Способ получения оптически активных производных цис-7-амино- 1-азабицикло-(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЧиС-1- , -АМИНО-1-АЗАБИ1ШКЛО-( 4,2,0) -ОКТ- 2-ЕН-8-ОН-2-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ общей формулы Л 1 где R - водород или С -Сд-алкил; Rg - водород или хлор, атомы водорода в положении 6 и 7. находятся в Цис -конфигурации , заключсиощййся в том, что соединение общей формулы t X СООН где R - фенил или оксифенил; X - водород или аминогруппа; Rj- имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с энзимом, способным к оптически селективной . реакций деацилировання я получаемым. из микроорганизмов, принадлежащих . к роду.:АегЬзпопаз, Achromobacter, ., Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes , Escher ichia, Xanthonranas, Kluyverai Gluconobacter ClostridiDm , Coraamonas, Conynebacteriom, Sarcina, ,StaphylQcoccus, Stieptomyces , Spi «illum, Nocardia, Bacillus, Pseudononas, FlaVobactei ium, Bvevibacteirium , Pfotaniinobacte r, Pnoteus, B.eneckea, Micrococcus, Micoplana и Rhodopseudojnonas. 2. Способ no П. 1, о т л Ич а ю щ и и ся тем, что указанный энзим используют в виде раствоiра очищенного энзима, клеточного тела , извлекаемого из питательной среды клеточной суспензии, суспензии разорванных клеток, бесклеточО ного экстракта или питательной сре-ды микроорганизмов. сх Приоритет по признакам: 4 10.02.79 при R - водород или С.-С -алкил; Rj - водород; R - фенил; CD Х- водород или аминогруппа. 14.11.79 при R - водород или C.-Q -алкил; R2. - тводород или хлор; R - фенил или оксифенил; X - водород или аминогруппа.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУбЛИН

gag С 07 D 471/04 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР

ho дялАм изОбРетений и ОтнРытий

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ,:,-:,;.:::,,: „: и

Н ПАТЕНТУ (21) 2882401/23-04 (22) 08.0,2.80 (31) 14533/79, 146488/79 (32) 10.02.79, 14.11.79 (33). Япония (46) 07.08.83. Бюл. Р 29 (72) Тадаси Хирата, Юкио Хасимотс, Такехиро Огаса, Сичеру Кобаяси, Икуо Мацукума, Казуо Кимура, Сигео Ксие и Сейго Такасава (Япония) (71) Киова Хакко Когио Ко., Лтд (Япония) (53) 547. 712. 22. 07 (088. 8) (56) 1. Выложенная заявка ez r

9 291178б, кл. С 07 D 471/04, .опублик. 1979. !.(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ OGTHЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Япс -7-:; -АКИНО-1-АЗАБИБИКЛО- (4,2 0)-OKT-2--

-ЕН-8-ОН-2-КАРВОН0ВОА КИСЛОТЫ об щей формулы дp я1 где R .- водород или С» -С4-алкил, R - водород или хлор, атомы водорода в положении б и 7 находятся в аеас -конфигурации, заключающийся в том, что соединение общей формулы

О H. . R-Сп;С-X

Х, у

0 2

СООН,SU„„10 4 07 А где R - фенил или оксифенил, Х вЂ” водород или аминогруппа, Й»и R2- имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с энэимом, способным к оптически селективной . реакции деацилирования и получаеьым . из микроорганизмов, принадлежащих . к роду:Aегоmonas, Achronobacter, Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Escherichia,. Xanthomonas, KIuyvera; G1uconobacter, ClostI"i"

dI.IIm, Comamonas, CoI ynebacteI ium, Бае cina, Staphylococcus, S i eptomyces, SpiI"ilium, Nocarcjia, Bacillus, PseucTomonas, FlavobacteI BI" evibacteI ium, Protaminobacte r, Р oteus,,Beneckea, М1сгococcus, Micoplana I и RhodopsIeudomonas.

2. Способ по и. 1, о т л и. ч а ю шийся тем, что указанный энзим используют в виде раство ра очищенного энзима, клеточного те:ла, извлекаемого из йитательной среды клеточной суспензии, сусцен-. зии разорванных клеток, бесклеточного экстракта или питательной сре-

-ды микроорганизмов.

Приоритет по признакаме

10.02.79 при Й» — водород или С -(, -aJlkHJIz Кт ВОДОРОД R фенилр

»

Х - водород или аминогруппа.

14.11.79 при R» - водород или С„-С

-алкил, R z — водород или хлор,"

R - феннл или оксифенил, Х - водород или аьщногруппа.

1034607

Изобретение относится к получению новых производных Mac — 7-амино-1-азабнцикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты общей формулы

С00Н

10 где R - водород или С -С -ал1сил,"

1 (4, R — водород или хлор, атомй водорода в положении б и

7 находятся в йисконфигурации, 15 которые обладают высокой биологической активностью и могут найти применение в медицине.

Известны карбацефемные соединения, имеющие различные заместители в поло= жении 3, 4 и 5 j1). 20

Однако эти соединения получают синтетическим методом с использованием оптически неактивных исходных соединений.

Цель изобретения — разработка но-. 25 вого способа получения неописанных соединений, обладающнх ценными фармакологическими свойствами.

Поставленная цель достигается согласно способу получения оптичес- 30 ки активных соединений общей формулы, t,2

R2 где R - водород -или С4-С -алкил;

R " водород или хлор, 2 атомы водорода в положении б и 7 находятся.в ц и - конфигурации, заключающемуся в том, что соединение

40 общей формулы

45 о н

К-CH- C- И - Rt

В2

С00Н

1 где R — фенил или оксифенил, Х вЂ” водород или аминогруппа, Rg и Ц имеют укаэанные значения, подвергают взаимодействию с энзимом, способным к оптически селективной реакции деацилирования и получаемым иэ микроорганизмов, принадлежащих к роду Aегоmonas, Achromobacte r, Азйй obacte г, Acetobacter, Alcaligenes, Escherichia, Xanthomonas, 60

Kluyve та; Gluconobacteт, Clostr idium

Comamonas, Cor yneb ac ter i um, Sar c ina, Staphylococcus, St r ep tomyces, Spirillum, Nocardià, Bacillus, pseu8omonas, &1ачопас егium, Brevi- 65

bac ter ium, Р otaminobacte r, Proteus, Beneckea, Micr ococcus, Micoplana, и Rhodopseudomonhs;

Указанный энзим используют в виде раствора очищенного знзима, клеточного тела, извлекаемого иэ питательной среды клеточной суспенэии, суспензии разорванных клеток, бесклеточного экстракта или питательной среды микроорганизмов.

Полученные оптически активные соедйнения обладают сильной противомикробной активнОстью ацильных соединений по сравнению с соответствующим оптически неактивным dl-соединением.

Эти соединения являются особенно пригодными в качестве промежуточных веществ при получении оптически активных ацилированных соединений, которые являются сильными противомикробными агентами.

Пример1.

1-1. Получение разрушенной кле-.

;точной суспензии.

1 а) Культивирование микроорганизма,обладающего способностью к стереоселективному деацилированию.

В качестве посевного штамма используют Kluyvera с1йгophila.

В качестве посевной среды исполь.зуют водный раствор, содержащий,8: полипептон.1, дрожжевой экстракт 1; мясной экстракт 0,5; глутамат натрия

0,5 и хлористый натрий 0,25р доведенный до значения рН 7,0 с помощью 5 н. раствора NaOH. Петлю с посевным штаммом инокулируют в 10 мп посевной среды и большой пробирке емкостью

50 мл, культивирование проводят при

30 С в течение 24 ч. Весь посевной бульон инокулируют в 300 мп культуральной среды в колбе Эрленмейера . емкостью 2 л и при 30 С и встряхивании проводят культивирование. Состав основной культуральной среды идентичен аналогичному для посевной среды. б) Получение разрушенной клеточной суспензии.

После культивирования в течение

24 ч культуральный бульон поцвергают центрифугированию с целью получения клеточных тел. Клетки промывают дважды 50 мл 0,98-ного солевого раствора и суспендируют в

1/30M фосфатном буферном растворе до концентрации 40 мг сухого веса в 1 мл. Затем 10 мп клеточной суспензии вводят в большую пробирку на 50 мл и подвергают ее ультразвуковому иэмельчению в течение 2 мин при 200 В для того, чтобы получить разрушенную клеточную суспензию. При этой обработке испопьзуют ультразвуковой дезинтегратор модель

UR200P.

1-2. Получение раствора субстрата.

1034607

Период реакции, мин

Выход (молярное 35 отношение) ф

Количество образовавшегося соединения (1-1), мг/мл

10

2,0

20

2,6

40

2,9

3,0

3,0

Как видно из табл. 1, реакция и выход становятся стационарными после того, как степень превращения, 45 смеси оптически активных изомеров достигнет 50% (молярное отношение). 1-4. Выделение и очистка целевого соединения.

После завершения реакции клетки удаляют центрифугированием реакционной смеси, Надосадочную жидкость подкисляют до рН 3,0 с помощью 2н. раствора соляной кислоты и подают в колонку (2,6 см ширина, 51 см -высота), заполненную 270 мл ° ЭЫ смолы "Диаион HP-10". Элюирование проводят деионизированной водой и элюат собирают в виде 5 мл фракций. Целевое соединение элюировалось во фракции от 280 до 315 мл. . 60

Эти фракции концентрируют при пониженном давлении, лиофилизуют и растворяют в неболыиом количестве смеси воды и метанола (50:50 по объему), Раствор подают в колонку (1,6 см 65

На этой стадии 200 мг (+)-КШ -7-фенилацетамидо-1-азабицикло(4,2,0)— .окт-2-ен-8-он-карбоновой кислоты (термин g%C относится к стереохимии в положениях 6 и 7, ть же самое используют в последующем), добавляют

9 мл 1/ЗОМ фосфатного буфера (рН 6,5

Поскольку это соединение не растворяется, небольшимн порциями добавляют 2 н. раствор NaOH и снова доводят рН раствора до 6,5 для того чтобы растворить это соединение.

Окончательно добавляют деионизированную воду, получая 10 мл раствора.

1-3. Энзимная реакция.

На этой стадии 10 мл упомянутой 15 разрушенной клеточной суспензии добавляют к 10 мл раствора субстрата и проводят энзимную реакцию при 30 С в течение 80 мин.

Протекание реакции во времени 20

-показано в табл. 1.

T а б л и ц а 1 ширина, 64,5 см высота), заполненную.

130 мл смолы "Сефадекс 1.H-20". Элюированне -проводят смесью метанола и воды (50:50) . Элюат собирают в виде

5 мл фракций. Фракции от 65 до 85 мл объединяют и концентрируют при пониженном давлении для того, чтобы удалить метанол. Затем лиофнлизуют остаток, получая 48 мг белого порошка °

Свойства продукта следующие.

Поглощение в ИК-спектре (КВ ), Ф. „пкс, см 1:1800, 1790, 1775, 1640, 1620.

ЯМР"спектр (1ООИ D O-DSS) м.д.г

6,46 (1H, Дублеты, 1 = 3,5 и 4,7 Гц)

4,88 (1Н, д. I = 5,2 Гц); 4,06 . (1Н, мультиплет); 2,5-1,5 (4Н, м).

Обнаружено, что это соединение содержит один моль хлористого загорода и воды. Свойства этого соединения хорошо согласуются с соответствующими 61-соединениями..:. Величина оптического вращения составляет

Ц = + 48 (C=0,5, в 1М растворе фосфатного буфера (рН 7,0)), эта величина хорошо согласуется со значением 4ДЯ = 48,5 (C=0,5, в

1М растворе. фосфатного буфера (рН

7,0)), приведенным в примере 2.

Это соединение дает единственкое пятно положительного нингидрина при величине Rf 0,22 на тонкослойной хроматографической силикагелевой пластине, растворитель для прояаления — изопропанол:уксусная кислота: вода 4:1:1. Значение Rf совпадает с таковым для оптически неактивного

С)1-соединения.

Пример 2. Получение (+)

2-1. Получение разрушенной клеточной суспензии по Методике примера 1-1 °

2-2. Получение раствора субстраTaе

На этой стадии 100 мг (+)-ЦМС -7- f(R)-2-феннл-2-амнноацетамидо).-1-аз абицикло (4, 2, О) -окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты растворяют в

5 мл 1/30 М фосфатного буферного раствора (рН 6,5) .

2-3. Энзимная реакция.

На этой стадии 5 мл разрушенной клеточной суспензии, упомянутой вы,ше, добавляют к 5 мл раствора субстрата и проводят энзимную реакцию— при 30 С в течение 24 ч.

2-4. Выделение и очистка.

По методике примера 1-4 получайп

46 мг белого порошка. Свойства этого соединения .хорошо совпадают с соединениями, полученными в примере 1.

Я) Q = 48,5 (С=0,5, в 1И фосфатном буферном растворе, рН 7).

1034607

Пример 3. Получение (-) -/ac

-7 р -амино-4 aL-метил-1-азабицикло(4,2,0) -окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты, 3-1. Получение разрушенной клеточной суспензии.

Повторяют методику примера 1-1.

3-2. Получение раствора субстра- . та.

Повторяют методику примера 1-2 с Щ тем исключением, что используют (<)- pic -7 Р-феиилацетамидо-4 о(-метил-1-аз абицикло (4, 2, О) -окт-2-ен-8-, «он-2-карбоновую кислоту.

3-3. Энзимная реакция.

Повторяют методику примера 1-3 с тем исключением, что используют полу- ° ченные в разделах 3-1 и 3-2 разрушенную клеточную суспенэию и раствор оубстрата. Коэффициент реакции становится стационарным через 1 ч. Реак->® цию продолжают в течение 120 мин.

Выход (f ) субстрата составляет SÎÚ (молярное отношение) ..

3-4. Выделение и очистка целе@ого соединения. 25

Повторяют почти полностью методику примера 1-4. Go завершении реакции клеткй удаляют йз реакционной смеси центрифугированием. Жидкость над осадком подают в колонку (2,5 см 3Q шириной, 46 см высо7ой), заполнен- ную 220 мл смолы "Диаион HP-10".

Элюирование проводят деиониэированной водой и элюат собирают в виде 5 мл . Фракций. Целевое соединение элюировалось но фракции от 200 до 270 мп.

Эти фракции концентрируют.при пониженном давлении, лиофилизуют и растворяют в небольшом КоличестВе воды и метанола (50:50). Раствор подают на колонку (ширина 1,6 см, высота 64,5 см), заполненную 130 мл смолы "Сефадекс ЬН-20", и проводят элюирование смесью воды и метанола (50с50), Элюат собирают в 50 мп фракции. Фракции от 65 до 80 мл 45 объединяют и концентрируют, удаляя метанол. Затем лиофилизуют остаток, получая 30,5 мг белого порошка, свойства которого приведены ниже.

HK-спектр (КВГ) $p„qg, см 1 1800, 1770 (плечо), 1760 (пл.), 1740, 1680 1630.

ЯМР-спектр (100M Dg0-0$$),м.д.с

6,16 (1Hi дубл ° t ) = 5,1 Гц);

4,52 (1H, дубл., 1 = 4,9 Гц), 3, 86 (1Н-, мульт.) p 2,64 (1Н, мульт.) j

1,9-1,4 .(2Н, мульт.), 1,10 (3H, дубл.

7.3 Гц).

Обнаружено, что это соединение представляет собой калиевую соль, ®) содержащую 2 моля воды. Свойства этого соединения хорошо совпадают. с соответствующими df -соединениями. Это соединение дает единственное пятно положительного нингидряна при, g$ значении Rf 0,33 на тонкослойной хроматографической силикагелевой, пластинке (используют тот же силикагель, что и в примере 1-4). Вели-: чина Rf совпадает с такой же для оптически неактивного 86 -соединения.

Оптическое вращение (ñ 3Я =-30 (C0,5, в 1М фосфатном буферном растворе). Эта величина хорошо соглаl суется с приведенной в примере 4.

= -30,8 (C=0,5 в 1М фосфат, ном буферном растворе, рН 7,0), е

Пример 4. Получение (-)-Мас -7 р -амино-4d. †ìåò-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты (.альтернативный метод).

4-1. Получение разрушенной клеточ» ной суспензии.

Повторяют методику примера 3-1.

4-2. Получение раствора субстрата. (+ )- uc-7- ((й) -2-Фенил-2-аминоацетамидо1-4 сС-метил-1-азабицикло (4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновую кислоту (100 мг) "растворяют в 50 мп

1/30M фосфатного буферного раствора (рН 6,5).

4-3. Энзимная реакция.

Как и.в примере 1-3, добавляют .5 мл разрушенной клеточной суспензии, описанной выше, к 5 мя раствора субстрата и знзимную реакцию проводят при 30 С в течение 24 ч.

4-4. Выделение и очистка целевого продукта.

Повторяют методику примера 3-4, получая 55 мг белого порошка. Свойства соединения совпадают с таковыми, указанными в примере 3, Оптическое вращение с Д Д = -30 8 (С=0,5, в 1М Фосфатном буФерном раст-. воре, рН 7,0).

П р "и м е р 5; Получение (+) -ЯйС"7-амино-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-Он»2-карбоновой кислоты (альтернативный метод).

5-1. Культивирование микроорганизмов.

В качестве среды используют водный раствор, содержащий,Ъг мясной экстракт 1; пептон 1; хлористый натрий 0,3 и дрожжевой экстракт 0,5, подщелачивают его до рН 7,2 с помощью 5н. раствора NaOH. Петлю с посевным штаммом инокулируют в 30 мл посевной среды в колбе Эрленмейера емкостью 300 мп и проводят культивирование при 30 С в течение 24 ч.

Клеточные тела, полученные центрифугированием .культурального бульона, проиавают 5 мп 0,,9Ъ-ного солевого раствора и снова выделяюь иэ него клетки центрифугированием. Кпет ки суспендируют в 1/ЗОМ растворе фосфатного буфера (рН 7,0) в концентрации 20 мг сухого веса в 1 мл.

S-2. Получение раствора субстрата. (+)-4 6-7-g(R)-2-фенил-2-амикоацетамидо3-1-аэабицикло(4,2,07-окт10 3.4607

-2-ен-8-он-2-карбоновую кислоту (150 мг) растворяют в 15 мп 1/ЗОМ раствора фосфатного буфера (рН 7,0)

5-3. Энзимная реакция.

Смешивают по 0,5 мл каждой клеточной суспензии, полученной как в примере 5-1, и 0,5 раствора субстрата и смесь подвергают взаимо= действию при ÇÎ C в течение 20 ч.

5-4. Идентификация продукта.

Возможно проведение анализа диастереоизомеров (+)-gac -7-((R)-, -2-фенил-2-аминоацетамидо3-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен -8-он-2-карбоновой кислоты с помощью высокоскоростной-жидкостной хроматографии. В этом примере диастереоизомер количественно определяют этим мето.дом. Количественное определение

7-амино-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-.ен-8-он-2-карбоновой кислоты, полученной в примере 5-3, возможно по той же методике.

В реакционной смеси остается непревращенным более полярный ди- . астереоизомер, т.е. Я -g &7- ((Щ-2-фенил-2-аминоацетамидо3-1-азабицикло (4, 2, 0) -окт-2-ен-8-он-2-карбоновая кислота, а количество менее .полярного изомера, т. е. (+)- цы -7- t (R) -2-фенил-2-аминоацетамидо (-1-азабицикло (4, 2, О) -окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты, уменьшает-. ся. В соответствии. с этим уменьшением количества субстрата образуется пик (+)--Attic -7-амино-1-азабицикло (4, 2, 0) -окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты. Расхождение в убыли (+)-Эйли-7-(,(К) -2-фенил-2-аминоацетамидо1-1-азабицикло(4,2,0)

-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты и образовании (+)"свисс-7-амино-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты зависит от, наличия Р -лактамазы в реакционной системе.

Пример 6. Получение.(+) -QQC

-7-амино-1-азабицикло (4, 2; О).-окт -2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты .(альтернативный метод).

Микроорганизм Clost iciium añåtobutylicum IF0 инокулируют в 100 мп бульона картофельного крахмала (продукт лаборатории "DIFCO") . Воздух в ферменторе вытесняют стерилизованным газообразным азотом и ферментор закрывают. Культивирование проводят при ЗО C в течение 48 ч. . После культивирования выделяют клетки, промывают их физиологическим солевым раствором и суспендируют в 2 мп 1/ЗОМ буферного раствора фосфата калия (рН 7,0) . Смешивают 0,5 мл раствора субстрата, полученного как в примере 5-2, и

;клеточной суспензии-и подвергают их взаимодействию при 30 С в течение 20 ч. За ходом реакции следят,такой же, как и состав посевной среды. б) Получение разрушенной клеточной суспензия .

После культивирования в течение

24 ч культуральный бульон подвергают центрифугированию с целью получения клеточных тел. Клетки проьывают дважды по 50 мл солевым раствором (0,9О и суспендируют в концентрации 40 мг сухого веса в 1 мп

1/ЗОМ фосфатного буферного раство-. ра(рН 8,0).

7-2.. Получение раствора субстрата.

На этой, стадии 200 мг (1)-циГ-7-фе нил ацет амидо- 3-хлор-1- а з абицик- ° ло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой

° кислоты, полученной как в примере 7, добавляют к 9 мп 1/ЗОМ раствора фосфатного буфера (рН 8,0) . Поскольку это соединение не растворяется, то добавляют небольщими порциями

2н. раствор NaOH и смесь снова доводят до рн 8,0 для того, чтобы растворить соединение. Окончательно добавляют деионизированную воду, .чтобы получить 10 мп раствора65 7-3. Энзимная реакция. как в примере 5-4. Непревращенной остается (-) -Цйс-7-((Н)-2-фенил-2-аминоацетамидо)-1-азабицикло-(4,2,0)

-окт-2-ен-8-он-2-карбоновая кислота, уменьшается только количество (+)5 -йПс -7. — g(R)-2-фенил-2-аминоацетами до1-1-азабицикло (4,2,0} -окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты. Убыль этого вещества составляет 1,0 мг, при этом образуется 0,2 мг (+)19 -7-амино-1-аэабицикло (4,2,0) -окт-2-ен-8-,он-2-карбоновой кислоты.

Пример 7. Получение (-) QCcO-7-амино-Ç-хлор-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2 карбоновой кисло15 тЧ

7-1. Получение разрушенной клеточной суспензии. а) Культивирование микроорганизма, обладающего способностью к сте, реоселективному деацилированию.

В качестве посевного штамма используют Kl uy ver a.

В качестве посевной среды,используют водный .раствор, содержащий,Ъ: полипептон 1; дрожжевой экстракт 1 мясной экстракт 0 5; глутамат натрия 0,5 и хлористый натрий 0,25, .который подщелачивают до рН 7,0 н. раствором ИаОН. Петлю с посевным штаммом инокулируют в 10 мл посев30 ной среды в большой пробирке емкостью

50 мп и проводят культивирование . при ÇO С в течение 24 ч. Весь посевной бульон инокулируют в 300 мп куль туральной среды в колбе Эрленмейе35 ра на 2 л и проводят культивирование при 30 С со встряхиванием.

Состав основной культуральной среды

1034607

Выход (молярное отношение), Ф

Период реакции, мин

Количество образовавшегося соединения (1-1), мг/мп

10

1,3

28

31

36

1,8

2 0

2,3

2,4

Составитель И. Бочарова

Редактор Н. Гунько Техред M.Òåïåð, Корректор Г. Огар

Заказ 5651/61 Тираж 418 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4

На этой стадии 10 мл упомянутой разрушенной клеточной суспензин добавляют к 10 мп раствора субстрата и проводят энзнмную реакцию при

40 С в течение 80 мин.

Протекание реакции во времени показано в табл. 2.

Т а б л и ц а 2

7-4. Выделение и очистка целевого соединения.

После завершения реакции клетки выделяют из реакционного раствора центрифугированием. Жидкость над

"осадком концентрируют при пониженном давлении, получая 5 мп раствора. Этот раствор подают "в колонку (ширина 1,75 см, высота 42 см), за10 полненную смолой "Диаион HP-10".

Элюирование проводят деионизированной водой. Целевой продукт элюи руют во фракции от 90 до 120 мл.

Эти фракции концентрируют при пони 5 женном давлении, получая 2 мп раствора, который подкисляют до рН 3,5

1н. раствором соляной кислоты для того, чтобы выпали кристаллы.

Эти кристаллы выделяют фильтрацией, opoMitBBIQT небольшим количеством метанола и высушивают, получая

38 мг белого порошка.