Штамм @ @ ифржз-продуцент биологически активных веществ женьшеня и способ получения биологически активных веществ

 

1. Штамм Рапах ginseng ИФРЖЗ, № 3, № 2 (хранится в коллекции культур растительных клеток Институтафизиологии растений им.К.А.Тимирязева АН СССР) - продуцент биологически активных веществ женьшеня. 2. Способ получения биологически активных веществ путем выращивания .штамма-продуцента на питательной cpe-i де, содержащей микрон макросоли, стимуляторы роста, сахар и агар-агар с последукяцим выделением целевого продукта,отличающийся тем, что, с целью повышений биологической активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Рапах, ginseng ИФРЖЗ, и выращивание ведут на среде, содержащей, мп/л воды: 1145-1850 NH4N03 1490-2100 ICNOj 420-500 CaClj- 2Н20 350-400 MgS04-7K20 150-210 KH-jPO 4,2-8,0 g 15,6-26,7 MnS044H20 tn с 6,0-10,3 Zn04-7H O 0,53-0,90 KJ NajMoO 0,15-0,30 )2H20 0,03-0,075 CuSO 4- 5H20 0,03-0,075 CoClg- 2H20 FeS04-7H20 25,0-30,0 ел 26,1-40,1 Naj ЗДТА 00 ТиаминброМКД (B) 0,40-0,80 INO 2,5М04 -3,5-10 Сахар 00 1C 6, 10 Агар-агар

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1 058282

abg С 12 N 5/00 сСН0} ч i q л:.:, : : = :;: (1 " I ИГЩ l.1 Pal

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (2 1) 3393566/28-13 . (22) 04;01. 82 (46) 07. 10.84. Бюл. 9 .37 (72) P.Ã.Âóòåíêo, Н.А.Мясоедов, З.Б.Шамина и Л.И.Слепян (71) Ордена Трудового Красного

Знамени институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева и Ленинградский химико-фармацевтический институт (53) 578.085.23(088.8) (56) 1. Патент ФРГ Р 2143946, кл. А 61 К 35/78, 1978.

2. Писецкая Н.Ф., 1970. К вопросу подбора питательной среды для культуры ткани женьшеня. "Растительные реI сурсы", Р 6,. в. 4, с. 516-520. (54) ШТАММ РАНАХ GINSENG ИФРЖЗ-ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

ЖЕНЬШЕНЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИ=

ЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ. (57) 1. Штамм Panax ginseng ИФРЖЗ, У 3, N 2 (хранится в коллекции культур растительных клеток Института: физиологии растений им.К А.Тимирязева АН СССР) — продуцент биологически активных веществ женьшеня.

2. Способ получения биологически активных веществ путем выращиванияштамма-продуцента на питательной сре-i де, содержащей микро- и макросоли, стимуляторы роста, сахар и агар-агар с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, .с целью повышения биологической активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм

Panax, ginseng ИФРЖЗ, и выращивание ведут на среде, содержащей, мл/л воды:

NH4NO 1145-1850

К1 0з 1490 2.100

СаС1 2НэО 420-500

Mg SO4 7Н >О 350-400

КН РО 1 50-2 10

НзВО 4,2-8,0 O

МпЯО 4Н<0 15,6-26,7

ZnO 7H O 6,0-10,3

KJ 0,53-0,90 С

Na MoOy» .2й,О

О, 15-0,30

CuSO 5Н О 0,03-0 075

FeSOg«7H O 25,0-30,0 СР Na ЭДТА 26, 1-40,1 CA

Тиаминбр о- QO

h4

Q0

Ю мид (В ) 0,40-0,80

Сахар 2,5 10< -3,5 ° 104

Агар-агар 6,10 -T 10

Использование штамма ИФРЖЗ в качестве нродуцента биологически активных веществ женьшеня и способа полу1 105828

Изобретение относится к химико-фар-. мацевтической промьшитенности и может быть использовано B коеметической промышленности в качестве активных компонентов кремов, лосьонов, а также в сельском хозяйстве в качестве кормовых добавок.

Известен способ получения солонинсодержащнх биологически активных препаратов при культивировании клеток женьшеня на питательной среде сложного состава (t ), Известен штамм Рапах ginseng

ИФРЖ1"продуцент биологически активных веществ женьшеня и известен также способ получения биологически активных веществ путем культивирования штамма-продуцента на питательной среде, содержащей, мг/л воды:

КН,БИО 1650

KNOз 1900

СаС12 2Н О 440

ИДЯ04 7Н20 370

КН,PO 170

Н ВО 6,20

MnSO4 4нгО 22;80

ZnS0 ?Н О 8 60

KJ 0,83

Na2MoO4 -2H20 0,25

CuS0 5Н20 0,025

СоС12 6Н20 0,025

FeSO 7Н О 27,80

Na2 ЭДТА 37,30 (натрйевая соль этнлендиаминтетрауксусной кислоты), тиаминбромид (В„)

0,40, d,-нафтилуксусная кислота

35 (НУК) 2, кинетин 1, инозит 80, гид" ролиэат казеина 500, сахароза 3 10, агар-агар 7 ° 10З L 21.

Однако известные технические pemeния не обеспечивают высокой биологи4О ческой активности целевого продукта.

Целью изобретения является повышение биологической активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, 45 что при осуществлении способа получения биологически активных веществ, предусматривающем выращивание штаммапродуцента па питательной среде, содержащей микро- и макросоли, стимуля-5О торы роста, сахар и агар-агар с последующим выделением целевого продукта, отличием является то, что в качестве продуцента используют штамм Panama git>вепш ИФРЖЗ, а вырашивание ведут на среде, содержащей,.мг/л воды:

NH NO 1145- 1850 . KN0 . ",490-2100 у.

СаС1г 2нгО 420=500

МЗЯО4:7Н20 350-400

КН Ро 150-210

Нэ ВС 4 2 8эО

MnSO 4Н О . 15,6-26,7

ЕпЯО ° 7Н О 6,0-10. 3

KJ 0,53-0,90

Na2MoO< 2Н О 0,15-0,30

С.SO 5Н,O О, 03-0, 075

СОС12 2Н20 0,03-0,075

FeSO 7Н О 25,0-30,0

Na2 ЭДТА 26, 1-40, 1

Тиаминбромид (В q) О, 40.-0,80

Сахар 2 5 104-3 5 -104

Агар-a> pp 6, 10З -7 ° 10

Для осуществления способа пред" ложен штамм Panox ginseng ИФРЖЗ (коллекционный номер 2) — продуцент биологически активных. веществ, которые связаны между собой единым изобретательским замыслом.

Штамм Panax ginseng ИФРЖЗ получен в Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева и хранится в коллекции культур растительных клеток данного института под номером 2 °

Штамм характеризуется следующими признаками.

Штамм представляет собой светложелтую„ рыхлую, крупно" зернистую клеточную массу со специфическим запахом и вкусом. Популяция состоит на 52-80Х из клеток меристематического типа (с размером от 29,4 до 109,2 мкм) и на

7-26Х иэ клеток паренхимного типа (с размером от 67,2 до 277,2 мкм). Лигнификация составляет до 35 с образованием трахеальных узлов. Ткань, растущая на среде, из состава которой исключены регуляторы роста - кинетин и eL"нафтилуксусная кислота, гидролиэат казенка, инозит, имеет ростовой индекс 16,0-13,0 и содержит 4,2-4,6Х сухого вещества. Цикл выращивания характеризуется S-образной кривой с лагфаэой до .3-6 сут, фазой экспоненциального роста (6-12 сут), линейной фазой (12-30 сут), фазой замедленил роста (30-33 сут) и стационарной фа-" зой (33-35 сут). Кривая митотической активности имеет двувершннный характер с максимумом,в первую и вторую недели. Среднее число хромосом 105, 4+

«+20,0 с вариацией от 28 до 400. з 1058282 4 чения биологически активных веществ иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. В колбы Эрленмейера емкостью 250 мл разливают по 90 мл предлагаемой питательной .среды сле5 дующего состава, мг/л среды:

ИН4ИО 1145-1850

3 1490-2100

СаС1 2Н20 420-500

МИЯ04 7Н20

350-400 10

КН7Р04

150-210 зB©ç 4,2-8,0

MnS0+-4Н20 15,6-26,7

ZnS0 7Н О 6, 0-10 3, KJ 0 53-0,90

Na2Mo . 2Н20 О, 15-0, 30

CuS04 5Н20 0,03-.0,075 - СОС12 6Н20 О, 03-0,075

ГеБО 7Н О 25 0-30,0

Na2 26, 1-40, 1

Тиаминбромид

"(В1) О, 40-0,80

Сахар 2,5 10 -3,5 10

Агар-агар 6,10з 7, 10з при рН 5,8 закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре о

120 С в течение 15 мин. После стерилизации содержимое каждой колбы разливают в стерильных условиях по.30 мл в три чашки Петри диаметром 120 мм. З0

После застывания и охлаждения ага,ризованной питательной среды на ее поверхность помещают по 5 инокулятов ткани штамма Panax ginseng ИФРЖ 1 ве, сом 100 мг каждый, из коллекц. и лабо-З5, ратории культуры ткани и морфогенеза

Института физиологии растений им.К.А.Тимизярева АН СССР. Чашки Петри с инокулятами заклеивают лентой

Parafi1m и инкубируют при температуред0 ,ЪО

26 С и относительной влажности воздуха 70 . Каждый цикл выращивания составляет 33 сут. В отсутствии обоих фитогормонов (с -нафтилуксусная кислота и кинетин) ткань заметно угнетает- 15 ся в росте и к концу первого пассажа ее вес составлял лишь 15 от ткани с

"Известной" средой (см.табл.1).

Сравнение биомассы штамма ИФРЖ 1, выращенного на "известной" и предла- 50 гаемой средах.

25

Отсутствие обоих фитогормонов было лимитирующим фактором: на ткани появляются некротизированиые участки, отмеченные синтезом антоцианов, она 55 темнеет, а во втором пассаже наступает ее гибель. Однако на фоне общей гибели удалось отобрать 3 колонии делящихся клеток. При дальнейшем пассировании сохранилась лишь .одна нз трех колоний, в которой при дальнейших пересадках интенсивность роста клеток увеличилась. Определение частоты возникновения прототрофной по фитогормонам линии (6 ° 10 ) и длительное сохранение прототрофности в селективных условиях показывает, что отобранная линия является результатом мутационного изменения. Полученный штамм ИФРЖЗ нормально растет 30 пассажей на предложенной среде, рост не уступает ткани исходного дикого штамма женьшеня ИФРЖ 1, из которого она была выделена (см.табл.2).

Сравнение биомассы штаммов ИФРЖ 1 и ИФРЖЗ, выращенного на "известной" и предложенной средах.

По истечении цикла выращивания выросшую биомассу 14,00 г отделяют от агара н высушивают при температуре о

60 С. Высушенная ткань измельчается до размера частиц 0,05-0, 1 мм и используется в качестве целевого продукта.

Получение биологически активных веществ.

В перколятор (1,0 л) помещают

100 r измельченной сухой биомассы штамма ИФРЖ 3 и заливают 500 мл 30 HoI о этанола до образования "зеркального слоя под сырьем" и оставляют на срок до 24 ч. По истечении указанного срока экстракт леркалируют со скоростью 5 ил/мин с одновременным поступлением на сырье 35 -ного этанола с такой же скоростью. Экстракцию продолжают до получения 1 л настойки ° Полученную настойку отстаивают в течение

2 дней, фильтруют и используют по назначению в качестве целевого продукта.

Фармакологические испытания биологически активных веществ из штаммов

ИФРЖ1 и ИФРЖЗ проводились на нелинейных мышах-самцах. Результаты представлены в табл.3.

При использовании биологически активных веществ из штамма ИФРЖ 3 установлено, что этот грепарат увеличивает стимулирующий эффект на животных, повышая их работоспособность по срав нению с контрольным препаратом на 152 (табл.3), Кроме того, дозы„ выэы вающие этот эффект, были в 2 раза меньшими, чем у контрольного препарата. Отсюда количество СЕД, по которым можно судить о биологической акгивности сырья, в 2 с лишним раза

9 .1058282 выше у предлагаемого препарата, чем у

Таблица 2

Сырая масса

М+ш, r

Nacca исходного

Вариант среды инокулята г

ИФРЖ 1 Извест14 15+0168 ная

ПредлагаеИФРЖЗ

14,06" О, 63 м!ая

Таблица 3

Сравнение биологической активности штаммов ИФРЖ1 и ИФРЖЗ

%Ф

Препара- Доза, Стимуля- СЕД ты из мл/20 r ция+, 7 штаммов

Таблица 1

Сырая Mac-, 20 са ИФ r

Штамм

Вариант среды асса сходогов

121,7 83,3

137,1 244

ИФРЖ 1 0,1 иноку лята, йг

ИФРЖ 3 0 05

Составитель

Редактор П.Горькова Техред Т.Дубинчак

Корректор А.Ильин

Заказ 7029/1 Тираж 521. Подписное

ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 ко9трольного и составляет 224 едийицы.

Применение нового штамма-продуцента.ИФРЖЗ биологически активных ве- S ществ панаксозидов женьшеня и спосо-, ба получения панаксозидов позволяет повысить выход биологически активных веществ за счет повышения выкода био-. массы, уменьшить на 39Х затраты по получению 1 кг сухой биомассы Женьшеня по сравнению с известной средой и улучшить. фармакологические свойства целевого продукта.

1 5

ИФРЖ1 "Известная", 100 1,96 0,07

ИФРЖ1 Предлагаемая 100 0,30+0,01

Отношение времени бега (мин} контрольных и опытных животных, 7..

"+ Условная стимулирующая единица действия, обеспечивающая повышение работосйособности на 33% от

1 r сырья.