Штамм sтарнуlососсus sарrорнутiсus l-1.10-продуцент уреазы

 

Д. Ю. Юодвальките, А. А. Глемжа, И. l0. Гальвидис и- скас

1 (1 (1)Щ ъ .4 "--- «. rp;-.

ГЕ k l1 Х 4 7:У

Всесоюзный научно-исследовательский институт прик адной = 4Я "

Я °, ° .. знзимоло гни "-" и" (72) Авторы изобретения (7l ) Заявитель (54} ШТАММ STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTlCUS Ь вЂ” 1.10—

ПРОДУЦЕНТ УРЕАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению .нового штамма, используемого для получения фермента уреазы.

Продуцентами уреазы являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи, S

Т-микоплазмы, а также простейшие и растения. Наиболее распространенными продуцентами уреазы являются бактерии. Среди кокков, синтезирующих уреазу известен штамм

Staphylococcus saprophyt icus (11.

Недостатком данного штамма является низкая уреазная активность. При пересевах штамма Staphylococcus saprophyticus уровень био. синтеза уреазы снижался более, чем на 50 o. 15

Наиболее близким к предлагаемому по своим культурально- морфологическим, биохимическим и физиологическим свойствам является штамм Staphylococcus saprophyticus — (2).

Однако известный штамм обладает недостаточно высокой уреазной активностью. Активность данного штамма на мг ацетонового препарата клеток при культивировании в полупроизводственных условиях составляет в среднем 4,5, в колбах — 4,2 еДМницы.

Целью изобретения является получение нового штамма-продуцента уреазы с высокой и стабильной активностью в условиях глубинного культивирования.

Штамм Staphylococcus saprophyticus Q — 1.10 получен путем целевого селекционного отбора наиболее активных вариантов исходного штамма. С целью отбора возможных более

Ъ активных вариантов исходного штамма. Sta

phylococcus saprophyticus 1 — 1 производили рассев бактериальной суспензии на агаризо1 ванную среду в чашках Петри. С целью дифференциации истинных вариантов от модификаций производили 4 — 5-кратное пассирование. Анализ естественной изменчивости исходного штамма показал, что штамм представлен 2-мя типами колоний. Внешний вид колоний представлен на фотографии.

}-й тип колоний характеризуется морфологическими свойствами типичными для ис5,0

2,5

2,0

20,0

20,0

3 99081 ходной культуры Staphylococcus saprophyticus

, — 1, диаметр которых составляет 0,8—

2,0 мм. После 48 ч инкубации штамм в центре колонии образует выпуклость зеленоватого оттенка. Активность вариантов обрач зующих 1-й тип колоний, выращенных глубинным способом составляет 3,4+0,6 ег/мг ацетонового препарата клеток и 8,8 ед/мл культуральной жидкости.

Колонии 2-ro типа характеризуются мень- 1О шим диаметром, достигающим 0,5— - 1,2 мм, более интенсивным блеском, образующийся выступ зеленоватого оттенка в центре колоний носит более расплывчатый характер, Наряду с усвояемостью углеводов, присущей 15 исходной культуре Staphylococcus saprophy—

ticus L — -1 приобретена способность усваивать лактозу. Оптимальный уровень биосинтеза уреазы в клетках происходит при рН среды 6,0-6,5, в то время как оптимальные значения данной величины, способствующие максимальному уровню накопления данного фермента в клетках исходного штамма.—

6,8 — 7,2, Активность вариантов образующих

2-й тип колоний, колебалась в широких 25 пределах от 6,2 до 14 ед/мг ацетонового препарата клеток. Принимая во внимание на возможность стабильного . образования уреазы на высоком уровне, производили

1 дальнейшую селекцию колоний 2-го типа.

В результате проведенной работы был отобран вариант 10, стабильно сохраняющий высокий уровень биосинтеза уреазы при многократных пассированиях, с активностью составляющей 13,6 ед, мг ацетонового препарата клеток.

Штамм Staphylococcus saprophyticus1, — 1.10 хранится в коллекции музея культур микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ В вЂ” 2346.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфологические. Шаровидные бактерии.

В основном одиночные, нередко образуют гроздья, неподвижны, спор не образуют.

Величина клеток односуточной культуры на

МПА — 0,5 — 1,5 мк и диаметре. Клетки хоро45 шо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метиловым синим, грамположительные.

Культурально-физиологические свойства. На

МПА после 24-х часов инкубации при 37 С образуют колонии диаметром 0,5 — 1,2 мм. Ко лонии серовато-белые непрозрачные, гладкие, блестящие, с правильными или иногда с легка неправильными краями. После 48-72 ч в центре колоний образуют расплывчатую выпуклость зеленоватого оттенка. В МПД вначале образуют мутность, которая позднее оседает на дно пробирки. Среда становится и остается прозрачной. На поверхности картофеля не растет.

Штамм является факультативным анаэробом с оптимальной температурой роста +37 С.

Крахмал не гидролизируют. Молоко не пептонизирует. Желатину не разжижает. На среде с минеральным источником азота не растет.

Нитраты восстанавливает в нитриты. Усваивает мальтозу, глюкозу, фруктозу, глицерин, сахарозу, лактозу. Не усваивает арабинозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит и инозит. Устойчив к лизоциму. Содержание

Г+Ц в ДНК колеблется в пределах 305—

35,0 моль.%. Культура хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом и в лиофилизированной состоянии, Пример . Для хранения и выращивания штамма Staphylococcus sapraphyticus — 1.10 используется среда следующего состава:

Натрий хлористый, r

Натрий азотнокислый, г

Калий фосфорнокислый однозамещенный, r

Ферментативный гидролизат дрожжей, г

Кукурузный экстракт, мл

Вода, мл с

Ферментативный гидролиэат дрожжей и кукурузный экстракт суспензируют в

1,5 объеме воды от конечного объема среды.

30%-ным растворов едкого патра доводят до рН 6,0 — 6,5 и стерилизуют при 80" С в течение 20 мин. После охлаждения раствора до комнатной температуры, с целью удаления нерастворимых частиц центрифугировали при 4000 об/мин 40 мин. Надосадочную жидкость водой доводят до конечного объема среды и вносят оставшиеся компоненты, Вторичную стерилизацию полученного раствора производят при 135 С 40 мин.

Для оживления штамм Staphylococcus sap—

rophyticus 1 — 1. 10 засевают на агаризованную среду с чашках Петри и инкубируют при

37 С в течение 20-24 ч. !

В лабораторных опытах оживленную культуру засевают в 750 мл колбы, содержащие

100 мл питательной среды и выращивают на качалке при 180 об/мин при 37 С в течение

20-24 ч.

При культивировании в ферментерах посевным материалом служат клетки, предварительно выращенные в колбах на качалке в течение 10 — 12 ч. Выращивание производят при аэрации 8 м /ч, 37 С в течение 20 — 24 ч, рН в процессе культивирования не поддерживают. Контрольным штаммом во всех опытах

5 990813 6 служит штамм Staphylococcus saprophyticus такое количество фермента под действием

Ь -1. которого выделяется 1 мкмоль аммиака .за

B процессе выращивания определяют уреаз- .1 мин при 30 C. ную активность в высушенных охлажденным ацетоном клетках. Иэ веса ацетонового пре- Было установлено, что максимальное иапарата клеток рассчитывают уровень уреазной копление уреазы в клетках, данного штамма- активности в мл культуральной жидкости.. выращиваемых как в колбах так и в ферАктивность уреазы определяют колориметри- ментере происходит от 12 до 18 ч. Резульеским методом с использованием реагента таты испытаний предлагаемого штамма предНесслера. За единицу активности принимают lo,ставлены в табл. 1.

Таблица 1

Уреазная активность, ед

Количеств

Вес ацетонового llpauapaIa клеток 100 мл культуральиой жидкости пособ культив ро валия

Используемый штамм опытов

На мг ацетон ого препарата клеток а мл культуральной жидкости

St. saprophyticus1 -1

9,2

В колбах

В колбах

250

St. saprophyticusL4I0

St. saprophyticus g- f

18,4Н,8

135

В ферментерах 3

9,6

240

St. ааргорйуМспа1ЛЛО В ферментерах I . 3

18,2

130М2

Полученные данные представлены в табл. 2.

Таблица 2

Уреазная активность, ед

Вес биомассы г/л

Используемый штамм Количество опытов

На мг белка а мг ферентного пре рата

На мл кул туральной жидкости

В фермен иом пЭепа реее

В клеточом экстракте

Я. saprophyticus

4 !

St. saprophyt>cus

I. 10

24,5 25,0 21,5 46,Ы2,0; 16 6 !

Ь I

45 9t3,0 77,015 0 90,0Ы,О 280,0+24,0, Z,7

В конце каждой ферментации из культуральной жидкости бактериальные клетки выделяют центрифугированием при 14000 об/мин в течение 30 — 40 мин. Собранные и взвешенные клетки разрушают механически, исполь- . зуя стеклянные шарики диаметром 0,1—

0,4 мм. Полученный гомогенат клеток центрифугируют ири 14000. об/мин 40 мин, и в

Как видно штамм Staphylococcus saprophy- -:

ticus,- 1.10 в культуральной жидкости накапливает в два раза больше уреазы. чем исходный штамм Staphylococcus saprophyticus — 1. Специфическая активность в клеточном экстракте нового штамма приблнзитель— 5$ но в 4 раза превышает специфическую активность в клеточном экстракте исходного штамма.

3,9 i 0,6

13,6 Т 1,5

4,0М 7

14,0 1,2 надосадочный жидкости измеряют уреазную активность и концентрацию белка. Белок определяют методом Лоури. Используя в качестве органического осадителя этиловый спирт из клеточного экстракта выделяют ферментный препарат уреазы.

Использование штамма Staphylococcus aaprophyticus 1 — 1.10 позволяет в 3,2 раза повысить уреаэную активность сухого ферментного препарата и в 5 раз .специфическую активность выделенной уреазы, по сравнению с использованием исходного Штамма Staphylo

coccus saprophyticus, — 1. Выделение уреазы и культивирование штамма в ферментерах не меняет материальных и трудовых затрат

Составитель И. Привалова

Техред Т.Маточка Корректор У. Пономаренко

Редактор Г. Волкова

Заказ 57/37 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 990813 8 на производство данного фермента по срав- во ВНИИПЭ иэ клеток Staphylococcus saproнению с использованием исходного штамма phyticus 1, — 1.10 составляет 30000 руб.

Staphylococcus saprophyticus 1„-1, поэтому применение нового штамма позволяет снизить удельную (руб-ед. уреазной активности) 5 Штамм Staphylococcus saprophyticus 1 - 1.10 себестоимость производимой уреазы. Себесто- (коллекция Музея культур микроорганизмов имость уреазы выделенной из клеток Staphy- института ВНИИгенетика, коллекционный но1ococcus saprophyticus g — 1.10 составляет мер ЦМПМ В вЂ” 2346) — продуцент уреаэы.

0,05 руб/1000 ед. по сравнению с 0,10 руб/ Источники информации, 1000 ед ферментного препарата, выделенного 10 принятые во внимание при экспертизе из исходного штамма, По имеющимся запро- 1. Чап WyK and Steyn Р. Journal of be— сам ориентировочная годовая потребность в neral Microbiology, 91,2, 225 — 232, 1975.

Х1 пятилетке — 600000000 ед. Ожидаемая 2. Авторское свидетельство СССР 5986, годовая экономия от производства уреазы кл. С 12 и 15/00, 1979 (прототип),