Способ определения фагоцитарной активности клеток крови

 

СНОСОВ ОНРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ . АКТИВНОСТИ КЛЕТОК КРОВИ путем инкубиробания суспензии лейкоцитов с фагоцитируеквл4 агентом, о т л и ч аю щ и и с я тем, что, с целью одно- ; временного измерения связывания и поглощения растворимых белков, 8 качестве фагоцитируемого агента используют 1-гамма-глобулкн, агрегированный прогреванием при 60-63 и рН 7,2-7,3, затем полученньт агрегат инкубируют с суспензией клеток в течение i-3 ч при 36-37 после чего его делят на две пробы, одну из которых отмывают физиологическим раствором и определяют радиометрически cyt«4apное количество присоединенного белка , другую - обрабатывают 0,2-0,3%ным раствором трипсина и определяют количество поглощенного белка, по от-( ношению поглощенного и присоединенного белка определяют фагоцитарну активность клеток.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

OUNIIN И . РЕСПУБЛИК

09) (11) 9(Д) 0 01 И 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21). 3277662/28-13 (22) 13.04.81 (46) 23 ° 08.83. Бюл. 9 31 (72) С.Г.Осипов, В;П.Масенко и В.Н.Титов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр И4Н СССР (53) 612.112.3(088.8) (56) 1. Новиков В.С.Модификация мето да,исследования Фагоци арной активности лейкоцитов.- Лабораторное де ло, 1980., 9 8, с ° 509. .2. Stenten W. Microorganism 1аbelial с 14 for Measurement of Phago-, sibhsis Arch. immunol. ther. ехр.

1980, 28 94-104 (прототип) (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАХ ОЦИ

TAPHOR. АКТИВНОСТИ КЛЕТОК КРОВИ путем инкубирования суспенэни лейкоцитов с фагоцитируемым агентом, о т л и ч ею шийся тем, что, с целью одно- . временного измерения связывания и поглощения растворимых белков, в качестве фагоцитируемого агента используют:- ", I-гамма-глобулин, агрегированный прогреванием при 60-63 и рН

7,2-7,3, затем полученный агрегат инкубируют с суспенэией клеток в течение 2-3 ч при 36-37, после чего его делят на две пробы, одну as которых отмывают физиологическим раствором и определяют радиометрически суммарное количество присоединенного белка, другую - обрабатывают 0,2-0,3%ным раствором трипсина и определяют количество поглощенного белка, по от-Е ношению поглощенного и присоединен" ного белка определяют фагоцитарную активность клеток.

1037177

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в иммунологии»

Известен метод исследования фагоцитарной активности клеток путем инкубации лейкОцитов крови человека с культурой стафилококков c,ïocëåäóþщим визуальным подсчетом в микроскоп : количества поглощенных лейкоцитами микроорганизмов (1).

Известен также способ определения 10 фагоцитарной активности клеток крови путем инкубиронания суспензии лейкоцитов с фагоцитирувмым агентом, представляющий собой микроорганизмы, меченные "C 623 . 15

Недостатком известных способов .яв ляется невозможность использования их для определения фагоцитоза раствори. мых белковых агрегатов.

Цель изобретения - одновременное измерение связывания и поглоцения клетками крови растворимых белков.

Указанная цель достигается твм, что согласно способу определения фагоцитарной активности клеток крови путем инкубировання суспензии лейкоцитов с фагоцитируемым агентом н качестве Фагоцитируемого агента используют «.(" l-гамма-глобулин, агрегированный прогреванием при 60-63 и рН

7,2-7,3, затем полученный агрегат инкубируют с суспенэией клеток в течение 2-3 ч при 36-37 С, после чего вго делят на двв пробы, одну из которых отмывают физиологическим раствором и определяют радиометрически сум-35 марное количество присоединенного белка, другую " обрабатывают 0,2-0,3% ным раствором трипсина и определяют количество поглощенного белка,,по отношению поглощенного и присоединен- 4() ного белка определяют фагоцитарную активность клеток.

Способ осуществляют следующим об разом. 45

Фракцию 11 Кона (гамма-глобулин) растворяют в .0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,3 иэ расчета 5 мг/мл и агрз гнруют прогренанием на водяной бане о при 60 в течение 40.мин. После этого раствор центрифугируют 30 мин при

7000 об/мин. Используют надосадочную, фракцию, н которой концентрацию белка определяют по Лоури.

Агрегированный гамма-глобулин ме= тят изотопом ? с помощью лактоперок сидазного метода.Для этого 25 мкг бел. ка при концентрации 1 мг/мл разводят в 30 мкл 0,3 М фосфатного буфера рН

7,после чего добавляют 1 мкл раствора лактопероксидаэы (1 мг фермента, 1 мл ЗМ фосфатного буфера, .1 мл глицерина), 450 мкКи <++ I и 10 мкл

0,88 мМ раствора перекиси водорода.

После инкубации в течение 10 мин при

20 вновь добавляют 10 мкл 0,88 мМ о раствора перекиси водорода, инкубируют 5 мин при 20 и останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 10 мМ раствора дитиотриэтола..Через. 10 мин несвязанный изотоп " I отделяют от связанного с белком фильтрацией на сефадексе Г-25. Меченный белок разно. дят немеченным агрегированным гаммаглобулином из расчета 50000 имп/мин на 5 мкг белка н 20 мл фосфатного буфера.

Кровь от донора в количестве

10 мл берут из локтевой нены в пробирку с гепарином (25 ед. гепарина на 1 мл крови). После отстаинания эритроцитон плазму с лвйкоцитарной массой центрифугируют при 1500 об/мин

5 мин. Оставшиеся н осадке эритроциты лизируют 0,86%-ным раствором хлористого аммония, а лейкоциты трижды отмывают раствором Хенкса и доводят до концентрации 4 10 клеток/мл среды Р 199

К 0 5 мл суспензии лейкоцитов (2 10 клеток) добавляют 5 мкг/20 мкл агрегированного белка (50000 .имп/мин) и инкубируют в термостате при 37 в течение 2-3 ч с периодическим встряхиванием через каждые 15 мин. Всего приготавливают 6 проб с 2 10 клеток °

После инкубации три пробы отмывают трижды изотоническим раствором хлористого натрия, а три другие после двукратной отмывки изотоническим раствором обрабатывают 0,25%-ным . раствором трипсина. Радиоактивность клеток после удаления недостаточной жидкости подсчитывают в гамма-сцинтилляционном счетчике и рассчитывают . средние показатели для трех параллельных образцов.

В таблице приведены данные, иллюстрируюцие фагоцитарную активность лейкоцитов у здоровых доноров и больных миокардитом.

1037177

Доноры

Количество поглощенного белка, имп/мин Ъ не внесенного имп/мин % от внесенного

Ъ бт внесенного

0,74

16,3

4,2

6056+44 12 1

21,5

6 5

74 98+ 56 1 5, 0

0 70

Больные

1 8650 37

76ОМ41 15,2.

9805143 19 t 6

8703+36 17,4

0,88

2,1

17i3

3 i 3

2 11450+46 22,9

0 86

0,90

3 9652й40

1,9

19,3

Предложенный способ определения фагоцитарной активности клеток крови дает возможность определить способность клеток связывать и поглощать растворимые белковые вещества, .что необходимо для изучения процес-са элиминации из организма,иммунных комплексов. Способ позволяет уточнить характер дефекта фагоцитарной функции клеток, что важно для выяснения патогенеза многих заболева уф .

Составитель В.Ю.Арцатбанов

Редактор В.Лазаренко Техред М.Тепер

Корректор И. Ватрушкина

Заказ 6001/46 Тираж 873

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-ЗЬ, Рауиюкая наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4

Суммарное количест во присоединенного белка„

Здоровые

1 8166+50

2 10754244

Количест" во связан ного белка, агоциарная к тивость