Способ культивирования островковых клеток поджелудочной железы

 

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ путем инкубирования их в питательной смеси, о т личaющийciя тем, что, с целью повышения выхода клеток, суспензию клеток предварительно обрабатывают средой 199, содержащей 50% бычьей сыворотки, и инкубируют в питательной смеси, содержащей среду 199, 0,5%-ный раствор гидролиэата лактальбумина, бычью сыворотку в соотношении 1:1:0,5 и 300-500 мг% глюкозы , ., (Л CZ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

".ЕСПУБЛИН

09) (Н) 3(59 12 N 5 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ГО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3449644/28-13 . (2 2) 08.06.82 (46) 30.12.83. Бюл. 9 48 (72 ) В. П. Комиссаренко, И. С. Турчин, Н. П. Лазарева и Д. С. ОнищЕнко (71) Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ (53) 576.5(088.8) (56) 1. Бабикова P. А., Блюмкин В.Н. и др. Клеточные культуры из поджелудочной железы плодов крупного рогатого скота, полученные с применением коллалитина. БЭБИМ, 1977, Р 8, с. 350-353 (прототип). (54)(57) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ OCT POBKOBblX КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ путем инкубирования их в питательной смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода клеток, суспензию клеток предварительно обрабатывают средой 199, содержащей

50% бычьей сыворотки, и инкубируют в питательной смеси; содержащей среду 199, 0,5Ъ-ный раствор гндролизата лактальбумина, бычью сыворотку в соотношении 1:1:0,5 и 300-500 мгЪ глюкозы.

10 6 3830

Изобретение относится к медицинской промышленности,и касается способа культивирования островковых клеток поджелудочной железы, используемых для получения инсулина.

Известен способ культивирования островковых клеток поджелудочной железы путем инкубирования их в питательной смеси, содержащей среду 199 и

10%-ную сыворотку крупного рогатого скота (1) .

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода клеток.

Цель изобретения — повышение выхода клеток.

Указанная цель достигается тем, )5 что согласно способу культивирования островковых клеток поджелудочной железы путем инкубирования их в питательной смеси суспенэию клеток предварительно обрабатывают средой 199, содержащей 50% бычьей сыворотки, и инкубируют в питательной смеси, содержащей среду 199, 0,53-ный раствор гидролизата лактальбумина, бычью Âopoòêó в соотношении 1:1:0.5 и 25

300-500 мгЪ глюкозы.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделенные островки суспендируют в среде 199, содержащей 50% бычьей сыворотки и оставляют для свободного

J оседания на 10-15 мин, после чего надосадочную жидкость с неосевшими клетками осторожно удаляют. К островкам добавляют 2-3 мл ростовой питательной смеси и помещают в культуральз5 ные флаконы емкостью 250 или 500 мл.

При помощи медленного ручного вращения добиваются равномерного распре деления .островков на внутренней поверхности культурального флакона. 40

В течение 20-30 мин дают островкам закрепиться на поверхности стекла.

Затем осторожно вносят 2-3.мл ростовой питательной смеси и помещают в

Устройство для культивирования во 45 вращающихся флаконах. В течение 1618 ч .культивирование ведется при комнатной температуре. За это время завершается окончательное прикрепление выделенных островков к внутрен- 5р ней поверхности культурального флакона. Потом питательную среду с неприкрепившимися островками и отдельными клетками удаляют, добавляют в флаконы свеЖую порцию ростовой питательной смеси и культивируют при

37 С.

Пример 1. Выделенные с соблюдением условий асептики попжелудочные железы помещают в стерильную 60 колбу с охлажденным до 4 С раствором

Хенкса. В боксе железы переносят в стерильную чашку Петри и удаляют капсулу и крупные кровеносные сосуды. Затем их измельчают ножницами на кусочки 1-2 мм. Перекладывают измельченную ткань в стерильную колбу и промывают раствором Хенкса до отхождения прозрачных промывных вод.

После промывания раствор Хенкса сливают, а в колбу вносят 3-5 мл рабочего раствора коллагеназы (0,1% в О, 3%-ном растворе трипсина) . Раствор фермента наливают с таким расче том, чтобы измельченная ткань была покрыта слоем жидкости толщиной в 15-20 мм. В колбу опускают стерильный магнит, закрывают стерильной резиновой пробкой и ставят колбу на магнитную мешалку для перемешивания, Скорость перемешивания должна быть такой, чтобы над магнитом образовывалась небольшая воронка, а в колбе не происходило образт>вание пены.

Первую порцию клеток, отделившихся от кусочков ткани через 15-20 мин, не используют. В дальнейшем через каждые 5 мин производят слив жидкости с взвешенными в ней клетками в флаконы емкостью 250 мл с добавлением 50-70 мл среды 199 с 50% сыворотки (для инактивации протеолитических ферментов). Флаконы хранят в льду или при 4 С. К оставшейся ткани вновь добавляют раствор фермента и ставят на магнитную мешалку для ее дальнейшей дезагрегации. Такую процедуру повторяют несколько раз до полного расщепления тканевых фрагментов. По мере заполнения флаконов производят центрифугирование в течение 10 мин при 600-700 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют пипетированием в

2-3 мл среды 199, содержащей 503 бычьей сыворотки, Доводят объем этой среды до 150 мл, затем легким перемешиванием распределяют клетки во всем объеме среды и оставляют для свободного осаждения на 15-20 мин.

В течение этого промежутка времени периодически при помощи пипетки на

1 мл делают забор среды для контроля за осаждением конгломератов островковых клеток. Для этого каплю среды помещают на предметное стекло и смотрят под микроскопом при увеличении

8х10. Когда в пробах среды, взятых на различных уровнях, не выявляются конгломераты островковых клеток, над. осадочную жидкость с взвешенными в ней одиночными клетками осторожно сливают„ При посеве клеток, полученных иэ надосадочной жидкости, получаются культуры, состоящие из 8090% фибробластов и 10-153 островковых клеток. К осевшим островкам добавляют 1,5-2 мл ростовой питательной смеси, содержащей 40В среды 199, 40% 0,5Ъ-ного раствора гидролизата лактальбумина и 20В бычьей сыворотки. Ресуспендируют островки при пох0 63830 мощи пипетирования, а затем путем медленного ручного вращения равномер но распределяют их на внутренней поверхности культурального флакона.

В течение 20-30 мин дают островкам закрепиться на поверхности стекла.

Затем осторожно вносят 2-3 мл ростовой питательной смеси. Флаконы плотно закрывают стерильными резиновыми пробками, так как поступающий воздух может изменить рН среды в щелочную 1Р сторону. Оптимальная рН среди — 7,27,4. Пробирки или флаконы с панкреатическими островками помещают в роллер. В течение 16-18 ч культивирование ведется при комнатной температу- )5 ре и скорости вращения флаконов

0,5 об/мин. За это время жизнеспособные островки окончательно прикрепляются к поверхности стекла. Потом культуральную среду с неприкрепивши- ур мися клетками осторожно сливавт, а в""флаконы добавляют порцию свежей ростовой среды. Ее объем должен составлять 1/50 ч.от объема роллерного флакона. Культивирование ведется при 25

37ОС и скорости вращения флаконов в пределах 0,5-1 об/мин.

Сравнительная оценка эффективности способов культивирования островковых клеток из поджелудочных желез морских свинок в средах различного состава приведена в табл. 1.

Пример 2. Для получения культуры островковых клеток из поджелудочных желез эмбрионов человека используют человеческие плодики 1626 недельного возраста, полученные при самопроизвольных абортах.

Извлеченные в асептических усло.виях поджелудочные железы переносят в стерильную чашу Петри на марлю, смоченную растчором Хенкса. Удаляют капсулу, соединительную ткань, крупные кровеносные сосуды. Затем их 45 измельчают на кусочки размером 11,5 мм. Перекладывают измельченную ткань в стерильную колбу и промывают несколь,ко раз раствором Хенкса до отхождения прозрачных промывных вод.

После промывания раствор Хенкса сливают, а в колбу вносят 2-.3 мл рабочего раствора коллагеназы (0,1% в

0,3%-ном растворе трипсина). Ткань диспергируют вручную при комнатной температуре, причем каждый раэ после заливки рабочего раствора фермента ткань пипетируют, а затем энергично перемешивают в течение 3-5 мин. После перемешивания колбу ставят в слегка наклонном положении для осаждения 6Р остатков ткани. Надосадочную жидкость с взвешенными клетками сливают

::во флаконы емкостью 50-100 мл, содержащих 20-30 мл среды 199 с 50% бычьей .сыворотки (для нейтрализации протеолитических ферментов) . Такие процедуры производят несколько раз до полного расслоения островковой ткани. При этом соответственно уменьшают количество рабочего раствора фермента, добавляемого к остаткам ткани. Центрифугирование производят в течение 10 мин при 600-700 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в питательной среде, содержащей 50% бычьей сыворотки. Переносят суспензию островковых клеток в флакон емкостью 20 мл и до.водят объем среды до 10-15 мл. Оставляют для свободного осаждения на 1015 мин. Время от времени. пипеткой на 1 мл делают забор среды для контроля за ходом осаждения. Для этого каплю среды помещают на предметное стекло и смотрят под микроскопом при увеличении 8х10. Когда в пробах, взятых с различных уровней, не выявляются конгломераты островковых клеток, надосадочную жидкость, содержащую одиночные клетки, удаляют, а к осадку добавляют 0,3-0,5 мл ростовой питательной смеси. Путем медленного ручного вращения добиваются равномер ного распределения островков по внут: ренней поверхности культурального флакона. В течение 15-20 мин дают островкам закрепиться на поверхности стекла. Затем осторожно вносят

0,3-0,5 мл ростовой питательной смеси и помещают в роллер. В течение

16-18 ч культивирование ведется при комнатной температуре и скорости .вращения флаконов 0,5 об/мин. В течение этого времени завершается прикрепление жизнеспособных островков к поверхности стекла. Затем культуральную среду с неприкрепившимися клетками удаляют, а в флаконы добавляют порцию свежей ростовой питательной среды. Ее объем должен составлять

1/20 ч,от объема роллерного флакона.

Культивирование ведется при 37 С о и скорости вращения флаконов в пределах 0,5-1 об/мин.

Сравнительная оценка эффективнос ти способов культивирования остров- . ковых клеток из поджелудочных желез эмбрионов человека в средах различного состава приведена в табл. 2.

Сравнительные. данные по выходу клеток и инсулинпродуцирующей активности (ИРИ) культур приведены соответственно в табл. 3 и 4.

Данные цитологического анализа культур показывают, что при выращивании клеток фибробласты полностью элюминируются через 1,5-2 дня после засева.

Использование изобретения поз валяет повысить выход клеток, их мито тическую активность и инсулинредуцирующую активность.

1063830

° 4

Таблица 1.

Соотношение ингредиентов

1:1!0,5

Показатель

Ю

9:0:1

%%

3:1:1

-2

1:1:0,5:0,7 -1,5 2

Время, необходимое для Формирования клеточного слоя, дни

7-8 "

3 3, 5

5-6

Митотический индекс, % 0,3+0,08 0,4 0,09

1,4+0,1

0,6+0,08

9:0:1 - 90% среды 199,10% сыворотки (прототип)

%%

3:1:1 — 60% среды 199,20% гидролизата лактальбумина (ГЛА), 20% сыворотки

ФфФ

1:1:0,5 — 40% среды 199, 40% ГЛА, 20% сыворотки;

-2

1: 1! 0 5: О, 7 -1, 5 — 40% среды, 199, 40% ГЛА, 20% сыворотки, 300-500 мг % гликозы (соотношение ингредиентов по предлагаемому способу).

Таблица 2

Соотношение ингредиентов

3:1:1 1:1:0)5 1:1

Показатель

Время, необходимое для формирования клеточного слоя дни

3-4

8-9

6-7

Митотический индекс, %

6+1,3 7+1,4 9+1,3

17 1,8

Таблица 4

Таблица 345

Среднее число. клеток

Дни культивирования

ИРИ (в мкед/мл) согласно

Дни культивирования по прототипу по предлагаемому способу предла- прототипу гаемому способу

4 30+30

226+78

870+120

760+1 32

15

3,2+0,1

4,5+0,2

12+0,5

6,7+0,2 55

458+127

120+56

Составитель Г. Смирнова

Редактор М. Ткач Техред М. Гергель. Корректор A. Повх

Заказ,10472/27. Тираж 523 Подписное

HkIHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

9:0:1

3:1:1

1:1:0

1:1:0

300-5 спосо

-2

9:0:1 0507«152 .%

90% среды 199, 10% сыворотки (прототип), 60% среды 199, 20% ГЛА, 20% сыворотки; ,5 — 40% среды 199, 40% ГЛА, 20% сыворотки,,5:0,7 -1,5 — 40% среды 199, 40% ГЛА, 20% сыворотки, 00 мг % глюкозы (соотношение ингредиентов по предлагаемому бу) °

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4