Способ получения антисыворотки к фактору уш
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К ФАКТОРУ VIII путем иммунизации животных специфическим антигеном с последующим забором крови, отделением сыворотки и ее о.чисткой посредством адсорбции плазмой, не содержащей фактора VIII, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, животных tiMwyHHзируют криопреципитатом плазмы человека , содержащем фактор VIII, циклом , состоящим из Л инъекций с трехдневным интервалом и 1 инъекции через 20-22 сут, при разовой дозе ан-. тигена 50-60 мк/кг веса животного, а забор крови осуществляют дробно через 5-7 дней после последней инъекции в течение 7-9 дней. 2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что адсорбцию сысл с воротки осуществляют плазмой больных болезнью Виллебранда.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
4(5i) А 61 К 39/395! :
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3359953/28-13 (2?) 04.12.81 (46) 23.01.85. Бюл. К- 3 (72) Л.П. Папаян, 3.9. Федорова, Г.Я.- Гдалевский, П.В. Хролова и И.Н. Башаева (7 1) Ленинградский ордена Трудового
Красного Знамени научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (53) 615.373.3(088.8) (56) 1. Zimmerman F. et al "Immunologic Differantiation of Classic
Hemophilia and Willebrand s Disease", J. Clinical Investigation» 1971, ч. 50, Ф 1, р. 244-253 (прототип). (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К ФАКТОРУ VIII путем иммунизации животных специфическим антигеном с последующим забором крови, отделением сыворотки и ее очисткой посредством адсорбции плазмой, не содержащей фактора VIII, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, животных иммунизируют криопреципитатом плазмы человека, содержащем фактор VIII циклом, состоящим из 4 инъекций с трехдневным интервалом и 1 инъекции через 20-22 сут, при разовой дозе ан-. тигена 50-60 мк/кг веса животного, а забор крови осуществляют дробно через 5-7 дней после последней инъекции в течение 7-9 дней.
2. Способ по п. 1, о т.л и ч аю шийся тем, что адсорбцию сыворотки осуществляют плазмой больных болезнью Виллебранда.
1 10597
Изобретение относится к медицине, преимущественно к иммуногематологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики гемофилии, болезни Виллебранда.
Известен способ получения антисыворотки к фактору VIII путем иммунизации животных специфическим антигеном, с последующим забором крови, отделением сыворотки и ее очисткой 1О посредством адсорбции плазмой, не содержащей фактора VIII (1) .
Однако известный способ трудоемкий, поскольку для его выполнения требуется предварительное выделение высокоочищенного специфического антигена.
Целью изобретения является упрощение способа.
Поставленная цель достигается 2О тем, что в способе .получения антисыворотки к фактору VIII путем иммунизации животных специфическим .антигеном с последующим забором крови, 1 отделением сыворотки и ее очисткой 25 посредством адсорбции плазмой, не содержащей фактора Vill животных иммуниэируют криопреципитатом плазмы человека, содержащим фактор VIII, циклом, состоящим из 4 инъекций с трехдневным интервалом и 1 инъекции через 20-22 сут, при разовой дозе антигена 50-60 мг/кг веса животного, а забор крови осуществляют дробно через 5-7 дней после последней инъ35 екции в течение 7-9 дней.
Кроме того, адсорбцию сыворотки осуществляют плазмой больных болезнью Виллебранда.
Пример. 200 мл крови челове- 40 ка стабилизируют 3,87.-ным раствором цитрата натрия в соотношении 9: 1.
Затем ее центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин при 4 С, Полученн ю ,плазму (около 100 мл) замораживают при (-50)-(-70) С. Через сутки размо. раживают в проточной воде и центрифугируют при 2500 об/мин в течение
40 мин при 4 С. Недостаточную жидкость отбрасывают, а полученный осадок, содержащий фактор VIII, растворяют в 1 мл цитратного буфера.
18
Кроликов иммунизируют антигеном без адъюванта подкожно в область спины в течение цикла, состоящего из 4 инъекций с трехдневным интервалом и 1 инъекции через 21 день, при разовой дозе антигена 50 мг/кг веса животного, через 5 дней осуществляют забор крови из ушной вены с определением титра антител к фактору VIII (не ниже 1:16) и затем ежедневно в течение 7 дней до начала падения титра. Полученные 10 мл крови выдерживают при 37 С в течение 2 ч и оставляют в холодильнике на ночь.
После этого кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин и получают 4 мл сыворотки. Полученную,антисыворотку адсорбируют плазмой больных болезнью Виллебранда, у которых отсутствует антиген фактора VIII при соотношении сыворотки к плазме 1:0„5 и 1:0,25. Пробирку со смесью инкубируют при 37 С в течение 4-6 ч и оставляют на ночь при 4"C. После этого преципитат удаляют центрифугированием при
1500 об/мин в течение 10 мин. К полученным 3 5 мл сыворотки добавляют
0,7 мл 3,8 -ного раствора цитрата натрия, нагревают при 56 С в течение 30 мин и центрифугируют при
1000 об/мин в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Осадок отбрасывают. Диагностическую сыворотку стабилизируют мертиолятом в соотношении 1000: 1, разливают в стерильных условиях во флаконы или ампулы, по 1 мл и замораживают при -20 С для хранения.
Данные об активности антисыворотки приведены в таблице.
Из данных, приведенных в таблице, видно„ что активности предлагаемой (4 серии) и известной сывороток к фактору VIII идентичны.
Использование изобретения позволит упростить способ получения антисыворотки к фактору VIII удешевить целевой продукт, многократно использовать животных продуцентов.
1059718
Активность антисывороток, титр по прототипу
Ф серии
По Ухтерлони
50781
1 .16-32
1:32
1:32
Усредненные данные
1:32
1:32
1:32
1:32
1:32
1:32
Редактор Л. Горькова Техред И. Гергель
Корректор E. Рошко
Заказ 132/3 Тираж 722 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
121081
30482
170682
Сравнительные данные активности антисыворотки пц. предлагаемому изобретению по Бринкхаузу
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
