Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из морепродуктов

 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕН КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЯИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ МОРЕПРОДУКТОВ путем гомогенизации сьфья и осаждения ферментов, отличающийся тем, что, с целью расшнрения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта, в качестве сырья использ т пилорические придатки камбалы, а осаждение ферментов ведут ацетонсм при соотношении гомогенат ацетон 1:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

И ЛЮМ

РЕСПУБЛИК,У(5П С 12 N 9/64

ГОСУДАРСТВЕННО(Й КОМИТЕТ СССР !, -- -,, ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И (ЛНРЫТИЙ

1

1 ..."-„ :.;;„;„,, „

ЩД Ц 0 ...,,)

К АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3409407/28-13 (22) 12.03.82 (46) 23 07.83. Вюл. В 27 (72) И.В. Колодзейская, С.A. Кудинов, Л.М. Эпштейн и В.Н. Акулин (71) Тихоокеанский научно-исследова тельский институт рыбного хозяйства и океанографии, Ордена Трудового Красного Знамени инстйтут биохимии им. A.B. Палладнна (53) 577.15.07(088.8) (56) 1. Патент CltIA Р 3313711, кл ° 195-62, on.1967.

2. Авторское свидетельство СССР

9 412248, кл. С 12 Н 9/48, 1972.

3 ° Авторское свидетельство СССР .по заявке М 2904874/28-13, кл. С 12 D 13/10 1980...SU.„1.030409 А (54) (57) СПОСОВ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ NOPEПРОДУКТОВ путем гомогенизации сырья и осаждения Ферментов, о т л и ч а в» шийся тем,,что, с целью расширения сырьевой базы и повьааения вщсода целевого продукта, в качестве сырья используют пилорические придатки камбалы, а осаждение Ферментов ведут ацетоном при соотношении гомогенат ацетон 1г(2-2,3).

1030409

Изобретение относится к технологии получения протеолитических ферментов и может быть использовано в ферментной, химической и пищевой проьышленностях в частности для ускоре.ния процессов созревания соленой про-р5 дукции из рыб и производства консервов.

В настоящее время ферментные препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности 10 для гидролиза белковых субстратов из сырья животного и растительного происхождения.

Возросшие потребности народного хозяйства в ферментных препаратах 15 обуславливают необходимость поиска новых источников сырья для их получения и разработки эффективных способов производства Ферментов.

Известны способы получения фер ментных препаратов преимущественно из сырья животного происхождения (1 ).

Такие способы, основанные на обработке измельченного сырья иэ органов животных, выделении ферментов путем осаждения и многостадийной очистки Ферментной Фракции,:являются экономически невыгодными из-эа низкого выхода ферментных препаратов из дорогостоящего сырья °

Известны также более дешевые способы получения протеолитических ферментов из микробиологического сырья,,.основанные на выращивании высокопродуктивных штаммов микроорганизмов и выделении иэ них ферментов путем осаждения белков, их фракционировании и очистке Ферментных фракций (2 ).

Однако получаемые этим способом комплексы пригодны только для проведения более глубокого гидролиза бел- 4О ков (до аминокислот), а не до низкомолекулярных пептидов, что ограничивает их применение при получении рыбных продуктов.

Наиболее близким по технической 45 сущности к предлагаемому способу яв" ляется способ выделения комплекса протеолитических Ферментов из морепродуктов, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса кальмара тихоокеанского и криля новозеландского в вод- ном растворе при соотношении ткань» во. да, равном (1 г 1) - (1: 1, 3) у очистку .полученной жидкой Фазы от примесей путем введения сульфата аве ония до насыщения 0,8; отделение осадка цен трифугированием при 8000 об/мин; растворение Фермецтов в дистиллированной воде; диализ и лиофилизацию целевого продукта (3 j.

Недостатком известного способа является недостаточно высокий выход целевого продукта. В процессе выделения теряется часть ферментов и ухудшается качественный состав получаемого ферментного комплекса. Кро- 65 ме тЬго, необходимоСть заготовки сырья далеко в море и его длительная транспортировка вызывают потерю активности фермента.

Целью изобретения является расширение сырьевой базы, увеличение вы- хода Ферментов, входящих в комплекс и обладающих широким спектром действия.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения комплекса протеолетических ферментов из морепродуктов путем гомогенизации сырья и осаждения ферментов, в качестве сырья используют пилорические придатки камбалы, а ферменты осаждают ацетоном при соотношении гомогенат: ацетон 1:(1-2,3).

Использование в качестве сырья для .осуществления предлагаемого способа отходов морепродуктов — пилорических придатков камбалы экономически выгодно, так как оно имеется в достаточном количестве в связи с планами рыбной промышленности СССР и работой рыбкомбинатов страны.

Установлено, что выделяемый комплекс представляет собой ценный на-, бор ферментов, в частности щелочную, нейтральную и кислую протеинаэы, аминопептидаэы и карбоксипептидазы.

Совокупность указанных условий позволяет получить иэ отходов морепродуктов по простой технологии ферментный комплекс, имеющий ценный набор ферментов, сохранивших свою нативную активность с высоким выходом.

Пример 1. В качестве исходного сырья используют пилорические придатки камбалы вида Hyppoglosoides alassodon. 1 кг выделенных из. свежей камбалы придатков гемогенизируют на микроизмельчителе тканей

РГ-2(МРТУ"42-1505-63) со скоростью

5000 об/мин при 2 С до получения однородной массы.

К 1 кг охлажденного материала добавляют два объема (2 л) ацетона, охлажденного до -15 С, при быстром о перемешивании.

Через 15 мин полученный материал тщательно отжимают и высушивают при

20 С, удаляя следы ацетона. о

Из 1 кг пилорических придатков камбалы получают 200 r препарата.

Выход о казеинолитической активности — 603., Удельная активность, выраженная в ед/мг белка, равна: 514(субстрат

ВТИЭ-бензоил-L-тирозин метиловыф эфир); 222(субстрат БИЭЭ-бензоил-Lаргииин этиловый эФир); 0,76 (субстрат каэеин).:

При сушке протеолитическая активность ферментного препарата сохраняется полностью.

1030409

Пример 2. В качестве сырья используют пилорические придатки 1 камбалы вида Cleisthenes herzensteini.

1 кг пилорических придатков камбалы гомогениэируют при 6000 об/мин при 4 С до получения однородной .массы.

К 1 кг охлажденного гомогената добавляют 2,3 л охлажденного до -20 С о ацетона при перемешивании. Через

20 мин осадок отжимают, а затем вы- 10 сушивают при 25 С, удаляя следы ацетона,.

Полученный комплекс ферментов со- держит щелочную, нейтральную и кислую протеиназы аминопептидазы, кар- 5 боксипептидаэы. Из 1 кг пилорических придатков камбалы получают 210 г препарата. Выход по казеинолитической активности составляет 66%.

Пример 3. В качестве сырья используют пилбрические придатки камбалы вида Limanda Ьегзепз е1п1.

1 кг пилорических придатков камбалы гомогенизируют при 5500 об/мин (Выход, г преарата з 1к сырья

Общая активность, рассчитанная на 1 кг исходного сырья, ед.

Комплексный препарат протеолитическая, при рИ

7 8 6,0 3,0

Карбо-й ксипептидазная эстеразная амино-i пепти-.(азная

-(БАЭЭ

БТМЭ

15200,12600 7050 10794000 4662000! 588000 378000

Из гепатопанкреаса кальмара и криля (по известному способу) 28

1120,1575 1072 43126 23320 8400 следы

Полученные результаты свидетельствуют О тОмр чтО из 1 кГ исхОДнОГО сырья (пилорические придатки камбалы) можно получить протеолитический комплекс, у которого ферментная активность на порядок выше (протеолитической — рН 7,8; 6,0; 3,0), на не« сколько порядков,.выше (эстеразной: химотрипсин- и трипсинподобныйу пептидазных) по сравнению с известным способом получения комплекса протеолитических ферментов.

Комплекс протеолитических ферментов из пилорических придатков камбалы содержит кроме трипсин- и химотрипсинподобных протеиназ (субстраты — каэеин - рН 7,8/0,76 ед/мг белка)1 БАээ-м-бензоил-с(;аргинин-этило- 60 вый эфир (22 ед/мг белка); БТМЭ- Ч бензоил-о(.-тиpoэин-метиловый эфир (514 ед/мг белка); нейтральные протеиназы (рН 6,0), в составе которых могут проявляться трипсин и химотрип-65

Из пилорических придатков камбалы (по предлагаемому способф 200 при 2 С до получения однородной массы.

К 1 кг охлажденного гомогената добавляют 2,0 л охлажденного до -15 С о ацетона при перемешивании. Через

15 мин осадок отжимают и высушивают при 25 С.

Полученный комплекс ферментов содержит щелочную, нейтральную и кисутую протеинаэы, аминопептидазы,. кар-. боксипептидаэы.

Из 1 кг пилорических придатков камбалЫ получают 205 г препарата. Выход по казеинолитической активности составляет 65%.

Проведены сравнительные испытания активности ферментного препарата, полученного из пилорических придатков камбалы, предлагаемым,и известным способами.

Выход препарата по общей казеинолитической активности Доказан в таблице. син (субстрат гемоглобин — 0,60 ед/мг белка);кислые протекназы - субстрат гемоглобин (дН 3,0) - 0,35 ед/мг белкауаминопептидазы - .субстрат лейцкл-глицил-глкцин (28 ед/мг белка); карбоксипепткдаэы - субстрат-N-карбобензокск-глицин-лейцин (18 ед/мг белка).

Предлагаемый способ отличается простотой, он позволяет при использовании небольшого количества этапов получить протеолктический комплекс, обладающий ценным набором ферментов, что особенно эффективно при испольЗОВаНИИ ИХ В ПРаКтИКе.

Из 1 кг сырья получено 200 г препарата (20,6 r белка), содержащего

152000 ед. общей казеинолитической активности, а по известному способу активность составляет 1120 ед.

KpoMe òîãî,. химотрипсин- и трипсиноподобная активность выше, чем

1030409

Составитель О. Скородумова

Редактор О. Половка Техред С,Мигунова Корректор A. Повх

Заказ 5134/29

Тираж 523 Подписное

ВНИИПЙ Государственного комитета CCCP по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4 при известном способе получения комплекса протеолитических ферментов.

Ферментный препарат прн сушке практически не теряет каэеинолитическую.активность.

Благодаря использованию ацетона достигается более полное удаление липидов, тем самым улучшается товарный вид ферментного препарата,устра,няется специфический рыбный запах.