рН 5,5 — 6,0, получено повышение активности еще в 2 раза —. до 4 тыс, РДЕ. Режим активащ и в два этапа путем добавления СаС1 и последующим подкислением до рН 5,5 — 6,0 через 1 — 2 ч позволяет повысить активность до 8 — 16 тыс. РДЕ.

Двухэтапная активация фермента в культуральной жидкости, выращенной в колбах на качалке, равняется в 2 тыс. РДЕ. Таким образом, активность ферментсодержащего фильтрата культуры нехолерного водного НА1— вибриона 59041, полученного за 8 ч культиви .. рования в реакторе предлагаемым способом превышает активность, получаемую в колбах на качалке за 18 — 20 ч в 4 — 8 раз.

Пример 2. В 35-литровый реактор загружают 20 л бульона из казеинового гидролизата с содержанием NH> 180 мг %, пептона

0,5%, рН 6,8 — 7,0., Плотность посевного материала — смыв 18 ч агаровой культуры штамма холерного вибриона Р 1409 — составляет

100 млн. микробных клеток/мл. среды. Выращивание в течение 8 ч ведут при +28 С в условиях регулируемой аэрации воздухом (от

2,0 до 1,0 л/г среды и перемешивания (от 500 до 200 об/мин).,Нейраминидазная активность полученного ферментсодержащего фильтрата

1,5 тыс. RDE и 100 ед/мл при определении тиобарбитуровым методом по Уоррену) .

При активации фермента ионами кальция, проведенной добавлением раствора СаСI до конечной концентрации 0,4 — 0,6%, с одновремен ным подкислением культурной взвеси 20% уксусной кислоты до рН 5,5 — 6,0 получено повышение активности до 2 тыс. RDE u 130 ед/мл при определении тиобарбитуровым методом по Уоррену.

При двухэтапной активации (добавление

lO СаС1 и последующее подкисление до рН 5,5—

6,0 через 1 — 2 ч) активность ферментсодержаimerо фильтрата 4 тыс. RDE и 140 ед/мл при определении тиобарбитуровым методом по

Уоррену. Таким образом, активность ферментtS содержащего фильтрата культуры холерного вибриона N 1409, полученного за 8 ч культивирования в реакторе предлагаемым способом, превышает активность, полученную в колбах на качалках за 18 — 20 ч в 4 раза по титрам RDE

20 и в1,7 раза при определении тиобарбитуровым методом по Уоррену.

Предложенный способ позволяет повысить активность целевого продукта в 8 — 16 раз при сокращении времени получения с 18-20 до

25 8ч

Формула изобретения

511 1. Способ получения нейраминидазы вибрионов путем выращивания продуцента в питательной среде в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продук. та, в качестве продуцента используют штамм нехолерного водного НАà — вибриона 59041, выращивание ведут при 27 — 29 С, скорости аэрации 2 — 1 л/л среды и перемешивания 500—

4О 200 об/мин в течение 6-8 ч, затем добавляют раствор СаС1 до конечной концентрации

0,4-0,6% и 20%-ный раствор уксусной кислоты до установления рН 5,5 — 6,0.

2. Способ по п. I, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что 20%-ный раствор уксусной кислоты вводят одновременно с раствором СаСI, или через 1 — 2 ч после добавления этого раствора.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Вертиев 10. В. и др. Выделение и характеристика нейраминидазы продуцируемой неагглютинизирующимися вибрионами. — "Биоорганическая химия", 1975, 1, 11, с. 1639,