Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОВРЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советсиик

Социапистичесиин

Рес убнми (iii981360 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (2р)Заявлено 21.01.81 (2l) 3264325/28 13 с присоединением заявки № (23 ) П р нор и тет

Опубликовано15.12.82. Бюллетень № 46

Дата опубликования описания 1 5. 12 . 82 (5! )М. Кл.

С 12 N 9/64

Ве дарсжнньй кемнтет

СССР пю делам нзобретеннй н еткрытнй (53) УД K 577 15 .07(088.8) Л.M. Эпштейн, В.Н. Акулин, М.В. Колодз

С.А. Кудинов и А.Л. Лосева

F ,(Ордена Трудового Красного Знамени институт бидхимии им. А.В. Палладина АН Украинской ССР Q. Тихоокеанский.. научно-исследовательский институт рыбного тсозяйства и океанографии (72) Авторы изобретения (71) Заявители (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА

ПРОТЕОЛИТИ4ЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОГ1 ЖЕЛЕЗЫ КИТОВ

Изобретение относится к технологии получения протеолитических ферментов и может быть использовано в ферментной промышленности, а получаемый препарат - в медицине, пищевой промышленности.

Известен способ получения комплекса протеолитических ферментов из морепродуктов - гепатопанкреаса промыс- о ловых видов крабов, включающий гомогенизацию сырья в воде, отстаивание гомогената, очистку полученной жидкой фазы от примесей путем введения сульфата аммония до насыщения 0,3, отделение осадка, фильтрацию, осаждение ферментов в фильтрате сульфатом аммо. ния до насыщения 0,8, растворение осадка с комплексом ферментов в дистиллированной воде, диализ и лиофили- 20 зацию целевого препарата. Способ обес. печивает получение комплекса ферментов, содержащего трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы А и Б, лейцинамино2 пептидазу, щелочные и нейтральные протеазы (! ). . Однако указанный способ обладает тем недостатком, что использование в качестве сырья для получения ферментов промысловых видов крабов нерентабельно из-за дефицитности этих видов.

Способ включает много стадий выделения, что обуславливает длительность очистки целевого продукта и сказыва" ется на его себестоимости.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ выделения комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов, предусматривающий гомогенизацию поджелудочной железы, дробную экстракцию 2 объемами и 1объемом 0,25

Й, раствора серной кислоты, доведение . рН экстракта до 3,0, двухстадийное осаждение ферментов сульфатом аммония до 20 и 403 насыщения. фракцию, осажденную между 20 и 40 насыщения, растворяют в 10 объемах О, 1 M боратного

360

3, 981 буфера, добавляют 0,1 M раствор хлористого кальция и активируют трипси-, ном при +50C. Ферментный препарат диализируют против 0,001 N. раствора

coRRHoA, кислоты на холоду, центрифугируют и сушат лиофилизацией, Выход протеолитического комплекса .из 1 кг поджелудочной железы кита составляет 1,8 г (по белку) t 2 j.

Известный способ характеризуется недостаточно высоким выходом и активностью ферментов, а также многостадийностью процесса, за счет чего снижает. ся выход ферментов и их активность.

Целью изобретения является повышение выхода и активности ферментного комплекса при упрощении технологии, устранении кислотной экстракции, которая является основной причиной снижения активности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения комплекса протеолитических ферментов иэ поджелудочной железы китов, включающему гомогенизацию сырья, экстракцию, осаждение ферментов, активацию комплекса трипсином и сушку, экстракцию и активацию комплекса ферментов осуществляют одновременно в буфере рН

7,6-8,0, а трипсин используют в количестве 4-6 мг на 100 r гомогената, осаждение ферментов осуществляют ацетоном с отделением полученного осадка центрифугированием.

Обычно отделение осадка центрифугированщ м осуществляют при 6-7 тыс. об/мин, а сушку целевого продукта осуществляют при 20-25оС

За счет предлагаемой совокупности условий обработки поджелудочной железы китов способ обеспечивает получение комплексного ферментного препарата с высоким выходом — 10-11 г белка из 1 кг сырья, а казеинолитической активностью порядка 503 и эстеразной70-80 от исходной.

Пример 1. 1 кг замороженной поджелудочной железы китов оттаивают в течение t,5 ч, измельчают резекционным ножом и дважды гомогенизируют при пропускании через мясорубку с диаметром отверстий 2-3 мм. К полученному гомогенату добавляют 3 л экстрагента: 0,05 М трис-НС1-буфера рН 8,0, содержащего 0,025 М хлористый кальций и 60 мг активатора - кристаллического трипсина из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Смесь оставляют для активации на 24 ч при +2о

+4 С, центрифугируют при 7 тыс. об/мин в течение 40 мин при +2 С и нерастворившуюся часть отбрасывают. К 3 л прозрачного раствора добавляют 6 л ацетона, предварительно охлажденного до

-15 С, при быстром перемешивании. Чео рез 30 мин осадок отделяют от раствора декантацией и центрифугированием

t0 при 6 тыс. об/мин при +2 С в течение

15 мин. Осадок целевого продукта сушат при 20 С, удаляя следы ацетона, Из 1 кг поджелудочной железы кита получают 11,2 r белка. Удельная акти15 вность ферментного препарата, выраженная в ед./мг белка, составляет: 2622 (субстрат-N-бенэоил-Z-тироэин-метиловый эфир), 410 (субстрат-N-бенэоил-Z-аргинин-этиловый эфир), 4,8 (суб2О страт казеина).

Выход по казеинолитической активности составляет 50;;, по эстераэной—

80 .

Пример 2. 10 кг замороженной

25 поджелудочной железы китов оттаивают в течение 2 ч, измельчают и гомогенизируют. К гомогенату добавляют 30 л экстрагента до рН 7,6 и 500 мг активатора — кристаллического бычьего три псина. Смесь оставляют для активации на 24 ч при +2 С и перемешивании.

Смесь центрифугируют при 6,5 тыс. об/мин, к надосадочной жидкости добавляют 50 л ацетона охлажденного до

-20 С. Через 60 мин осадок ферметов отделяют от раствора декантацией и центрифугированием при 7 тыс. об/мин при +4 С в течение 20 мин. Осадок целевого продукта сушат при 25 С.

Иэ 10 кг поджелудочной железы китов получают 108 г ферментного препарата. Выход по казеинолитической активности составляет 553, по эстераэной — 753

Комплекс протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов содержит кроме трипсин- и химотрипсинподобных протеиназ (субстраты - каэеин - рН 7,8/4,8 ед/мг белка); БАЭЭ-й-бензоил-Z-аргинин-этиловый эфир (410 ед/мг белка); БТМЭ-N-бензоил-Z-тирозин-метиловый эфир (2622 ед/мг белка); нейтральные протеинаэы (рН 6,0), в составе которых могут проявляться трипсин и химотрипсин (субстрат гемоглобин - 3,36 ед/мг белка); кислые протеиназы - субстрат гемоглобин (рН 3,0)

1,76 ед/мг белка; пепсиноподобные

5 9813 протеиназы - субстрат-М-карбобензокси-а(;Z-глутамин-Z-тироэин (337 ед/мг белка); аминопептидазы - субстрат лейцил-глицил-глицин (42 ед/мг белка); карбоксипептидазы — субстрат-N-карбобензокси-глицил-Z-лейцин (53 ед/мг белка).

Результаты испытаний активности ферментного препарата, полученного предлагаемым и известным способами, to приведены в таблице.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том, что за

Выход в r из 1 кг сырья (в расчете на белок) Активность белка, ед/мг

БТМЭ БАЭЗ (химотрипсин) (трипсин) Казеин

Способ

Предлагаемый

410

4,8

10,8

2622

3,6

350

Известный

1195

1,5

Формула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

N 546648, кл. С 12 D 13/10, 1975.

2. A.Kaide С. . Natsuoka."Studies

on Fin Whale Proteases", g Biochem.

1969, 66, N 4, 541-548.

Составитель О. Скородумова

Редактор А. Гулько Техред Т.Фанта КорректорН. Король

Заказ 9634/37.Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов путем гомогенизации сырья, экстракции ферментов и их оса- M ждения с последующими активацией полученного комплекса трипсином и сушкой, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода продукта, а также упрощения процес-1О са, экстракцию и активацию комплекса ферментов осуществляют одновременно в буфере рН 7,6-8,0, причем трипсин используют в количестве 4-6 мг на

100 г гомогената, осаждение ферментов осуществляют ацетоном с отделени60 6 счет предлагаемой совокупности условий выход комплексного протеолитического препарата иэ поджелудочной железы китов увеличивается в 3 раза.

Ферментный препарат при сушке практически не теряет казеинолитическую активность.

Предлагаемый способ отличается простотой, он позволяет при использовании небольшого количества этапов получить протеолитический комплекс, обладающий ценным набором ферментов, что особенно эффективно при использовании их в практике. ем полученного осадка центрифугировгнием.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и и .с я тем, что отделение осадка центрифугированием осуществляют при.

6-7 тыс. об/мин.

3. Способ по пп. t и 2, о т л и ч а ю шийся тем, что сушку целевого продукта осуществляют при 20-25 С: