Способ получения туберкулезного диагностикума

 

СПОСОБ ЦОЛУЧЕЙИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО даАГНОСТИКУMA, включающий культивирование микобактерий туберкулеза , вьвделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, культивируют микобактерий Dt/St и Valu, после мйтаноловой очистки фосфатидный антигенвыпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4 1 ,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5в А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOlVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3413780/28-13

: (22) 22,03.82 (46) 30.01.84. Бюл. Р 4 (72) С.Н.Головачева, В.Н.Алексеева, Б.АiЛянда-Геллер, Э.A.Ñòåïàíîâà, Б,И.Фейгельман и И.П.Зыков (71) Ленинградский научно»исследовательский институт вакцин и сыворо . ток и Ленинградский ордена Трудового

Красного Знамени педиатрический медицинский институт (53) 615.375(088.8) (56) 1.Takahashi Y. and Katsuo О.

Study on the Passive Hemagglutination Reaction ду the Phosphatide

of М. Tuberculosos, 2 Conditions

of the Reaction. — Amer. Rev. Resp.

Dis. 1961, Р 83, р. 386-393.

„„SU„„.106 78 А (54 ) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом : с последующей сенсибилизацией им сорбента, отличающийся тем, что, с целью повьпаения активности целевого продукта, культивируют микобактерии Dt/St и Valu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до появления осадка, обра« батывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4

1,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

1069783

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения антигенного эритроцитарного туберкулезного диагностикума.

Известен способ получения туберкулезного диагностикума, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им каолина (1 .

Однако известный способ не позволяет получить диагностикум с высокой активностью и, кроме того, сложен в исполнении.

Цель изобретения - повышение активности диагностикума.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения туберкулезного диагностикума, включающему культивирование микобактерий 20 туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена иэ микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, культивируют микобактерии Dt/St и UBlu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4-1,0 мг анти- 3О гена на 1 мл 10Ъ-ной взвеси эритроцитов.

Способ осуществляют следующим образом.

Иикобактерии туберкулеза Dt/St и Ualu выращивают в отдельных матрицах, заполненных средой Линниковой и Могилевского (состав среды: вода дистиллированная 200 л, гликокол 1,7 кг, аммоний лимоннокислый однозамещенный 1,0 кг; натрий углекислый безводный О,б кг, натрий хлористый 0,4 кг, магний сернокислый 0,2 кг, железо лимоннокислое окисное 0,01 кг; глицерин 14 кг, ортофосфорная кислота 60-90 мл; калий фосфорнокислый двузамещенный

О,б кг), в течение 6-8 недель при

38 С. После этого проводят стерилизацию микробных культур автоклавированием текучим паром в течение 1 ч. 50

Затем микробные культуры смешивают в равных объемах, после чего для получения микробных тел. культуральную жидкость удаляют путем фильтрации через асбестовые пластины. .55

Полученные микробные клетки высушивают обработкой ацетоном.

Высушенные ацетоном микробные клетки заливают ацетоном из расчета g{) два объема ацетона на один объем микробной массы и помещают в термостат при 38 С на 3 ч,.после чего ацетон сливают. Эту операцию выполняют дважды.

Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 л метанола на 50 r клеток и встряхивают в течение 5 ч при 37 С, после чего микробные клетки отделяют центрифугированием. Эту операцию также проводят два раза.

Кетаноловые экстракты первого и второго извлечения (по укаэанной операции) объединяют и помещают в вакуум-сушильный шкаф, в котором проводят выпаривание метанолового экстракта до появления осадка фосфатидного антигена. Выпаривание целесообразно проводить при разрежении 0,8-0,6 кгс/см и температуре

48-52 С. Окончание операции выпаривания устанавливают либо визуально по выпадению осадка (для чего вакуумсушильный шкаф должен иметь прозрачное окно для наблюдения), либо по времени, предварительно установленного в зависимости от используемой аппаратуры и конкретного режима выпаривания из расчета выпаривания до

1/3 объема. Выпаривание до 1/3 исходного объема метанолового экстракта достаточно для выпадания осадка фосфатидного антигена без соосаждения примесей.

Образовавшийся осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием и растворяют в хлороформе.

К этому раствору добавляют два объема ацетона для осаждения фосфатидного антигена. Осажденный антиген промывают ацетоном и высушивают в вакуум-эксикаторе.

Полученный полуфабрикат (фосфатидный антиген) до проведения операции сенсибилизации эритроцитов хранят в ампулах, запаянных под азотом.

Навеску фосфатидного антигена растворяют в метаноле. Этот раствор добавляют по каплям в физраствор, после чего производят выпаривание метанола при 50 С на магнитной мешалке до первоначального объема физраствора.

Таким путем получают рабочий раствор фосфатидного антигена для сенсибилизации им эритроцитов, поскольку непосредственно в физрастворе фосфатидный антиген не растворяется.

Объем физраствора при приготовлении фосфатидной эмульсии зависит от требуемой концентрации фосфатидного антигена, обеспечивающей высокий титр противофосфатидных антител в соответствующих иммунных сыворотках и экономное расходование- фосфатидного антигена. Целесообразно брать такое количество физраствора, чтобы весовая концентрация фосфатидного антигена в нем составила 0,4

1,0 мг/мл. При этом для сенсибилизации используют 10%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов в объеме, равном объему использованного для

1069783 приготовления фосфатидной эмульсии физраствора. Этим сараям обеспечивается сенсибилиэация эритроцитов при соотношении ингредиентов: О, 41,0 мг фосфатидного антигена на

1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.

9перацию сенсибилизации проводят соединением равных объемов фосфатидной эмульсии и 10%-ный формалинизированных эритроцитов с последующим выдерживанием данной смеси в течение 14 ч при 37ОС при постоянном перемешивании ° Эатем производят центрифугирование и отмывание осадка физраствором. Из осадка отмытых

Титр антител в иммунной кроли туберкулезными диагностиками, эритроцитов различными дозами. сенсибилизировацных эритроцитов приготавливают 10а-нyю взвесь добавлением защитной среды. В качестве защитной среды может применяться

5%-ный раствор сахарозы, сахарозожелатиновый стабилизатор, 5%-ный пептон или Мясопептонный бульон (MIB> с добавлением сахарозы и баратно-янтарного буфера. В выбранной защитной среде целевой продукт подвергают лиофилизации.

Сведения о предпочтительности режима сенсибилизации эритроцитов и выбора защитной среды прриведены в табл. 1 и 2.

Таблица 1 чьей сыворотке в РНГА с. полученными сенсибилизацией фосфатидного aBmHreна

Доза антигена, мг на 1 мл

10%-ной взвеси эритроцитов

Титр антител

1 8 1:16 1:32 1г64 1:128 1 256 1 512

0,1

0,2

0,3

0,4

+++

0,6

0,8

+++

1;0

+++

Таблица 2

Титр антител в иммунной кроличЬей сыворотке в РНГА с эритроцитарным диагности кумом, лиофилизированным в различных защитных средах

Эащитная среда

Титры антител в зависимости от сроков храненйя препарата при 20 С

Содержание, Ъ

0,5-r 1г 1,5 г 2 г 2,5 г ЗГ

Сахароза

1:128 0 Сахарозо-желатиновый стабилизатор

1:128 1:32 1!4 О

1069783

ПРодолжение табл 2

Защитная среда

Титры антител в зависимости от сроков хранения препарата при 20 С

Содержание, ф

0,5 r 1 г 1,5 r 2 г 2,5 г 3 г

1164 1:32 1:8 0 0 0

Пептон

ИПБ.

Сахароза

Остальное 1:128 1:128 1:128 1:128 1:64 1:64

Баратно-янтарный буфер

Данные табл. 1 иллюстрируют проведение операции сенсибилизации эритроцитов барана различными дозами фосфатидного антигена. Как видно из табл. 1 оптимальной сенсибилизирующей дозой является 0,4-0,6 мг/мл, так как .меньшая доза не обеспечивает достаточного выявления антител, .а большие дозы приводят в неэкономному расходованию антигена. 3(Как видно из табл. 2, наиболее предпочтительной для лиофилизации и хранения препарата является защитная среда следующего состава:

Иясопептонный бульон, 35 об. В

Сахароза, вес.Ъ

Боратно-янтарный.: буфер Остальное

Лиофилизированный в этой среде 4п препарат может храниться 3 года, тогда как при использовании других защит, ных сред срок хранения не более

6 мес.

Используемые в предлагаемом спосо-4 бе штавмы являются новыми только по отношению к выбранному прототипу.

Они используются в укаэанной технологии получения туберкулина. При этом штамм 0 78с является штаммом человеческого типа. Он получен иэ США (r.Вашингтон, комиссия земледелия) и хранится в коллекции ГИСК им. Л.A.ÒàðàcåÜè÷à. Штамм Valu является штаммом бычьего типа. Он по лучен из ЦНИИ туберкулеза и хранится в коллекции ГИСК им. Л.A.Тарасевича. Ксерокопии паспортов штаммов прилагаются.

Замена штаммов произведена в связи с тем, что использовавшиеся в 60 способе-прототипе штаммы, особенно

ВС4,приводили к выявлению антител, характеризующих, главным образом, поствакцинальный иммунитет, что снижает специфичность этого серологиI E l 1 ческого теста. Кроме того, достигнутое использование одних и тех же штаммов как для приготовления туберкулина, так и предлагаемого туберкулезного диагностикума, дает возможность осуществить.безотходное производство одновременно обоих препаратов: при этом в технологической схеме их получения общей стадией будет культивирование продуцентов после чего из культуральной жидкости извлекают туберкулин, а из микробной массы (которая ранее являлась отходом производства) выделяют фосфатидный антиген для предлагаемого получения туберкулезного диагностикугла.

Использование только одного из этих штаммов в предлагаемом способе так же, как и при получении туберкулина, недостаточно для полного выявления соответствующих антител у больных туберкулезом.

Обработка фосфатндного антигена хлороформом введена для растворения целевого продукта, что позволяет освободить его от нерастворимых в хлороформе балластных веществ, нродуцируемых используемыми штаммами микобактерий туберкулеза. При этом важным является выпаривание метанолового экстракта не полностью, а только до появления осадка (в котором содержится фосфатидный антиген(. Экспернментально установлено, что в противном случае (т.е. при полном выпаривании метанолового экстракта до получения сухого осадка) осадок приобретает темную окраску, что свидетельствует о соосаждении балластных пигментированных веществ, и не поддается растворению в хлороформе. Возможно, что это требование обусловлено использованием названных штаммов.

1069783

Использование в качестве сорбента эритроцитов позволяет получить препарат в виде эритроцитарного туберкулезного диагностикума, так как его применяют не в РКА, а в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). 5

Кроме того, эритроцитарный диагностикум подлежит лиофилизации, что увеличивает срок его годности.

Пример. Матрацы, предварительно простерилизованные температурной обработкой, емкостью 1,5 л стерильно заполняют синтетической питательной средой Линниковой и Могилевского из расчета по 600 мл на 1 матрац. „. рН среды равен 6,9-7,1. Одну половину матрацев засевают штаммом Dt/st, а другую - штаммом Valu.. Выращивание микобактерий туберкулеза в этих матрацах производят при 38 С в течение

6-8 недель. В течение этого срока ежедневно посевы просматривают для выявления матрацев с ростом посторонней флоры, которые отбраковывают и обеззараживают, Матрацы с 6-8-недельными хорошо выросшими туберкулезными культурами помещают в оцинкованные ящики, в которых обеззараживают эти культуры автоклавированием текучим паром в течение 1 ч при 120 С..

Обеззараженные культуры смешивают ЗО поштаммно путем сливания их в 20литровые бутыли 1в равных объемах для каждого штамма). Для приготовле.ния фосфатидного антигена берут 1012 л смешанной культуры обоих штам- 35 мов.

Смешанную культуру фильтруют через асбестовые пластины для получения микробных клеток, которые затем . промывают 7 л дистиллированной воды 4р и 3 л ацетона.

После этого производят экстрагирование ацетонорастворииых компонентов путем обработки одного объема микробной массы двумя объемами ацетона при 38 С в течение 3 ч, по истечении которых ацетон сливают °

Данную операцию проводят дважды.

Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 л метанола на 50 г клеток и помещают на шуттель-аппарат в термостат при

37.С, осуществляя встряхивание реакционной смеси в течение 5 ч. Осадок отделяют центрифугированием при факторе разделения F = 1500 в течение 20 мин, после чего производят повторное экстрагирование метанолом при тех же условиях.

Метаноловые экстракты первого и второго извлечений объединяют и выпаривают в вакуум-сушильном шкафу при 0,7 кгс/см и 50 С в течение 5 ч. За это время происходит упаривание раствора до 1/3 от первоначального объема, что достаточно 65 для выпадения осадка фосфатидного антигена без соосаждения примесей.

Осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием при указанном режиме, затем промывают ацетоном при 40"С, вновь центрифугируют и растворяют в хлороформе из расчета на один объем использованного метанола 0,1 объема хлороформа. К хлороформенному раствору фосфатидного антигена добавляют двойной объем предварительно охлажденного до +4ОС ацетона. Выпавший осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием при том же режиме, промывают 3 раза ацетоном и высушивают. в вакуум-эксикаторе при комнатной температуре в течение 48 ч.

Выход сухого фосфатидного антигена составляет 2-2,5 г из 50 г микробных клеток.

Фосфатидный антиген )расфасосывают в ампулы по 10 мг и запаивают последние под азотом. Установлено, что в таком виде фосфатидный антиген может храниться 5 лет.

Для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана взятую из ампулы навеску фосфатидного антигена е,0 мг растворяют в 3,0 мл метанола. Этот раствор добавляют по каплям к 12 мп 0,85%-ного изотонического раствора хлористого натрия, после чего производят выпаривание метанола на магнитной мешалке при

50ОС до первоначального объема физраствора (т.е. до 12 мп ).

Полученные 12 мл фосфатидной эмульсии соединяют с 12 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов при постоянном перемешивании. При этом концентрация фосфатидного антигена составляет 0,5 мг на 1 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов (барана). Приготовленную смесь выдерживают 1 ч в водяной бане при

37 С и при постоянном перемешивании.

Затем производят центрифугчрование взвеси при факторе разделения F =

2000, после чего осадок дважды отмывают от избытка антигена физраствором рН 7,0-7,2.

Из осадка отмытых сенсибилизированных эритроцитов приготавливают

104-ную взвесь добавлением 12 мл защитной среды следующего состава:

Мясопептонный бульон, об.%- 25

Сахароза, вес.Ъ 5

Боратно-янтарный буфер Остальное

Полученный жидкий препарат эрнтроцитарного туберкулезного диагностикума разливают по 1,0 мл в ампулы и замораживают до -70 С, после чего препарат лиофилизируют °

При указанном соотношении ингредиентов получают 12 ампул сухого

1069783 агностики туберкулеза применяют, как правило, туберкулин, наиболее принципиальным является сравнение эффективности использования полученного препарата с туберкулином. Данные для сравнительного анализа приведены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты серологических реакций по основным группам обследования

Группы обследованных

РНГА с применением эритроцитарного туб. ди агности кума

Обследо- Полоиитель вано ная реакчеловек ция, Ъ

Доверительный интервал

Больныеактивным туберкулезом легких

68,72 61,99- 658

74,91

54,7962,45

211

58,66

Больные с за, тихающим туберкулезом легких

45,7560,95

53,41

16,68- 176

51,37

32,. 26

Нетуберкулезные больные

8,12

160

4, 3913, 49

4,1122,24

10,91

Здоровые люди

6, 32.

19,03

11,60

6,33- 112

21 03

12,36

22". Достоверность различия в сопоставляемых группах обследованных не ниже 5В-ного уровня значимости. В то же время обнаружение антифосфатидных антител (что возможно с применением нового препарата) соответственно в основном активному туберкулезному процессу, в чем и состоит преимущество получаемого диагностикума перед туберкулином. !

Эри троци т арный туб ер куле з ный диагностикум применяют в PHlA, тогда как препарат, получаемый известным способом; используют в реакции каолиновой агглютинации. Соответствующие данные приведены в табл. 4 ° эритроцитарного туберкулезного диагностикума с титром в РНГА с иммунной кроличьей сывороткой 1г128.

Впервые в мировой практике получен эритроцитарный туберкулезный диагностикум. Поскольку в настоящее время в клинической практике для диКак видно из табл. 3, всего обследовано с применением получаемого предлагаемым способом препарата

386 чел., а с йрименением туберкули- 45 на 1106 чел. При этом РНГА с туберкулином ставили по методу Бойдена., Среди обследованных больных туберкулезом легких преобладали наиболее труцно диагностируемые клинические

Формы: диссеминированный, инфильтративный и оЧаговый туберкулез. Среди нетуберкулеэных больных преобладали ,больные с пневмониями, которые имеют дифференциальное значение при диагностике туберкулеза легких. 55

Математическую обработку данных таблицы производили на ЭЦВМ "МинскРНГА с применением туберкулина

Обследо- Положитель Доверивано ная реак- тельный человек ция, % интервал

1069783

Таблица 4

Диагностика туберкулеза постановкой РНГА с эритроцитарным диагностикумом и PKA по методу Такахаши

Группы обследованных

Положительная реакция, Ъ

vsse

РНГА

Боль ные а кти в ным ту 6ер кулезогл легких

68,7

70,2

Больные с затихающим туберкулезом легких

36,8

36,9

Нетуберкулеэные больные

24,2

10 Г9

Содержание антигена, Ъ

Предлагаемый способ

Прототип

Среднее значение

2,2

2,88

2,7, 2,9, 2,7, 2,8, 2,8, 2,9

55

ВНЫИПИ Заказ 11599/8 Тираж 688 Подписное

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул.Проектная,4

Как видна иэ табл. 4, при близкой вероятности диагностирования туберкулезной инфекции полученный препарат более чем в 2 раза реже дает положительную реакцию при обследовании больных с нетуберкулезными заболеваниями.

В табл. 5 представлены сведения об активности получаемого предлагаемым способом промежуточного продукРезультаты отдельных испытаний

Как видно из табл. 5, содержание фосфора в фосфатидном антигене увеличилось по сравнению с прототипом на 243.

Использование предлагаемого спо.соба позволит организовать беэотходную технологию получения препаратов микобактерий туберкулеза.

Промежуточный продукт (фосфатидный антиген) получают из микробной массы микобактерий туберкулеза, считавшейся ранее отходом производства туберкулина, поскольку туберкулин та — фосфатидного антигена. Об активности .фосфатидного антигена можно судить по содержанию фосфора в препарате выделенного антигена. Содержание фосфора в полученном антигене определяли по методу Чена.

В табл. 5 приведено содержание фосфора в препаратах фосфатидного антигена, полученного известным и предлагаемым способами.

Таблица 5 выделяют из соответствующей культуральной жидкости. Реальность осуществления беэотходной технологии подтверждается тем, что эритроцитарный туберкулезный диагностикум намечено выпускать на предприятии по производству бакпрепараФов Ленинградского НИИ вакцин и сывороток, кото.рое является также и основный производителем туберкулина.

Срок хранения предлагаемого препарата достигает трех лет, тогда как известный хранится лишь 1 год.